Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek voor het karakteriseren van membraantransporters is dat u de relatieve affiniteit van de transporter voor specifieke substraten bepalen en inzicht krijgt in het transportmechanisme. De karakterisering van membraaneiwitten die eiwitgradiënten gebruiken om substraattransport te stimuleren, is bijzonder geschikt voor deze binnenste vesicletest die we hier laten zien. Hoewel deze test vereist een aantal gespecialiseerde apparatuur, zoals een Franse pers en toegang tot een ultracentrifuge, we denken dat het technisch gemakkelijker dan testen die membraan transporters vereisen worden gereconstrueerd in kunstmatige liposomen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de relatieve affiniteiten voor verschillende substraten te kwantificeren en concurrentietesten te doen om het effect van concurrerende substraten op transportroosters te testen. In het geval van de BAT1 transporter die werd gebruikt om deze test te illustreren, konden we ook substraatactivering van de transporter door arginine laten zien. Om te beginnen met deze procedure, cultuur de voorbereide E.coli mutant cellen die het doel eiwit uit te drukken door het inenten van een enkele kolonie in vijf milliliter polyamine 3 media met de juiste antibiotica en groeien het 's nachts op 37 graden Celsius.

De volgende dag, breng deze cultuur naar 500 milliliter verse polyamine 3 media die wordt aangevuld met 0,0002%arabinose en groeien tot de celcultuur een OD600 van tussen 0,6 en 0,8 bereikt. Na deze, centrifugeren op 2000 keer G en op vier graden Celsius gedurende 15 minuten om de cel pellet te verzamelen. Schort de pellet opnieuw op en was deze drie keer met buffer één door telkens op 2000 g en telkens 15 minuten op vier graden Celsius te centen.

Het uiteindelijke volume van cellen in Buffer een na de derde spin moet 10 milliliter. Stel een 35 milliliter Franse drukcel en giet de cel suspensie in het lichaam van de cel. Zet de machine aan met de schakelaar op de RHS aan de achterkant van het apparaat en stel de verhoudingskiezerschakelaar in op hoog.

Zet de pompschakelaar aan. De zuiger zal beginnen te stijgen van de basis om de lucht te verplaatsen in de kamer. Verhoog de druk door de drukverhogingsklep met de klok mee te draaien tot de meter 640 PSI bereikt.

Dit zal leiden tot een interne druk van 10.000 PSI. Zodra de cel de doeldruk heeft bereikt, opent u de montage van de stroomklep iets door deze tegen de klok in te draaien. Pas de opening van de klep aan om een stroomsnelheid van slechts ongeveer 10 druppels per minuut mogelijk te maken.

Wanneer de stoplijn op het zuigerlichaam de bovenkant van de stroomcel bereikt, schakelt u de pomp uit. Verlaag de onderste plaat door het plaatsen van de verhouding selector schakelaar naar beneden, en vervolgens, het instellen van de pomp schakelaar op. Wanneer de bodemplaat volledig is ingetrokken, verlaagt u de systeemdruk tot nul door de drukverhogingsklep volledig tegen de klok in te draaien.

Schakel de pomp uit en zet de machine uit. Centrifuge de Franse pers eluant op 10.000 keer G en op vier graden Celsius gedurende 15 minuten om ongebroken cellen en celpuin te verwijderen. Gooi de pellet weg en breng de supernatant over op ultracentrifugebuizen.

Ultracentrifuge de resulterende supernatant op 150.000 keer G en op vier graden Celsius gedurende een uur om de membraanvegels te pelleteren. Was de membraanveikels eenmaal zonder hersuspensie in buffer twee. Gebruik vervolgens een Dounce-weefselmolen om de membraanveikels opnieuw op te schorten in buffer twee.

Bereid 100 microliter aliquots van de membraanpreparaten in 1,5 milliliter centrifugebuizen en bewaar ze bij min-80 Celsius. Eerst de vesicles wassen en opnieuw ophangen in 30 millimolar Tris bij pH 7.8, dat 0,1 millimolar kobalt II chloride bevat. Voeg een microliter van carboxypeptidase A in natriumchloride, Tris, en kobalt II chloride aan elk 100 microliter monster.

