Name: Ontwerp, synthese en fotochemische eigenschappen van aanklikbare gekooide verbindingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Ontdek de synthese van klikbare gekooide verbindingen met extra eigenschappen zoals wateroplosbaarheid en celdoelgerichtheid. Deze methode behoudt de fotosensitiviteit voor toepassingen in de neurowetenschap.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number JP16H01282 (TF), een subsidie-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek naar innovatieve gebieden "Memory dynamisme" en JP19H05778 (TF), "MolMovies."

1. synthese van de modulaire kooien pabhc-groep voor aanklikbare gekooide verbindingen28,41
<ol><li>
Bereiding van (6-Broom-7-hydroxycumarine-4-yl) methylchloride (BHC-CH2cl)
	<ol>
<li>Plaats 4-bromoresorcinol (9,742 g, 51,5 mmol) in een rondbodemkolf van 100 mL voorzien van een roerder.</li>
		<li>Voeg conc. H2, dus4 (98%, 30 ml) toe aan de kolf en roer het mengsel om te ontbinden.</li>
		<li>Voeg ethyl 4-chloroacetoacetaat (10 mL, 74 mmol) dropwise toe.</li>
		<li>Blijf het mengsel gedurende 5 dagen bij omgevingstemperatuur roeren.</li>
		<li>Plaats de gemalen ijsblokjes (~ 200 mL) apart in een erlenmeyer van 500 mL.</li>
		<li>Giet het reactiemengsel in het ijs en roer 30 minuten krachtig totdat er een fijn gepoederd precipitaat wordt verkregen.</li>
		<li>Vang het precipitaat op via vacuümfiltratie. Was het licht bruin precipitaat met water vijf keer.</li>
		<li>Droog het precipitaat onder vacuüm 's nachts om BhcCH2cl te leveren als licht bruin poeder (13,57 g, 46,9 mmol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van (6-Broom-7-hydroxycumarine-4-yl) methanol (BhcCH2Oh)
	<ol>
<li>Plaats de bereide BhcCH2Cl (1,1440 g, 3,95 mmol) en 1 M HCl (300 ml) in een rondbodemkolf van 1 L, uitgerust met een Dimroth-condensor. Roer het mengsel gedurende 5 dagen bij 140 °C. Laat het mengsel na deze tijd afkoelen tot de omgevingstemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het water uit de reactie door roterende verdamping onder vacuüm om BhcCH2Oh (1) te leveren als een licht bruin poeder (1,0359 g, 3,82 mmol, 97% opbrengst). Opmerking: het gebruik van 250 mL van 1 M HCl per 1 g BhcCH2cl geeft een bevredigend resultaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van paBhcCH2Oh (2) via de mannich-reactie
	<ol>
<li>Plaats Paraformaldehyde (446,4 mg, 14,9 mmol) in een rondbodemkolf van 50 mL. Voeg watervrij ethanol (5 mL) en N-methylpropargylamine (1,25 mL, 14,8 mmol) toe aan de kolf.</li>
		<li>Roer het mengsel bij omgevingstemperatuur gedurende 1 uur onder een AR-atmosfeer.</li>
		<li>Voeg BhcCH2Oh (1) (1,367 g, 5,04 mmol) toe aan de kolf. Verwarm het mengsel tot 80 °C met een blok verwarmer apparaat en roer het mengsel gedurende 2 uur bij 80 °C in een AR-atmosfeer.</li>
		<li>Stop de blok verwarmer en laat het reactiemengsel afkoelen tot kamertemperatuur.</li>
		<li>Verzamel het resulterende licht bruin-geel precipitaat door vacuümfiltratie. Was het precipitaat tweemaal met een kleine hoeveelheid watervrij ethanol (1 mL elke keer).</li>
		<li>Verwijder de overtollige ethanol onder vacuüm naar opbrengst paBhcCH2Oh (2) (1,393 g, 3,96 mmol).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van klikbare gekooide verbindingen
Opmerking: de volgende procedures kunnen worden toegepast op de bereiding van andere klikbare gekooide verbindingen die hydroxyl, amino en carboxylaat functionele groepen bevatten.
