Verwerking van embryo-, eierschaal-en schimmel cultuur voor het scannen van elektronenmicroscopie

We hebben gestandaardiseerde monsterpreparaatatieprotocollen voor beeldvorming geschilderde schildpadembryo's, stijve eierschalen en schimmelculturen met behulp van scanning elektronenmicroscopie. Deze uitgebreide methoden maken gebruik van subtiele wijzigingen in bekende protocollen om drie delicate weefsels te verwerken waardoor de differentiatie tussen de oorspronkelijke structuren en de verwerking van de artefacten. Het aantonen van de procedure met mij zal Jessica Gibbons, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.

Voordat je schildpadeieren verzamelt van een veldplaats tijdens het broedseizoen, maak je vier tot zes gaten van 0,25 centimeter langs de zijkanten van plastic dozen en op hun deksels om beademing mogelijk te maken. Voor het vullen van de dozen met een vochtig mengsel van vermiculiet en veenmos beddengoed mengsel op een een-op-een verhouding. Verwijder op de broedplaats voorzichtig de grond om de eieren te ontdekken en veeg het oppervlak van elk schildpadei af met een verdunde jodiumtinct om te beschermen tegen microbiële besmetting tijdens incubatie.

Plaats maximaal acht tot negen eieren per doos in dezelfde oriëntatie en uitlijning als ze werden gelegd, waardoor individuele koppelingen gescheiden van elkaar. Wanneer alle eieren zijn verzameld, begraaf de eieren handmatig de helft in het beddengoed en plaatst u de dekseldozen gedurende 10 tot 17 dagen in een couveuse van 30 graden Celsius om embryonale stadia respectievelijk 12, 13 en 18 embryo's te verkrijgen. Voeg gedestilleerd water om de andere dag gedeeltelijk nat om uitdroging om uitdroging te voorkomen en om het vochtgehalte voor een normale embryoontwikkeling te handhaven.

Gebruik in het juiste ontwikkelingsstadium een puntige schaar om een snede op één kant van de dorsale eierschaal en dooiermembraan samen te maken, verticaal tot de lange as van het ei. Snijd vervolgens de andere kant van het ei langs de korte as en gebruik tangen om het uitgesneden stuk met de embryozijde naar boven te schillen. Snijd de andere zijdelingse kant van de eierschaal en plaats het uitgesneden stuk schelp in PBS.

Pel met behulp van een stereomicroscoop en tangen het embryo en het dooiermembraan uit de eierschaal. Gebruik de tang en microschaar om de extra embryonale membranen te verwijderen en gebruik een embryolepel om het embryo over te brengen in een petrischaaltje met verse PBS. Na het wegwassen van bloed en dooier, plaats tot drie embryo's per put van een 12-put plaat, met 4% paraformaldehyde op vier graden Celsius gedurende twee tot drie dagen.

Wanneer de monsters wit lijken, gebruik polystyreen inserts met polyester mesh bodems om de embryo's te spoelen met drie vijf minuten wasbeurten in verse PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt dehydrateren monsters in een opgaande ethanolserie gedurende een uur per concentratie. Na de tweede ethanolonderdompeling, droog de embryo's in een reeks van HMDS tot ethanol concentraties gedurende 20 minuten per onderdompeling met de petrischaaltjes gedeeltelijk bedekt.

Plaats de embryo's vervolgens in een laatste 100%HMDS-oplossing, die 's nachts geheel of gedeeltelijk bedekt is met een rookkap. Langzaam drogen door de concentratie van HDMS geleidelijk te verhogen tot ethanol is belangrijk voor het onthullen van een uitstekende oppervlaktestructuur in de embryo's. De volgende ochtend, gebruik dubbele stok carbon geleidende tape om zorgvuldig monteren van de volledig gedroogde monsters op een standaard aluminium pin stomp.

Wanneer alle monsters zijn gemonteerd, introduceren de monsters in de sputter coater kamer om de monsters te coaten met een zeer dunne film van goud voor 60 tot 120 seconden op een 35 milliamp sputter. Bevestig vervolgens de ingestelde schroeven stevig om de stompen op de bijbehorende gietplaten te monteren. Gebruik het gereedschap voor de uitwisseling van monsters om de monsterhouder over te brengen naar de monsterkamer van de scanning elektronenmicroscoop voor beeldvorming.

Om eierschalen voor te bereiden op het scannen van elektronenmicroscopie, plaatst u de eierschalen ten minste één uur na de embryooogst in gedestilleerd water om een dooier of albuminebesmetting te elimineren. Vervolgens drogen de gereinigde eierschalen op delicate antistatische doekjes in de rookkap 's nachts. Bewaar de gedroogde eierschalen in schone flessen, gelabeld op nummer en embryostadium.