Incubeer bij 20 graden Celsius gedurende 20 minuten. Voeg vijf microliter van een oplossing toe die natriumedta en 2-Mercaptoethanol bij PH 7.5 bevat om de spijsvertering te stoppen. Broed de oplossing een uur lang bij kamertemperatuur om het enzym volledig te inactiveren.

Voeg vervolgens tussen de vijf en 10 microliter van een oplossing toe die lithium dodecylsulfaat, glycerol, bromofenolblauw en Tris bij pH 7,5 tot 100 microliter van het monster bevat en analyseer monsters door elektroforese. Om amino blotting uit te voeren, leg een nitrocellulosefilter bevochtigd met 25 millimolar natriumwaterstoffosfaat op de polyacrylamidegel. Plaats deze tussen twee bevochtigde cellulosefilters en tot slot tussen twee bevochtigde plastic schuursponsjes.

Plaats deze assemblage tussen de elektroden van een kamer met 25 millimolar natriumwaterstoffosfaat bij een temperatuur tussen de twee en vier graden Celsius. Elektrotransfer van de eiwitten op 20 volt en op twee tot drie ampère gedurende drie uur. Blokkeer het nitrocellulosemembraan in het blokkeren van buffer 's nachts op twee graden Celsius.

De volgende dag, incubeer de nitrocellulose op 20 milliliter van een tot 5, 000 verdunning van Anti-His C-terminal HRP antilichaam en blokkeren buffer gedurende twee uur en wassen twee keer met 50 milliliter buffer gedurende een totaal van 60 minuten. Om de aminovlek te visualiseren, los zes milligram 4-Chloro-1-naphthol op in 20 milliliter gedenatureerde alcohol en voeg 80 milliliter van 15 millimolar Tris en 50 microliter van 30% waterstofperoxide toe. Baad het filterpapier in deze substraatoplossing gedurende 20 minuten.

Als er voldoende kleur is ontwikkeld, spoel het membraan met water en laat het drogen. Om te beginnen, incubeer de 100 microliter aliquot van membraan vesikels op 12 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg buffer 3 met radioactief gelabelde polyamines met een uiteindelijke concentratie van 50 micromolar toe aan de membraanveikjes in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen om transport te starten.

Voer de transporttest uit bij 12 graden Celsius gedurende een minuut. Breng hierna de reactiemengsels over naar het filterspruitstuk en filtreer deze door een 0,45 micrometer nitrocellulosemembraanfilter. Voeg drie milliliter ijskoude testbuffer toe met een tienvoudige hogere concentratie niet-gelabelde polyamines, gevolgd door drie milliliter testbuffer zonder de polyamines om niet-specifieke binding te verminderen.

Breng de gewassen filters naar 20 milliliter wegwerp scintillation flacons met 10 milliliter scintillatie vloeistof, en gebruik een vloeibare scintillatie teller om de radioactiviteit te bepalen. Bereken de netto polyamineopname zoals beschreven in het tekstprotocol. Bepaal de km voor het substraat door de opname van radioactief gelabeld substraat te meten in vesicles die het doeleiwit uitdrukken en bereken de Michaelis-Menten kinetiek met behulp van een niet-lineaire regressiemethode.

Voeg voor de wedstrijdexperimenten het niet-gelabelde concurrerende substraat dat in de testbuffer is gemaakt, toe aan de centrifugebuis met 100 microliter vesicles bij 12 graden Celsius en voeg tegelijkertijd 50 micromolar van de radioactief gelabelde polyamine toe. Meet de radioactiviteit gevangen in vesicles zoals eerder beschreven. Bepaal een ouder-KM voor de concurrerende substraten door de opname van radioactief gelabelde polyamines en de aanwezigheid van 100 micromoer of hoger niet-gelabeld substraat te meten en gebruik een niet-lineaire regressiemethode om de curve in kaart te brengen.