<ol><li>
Algemene procedure 1: voorbereiding van een klikbare gekooide amine
	<ol>
<li>Plaats paBhcCH2Oh (2) (709,6 mg, 2,02 mmol) en n,n '-carbonyl diimidazol (CDI, 397,6 mg, 2,45 mmol) in een 30 ml rondbodemkolf. Voeg Dry CH2cl2 (6 ml) toe en roer de oplossing gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur.</li>
		<li>Voeg 4-dimethylaminopyridine (4-DMAP, 324,8 mg, 2,66 mmol) en tert-butyl (6-aminohexyl) carbamaat (533,1 mg, 2,46 mmol). Roer de oplossing bij omgevingstemperatuur gedurende 3 uur.</li>
		<li>Verwijder het oplosmiddel en andere vluchtige materialen met behulp van een roterende verdamper onder vacuüm. Reinig het residu rechtstreeks met behulp van silicagel Flash column chromatografie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Algemene procedure 2: voorbereiding van een klikbare gekooide alcohol
	<ol>
<li>Plaats paclitaxel (PTX, 48,7 mg, 0,057 mmol) in een rondbodemkolf van 30 ml uitgerust met een drie-weg kraantje en een AR-ballon. Voeg Dry CH2cl2 (1 ml), 4-dmap (17,1 mg, 0,14 mmol) en 4-nitrofenyl chloroformaat (26,0 mg, 0,13 mmol) toe.</li>
		<li>Roer de oplossing bij omgevingstemperatuur voor 2,5 uur onder een AR-atmosfeer.</li>
		<li>Voeg 4-DMAP (15,7 mg, 0,13 mmol) en paBhcCH2Oh (2) (39,1 mg, 0,111 mmol) aan de oplossing. Blijf het mengsel bij omgevingstemperatuur gedurende 17 uur roeren.</li>
		<li>Voeg CHCl3 (10 ml) en 15% waterige NaHCO3 (5 ml) toe aan het mengsel. Roer het mengsel krachtig gedurende ongeveer 3 min. Verwijder de waterige laag met een pipet.</li>
		<li>Voeg 0,5 M citroenzuur (5 mL) toe aan de kolf die de organische laag bevat. Roer het mengsel en verwijder de waterige laag zoals hierboven.</li>
		<li>Scheid de organische laag met behulp van een fase scheidings kolom. Verwijder de oplosmiddelen met een roterende verdamper onder vacuüm. Reinig het product met behulp van standaard silicagel-flits Kolomchromatografie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Algemene procedure 3: voorbereiding van een klikbare gekooide carboxylzuur
	<ol>
<li>Los arachidonzuur (33,0 μL, 0,100 mmol), paBhcCH2Oh (2) (39,6 mg, 0,112 mmol) en 4-dmap (14,1 mg, 0,115 MMOL) in droge l2cl2 (2 ml). Voeg n,n'-diisopropylcarbodiimide (Dipc, 17,0 μL, 0,110 mmol) toe en roer de oplossing bij omgevingstemperatuur gedurende 140 min.</li>
		<li>Verwijder het oplosmiddel onder vacuüm. Reinig het residu rechtstreeks met behulp van silicagel Flash column chromatografie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. installatie van een functionele eenheid in de klikbare gekooide verbindingen
<ol><li>Los koper (II) sulfaat-pentahydraat (249 mg) in ion-uitgewisseld water (IEW, 10 mL) op om een 0,1 M CuSO4 -oplossing te geven.</li>
	<li>Los 2 '-paBhcmoc-PTX (8,0 mg, 6,5 μmol), Tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA, 17,5 mg, 40,3 μmol), natrium l-ascorbaat (162,4 mg, 0,825 mmol), en 15-Chloro-3, 6, 9-trioxapentadecyl natriumazide (3,1 mg, 11 μmol) in een gemengd oplosmiddel van 0,1 M fosfaat buffer (2,5 mL, pH 7,2) en dimethylsulfoxide (DMSO, 0,5 mL).</li>
	<li>Voeg de 0,1 M CuSO4 -oplossing (81,2 μL, 8,1 μmol) toe aan het reactiemengsel. Roer het mengsel bij omgevingstemperatuur gedurende 80 min. Bewaak de voortgang van de reactie met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).</li>
	<li>Los de precipitaten op door een 75% acetonitril/wateroplossing (3,5 mL) toe te voegen. Breng de resulterende oplossing rechtstreeks aan op het semi-preparatieve HPLC-systeem om het gewenste product te zuiveren. Opmerking: Solubilization van het reactiemengsel door toevoeging van tert-butanol kan de progressie van de reactie versnellen.</li>
</ol>4. fotolytische uncaging-reactie van de gekooide verbindingen
<ol><li>Voorbereiding van de stockoplossingen