Dan, mount, sputter vacht en beeld van de eierschaal exemplaren zoals net aangetoond voor de embryo's. Om dia schimmelculturen vast te stellen, gebruik een steriele scalpel te snijden half tot drie kwart inch blokken van vaste aardappel dextrose agar, en plaats de blokken op individuele glazen microscoop dia's. Plaats steriele tandenstokers op de bodem van schone petrischaaltjes voor het verhogen van dia's van hen om oppervlaktespanning tussen de plaat en de dia te creëren.

Plaats elke dia op de tandenstokers in de petrischaal. Gebruik vervolgens een steriele lus om schimmels van het monster entmateriaal over te brengen naar elk van de vier zijdelingse zijden van een agarblok. Voeg een paar druppels steriel gedestilleerd water toe aan de petrischaal rond de glijbaan om vocht voor de groeiende schimmels te garanderen.

Verzegel de plaat gedeeltelijk met paraffinefolie en plaats de plaat in de 30 graden Celsius incubator voor de juiste incubatietijd voor de schimmelsoorten. Verwijder aan het einde van de incubatie de glijbaan van de petrischaal en gebruik steriele tangen om het strak aangehangen agarblok van de glijbaan naar een container van 3% glutaraldehyde over te brengen voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend dehydrateren de monsters in een opgaande ethanol serie gedurende 15 minuten per concentratie.

Na de 90%-onderdompeling verwerkt u de monsters voor definitieve uitdroging met twee veranderingen van 30 minuten in 100% ethanol om een volledige verzadiging te garanderen voordat de uitgedroogde monsters in de kamer van het kritieke puntdroogapparaat worden geplaatst. Sluit de kamer af en open de kleppen om vloeibare kooldioxide binnen te laten ontluchten en om de ethanol eruit te laten ontluchten totdat vloeibare kooldioxide de kamer volledig vult. Vervolgens verzegelen en langzaam verwarmen van de kamer om een kritiek punt te bereiken wanneer de kamerdruk meer dan 1.000 pond druk per vierkante inch, de temperatuur hoger is dan 31 graden Celsius, en de vloeistof en gas ruimte van kooldioxide is in evenwicht.

Dan langzaam afvoer van de kooldioxide uit de kamer en het monster als een gas, om eventuele effecten van oppervlaktespanning op het monster te voorkomen, en monteren, plaat, en beeld de schimmelmonsters zoals aangetoond. Een laterale scanning elektronenmicrograaf weergave van een stadium 12 geschilderde schildpad embryo laat zien hoe de maxillaire bekendheid reikt dan de mandibulaire en mediaal beperkt een goed gemarkeerde neusput. Vijf faryngeale bogen kunnen ook worden waargenomen.

In een stadium 15 embryo, nieuw gevormde somites zijn zichtbaar op het achterste staartgebied van het embryo, en de voorpoot knoppen punt meer cortally dan ventrally. Een goed gedefinieerde uitgroei van een carapace ridge kan ook worden gevisualiseerd langs de gehele interlimb flank regio van het embryo. In fase 18, een korte feebly projecterende snuit heeft gevormd met een iets omgekeerde onderste snavel met een terminale haak die past in de centrale inkeping van de bovenste snavel.

De bovenkaak vertoont een ingekerfd uiterlijk, en een kleine ei tand kan worden gezien vormen op het puntje van de bovenkaak. Ultrastructurele analyse van de Chrysemys picta eierschaal en shell membraan door het scannen van elektronenmicroscopie, onthult een buitenste calcarinus eierschaal laag, stevig bevestigd aan de binnenste filamenteuze shell membraan. Het buitenoppervlak van de eierschaal bestaat uit goed onderscheiden gemineraliseerde schelpeenheden gemaakt van bolvormige bolvormige knobbeltjes die in groepen en tussen aangrenzende schelpeenheden zijn gerangschikt, met een concentratie van kleine afgeronde depressies of poriën van verschillende groottes.

Gemeenschappelijke methoden kunnen niet worden gegeneraliseerd voor alle biologische specimens om een fatsoenlijke beeldkwaliteit te bereiken met behulp van SEM. Unieke veranderingen zoals aangetoond zijn essentieel voor een specifieke weefseltypes. De chemische en luchtdrogen methode kan ook worden gebruikt voor andere organische monsters, en de koppeling dia cultuur techniek kan worden gebruikt voor alle zachte, robuuste microbiële culturen.