In deze studie wordt een anti-porter gekenmerkt door eerst het eiwit in E.coli uit te drukken, en vervolgens membraanveikles te genereren, zodat het heterologously-uitgedrukte eiwit kan worden getesteerd in een celvrij systeem. Een westelijke vlek wordt gebruikt om te controleren of AtBAT1 is overgemaakt naar blaasje. Indringende de vlek met een Anti-His C-terminal antilichaam bleek een fusie constructie eiwit dat is ongeveer 72,3 kilodaltons.

Vertering van de vesicles voorafgaand aan SDS-PAGE resulteerde in een vermindering, maar niet een volledig verlies van de sonde signaal. Bij 12 graden Celsius, opname van een radiolabel spermidine door de eitjes is het hoogst op een minuut en bleef lineair gedurende drie minuten. Daarom wordt de incubatietijd voor de transporttest op één minuut vastgesteld.

Na een minuut is er geen netto opname van isotoop door membraanveikels die werden bereid en opgeslagen bij pH 8.0 omdat er geen protongradiënt is over het blaasmembraan. Om het effect van de afvoer van de kunstmatige protongradiënt aan te tonen, worden de membraanvegelsicles gedurende 10 minuten in pH 8.0-buffer geïncubeerd, wat leidt tot een minimale opname van radioactief gelabeld substraat. Samen wijzen deze resultaten erop dat de proton-gedreven opname van spermidine te wijten is aan het BAT1-eiwit.

Om de substraatspecificiteit van het eiwit te bepalen, worden km-waarden berekend door de opname van radioactief gelabeld substraat bij verschillende concentraties te meten. De Km-waarden voor spermidine, putrescine en arginine geven aan dat dit eiwit een polyamine met hoge affiniteit en arginine-wisselaar is. Affiniteit van de transporter voor een bepaald substraat kan ook indirect worden bepaald door gebruik te maken van concurrentietesten.

Deze tests blijkt dat GABA is een concurrerende remmer van spermidine. Bovendien blijkt uit het meten van de opname van 50 micromolar radioactief gelabelde spermidine in aanwezigheid van verschillende concentraties van verschillende aminozuren dat AtBAT1 ook glutamaat en alanine kan vervoeren bij millimolarconcentraties. Bij het uitvoeren van deze procedure is de integratie van de membraantransporter in het bacteriële membraan uiteraard van cruciaal belang.

Verificatie dat het eiwit van belang is geïntegreerd in het membraan kan worden gedaan met behulp van antilichamen gericht tegen de C-terminal tags. Genetische variatie van menselijke vervoerders kan het transport beïnvloeden van zowel metabolieten als geneesmiddelen die substraten van de specifieke vervoerder zijn. Zo kan allelic variatie invloed hebben op zowel de opname en uitscheiding van drugs.

Veel allelic varianten kunnen snel worden gemaakt door side-directed mutagenesis van het transporter gen in een expressie vector. Functionele testen van deze varianten kunnen vervolgens worden getest onder zeer gecontroleerde omstandigheden met behulp van inside-out vesicle tests. Membraantransporters vormen acht tot tien van alle eiwitten en de meerderheid is niet volledig gekarakteriseerd in een van de modelorganismen.

Transporters die gelokaliseerd zijn op organellemembranen zijn bijzonder uitdagend om te karakteriseren door heterologe expressie in eukaryotische cellen. Als uitwisselingstype of protongemedieerde transporters kunnen worden gelokaliseerd op dit E.coli membraan, kunnen deze transporters functioneel worden gekarakteriseerd met behulp van deze in vitro assay. De kwaliteit en opbrengst van vesicles wordt beïnvloed door de snelheid van elutie van celfragmenten uit de Franse pers.

Bij het doen van transporttesten van vesicles met isotopen, is het belangrijk om een experimentele setup te hebben die het doen van experimentele replica's vergemakkelijkt. Er zijn vele manieren om dit te doen, maar we denken dat het nuttig zal zijn voor ons om u te laten zien hoe we het hebben gedaan.