	<ol>
<li>Los de gewenste gekooide verbinding (5 μmol) in DMSO (500 μL) op om een stockoplossing van 10 mM te bereiden. Breng een aliquot van elke oplossing (10 μL) in een micro centrifugebuis van 1,5 mL en bewaar deze in een vriezer (− 20 °C) tot vlak voor gebruik.</li>
		<li>6 mM K3[FE (C2O4)3] (100 ml): Los gerecrygekristalliseerd kalium ferrioxalaat (0,295 g, 0,675 mmol) op in 80 ml water. Voeg 0,5 M H2dus4 (10 ml) en een passende hoeveelheid IEW toe om het volume te maken tot 100 ml. Opmerking: kalium ferrioxalaat moet worden gezuiverd via herkristallisatie van heet water en opgeslagen in het donker. Gerecrgekristalliseerd kalium ferrioxalaat wordt verkregen als het Trihydraat; Daarom is de formule K3[FE (C2o4)3] · 3h2o en een formule gewicht van 491,24 moet worden overwogen tijdens de bereiding van de stamoplossing. Controleer de zuiverheid van de 6 mM-oplossing door de absorptie bij 510 Nm te meten. Als de extinctie < 0,02 is, is deze geschikt voor gebruik in het experiment.</li>
		<li>0,1% buffer-Phen (30 mL): ontbinden NaOAc · 3H2O (7,35 g), 1, 10-phenanthroline (Phen) · H2O (30 mg), en conc. H2dus4 (0,9 ml) in IEW (20 ml). Voeg IEW toe om het volume te maken tot 30 mL. Opmerking: de oplossing bevat 1,8 M NaOAc, 0,54 M H2so4en 0,1% 1, 10-phenanthroline.</li>
	</ol></li>
	<li>Meting van het aantal fotonen met ferrioxalaat actinometrie
	<ol>
<li>Plaats 6 mM K3[FE (C2O4)3] (V1 L) in een kwarts kuvette. Bestraleren de oplossing met 350 nm licht voor 5 sec.</li>
		<li>Breng de bestraalde oplossing over naar een Pyrex Cuvette met een l [cm] padlengte.</li>
		<li>Voeg 0,1% buffer-Phen (V2 L) toe aan de bestraalde monsteroplossing en meng goed door pipetten. Meet de extinctie van het monster bij 510 Nm. Bereken de gemiddelde absorptie verandering per tijdseenheid (ΔA510 [s− 1]).</li>
		<li>Bereken het aantal mollen van gegenereerde Fe2 + ionen per tijdseenheid volgens de volgende vergelijking: NFE2 + [mol s− 1] = ((V1 + V2) [l] × δa510 [s− 1])/(l [cm] × ε510 [l mol− 1 cm− 1]), waar (v1 + v2) het volume van het monster voor de absorptie meting is, l de optische weglengte van de cuvette, en ε510 de molaire absorptie van de FE2 +- Phen complex bij 510 Nm. Opmerking: in de typische experimentele omstandigheden zijn de waarden van v1 = 2,0 ×10 − 3 l, v2 = 0,33 × 10− 3 l, l = 1,0 cm, en ε510 = 1,1 × 104 L mol− 1 cm− 1 werden gebruikt.</li>
		<li>Bereken het aantal mollen van fotonen dat het monster bereikt (I0) met behulp van de volgende formule: I0 [Einstein cm− 2 s− 1] = NFE2 +/Φ350 waar Φ 350 de kwantum efficiëntie is van de fotoreductie van het ferrioxalaat bij 350 nm. Opmerking: Hoewel de kwantum efficiëntie van de kaliumferrioxalaatactinometer bij 350 nm niet wordt gerapporteerd, werd de gerapporteerde waarde van 1,2542 bij 358 nm gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>Kwantum efficiëntie metingen bij 350 nm
	<ol>
<li>Verdun de monster voorraadoplossing (in DMSO, 10 μL) met K-MOPS buffer (pH 7,2, 10 mL) om een 10 μM oplossing te geven in K-MOPS met 0,1% DMSO. NB: K-MOPS buffer bestond uit 100 mM KCl en 10 mM 3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur (Mops) getitreerd naar pH 7,2 met Koh.</li>
		<li>Breng een aliquot van de oplossing (V1 L) over in dezelfde Cuvette die wordt gebruikt in de fotororeactie van de chemische actinometer. Bestraleren de monsteroplossing met dezelfde instellingen als beschreven in stap 4.2.1.</li>
		<li>Verwijder periodiek een aliquot (50 μL) uit de bestraalde oplossing en analyseer met behulp van HPLC.</li>
		<li>Bepaal de doorstralings tijd in seconden, waarbij 90% van het uitgangsmateriaal reageerde (t90%) door het aanbrengen van plots van de tijdafhankelijke verdwijning van het uitgangsmateriaal. NB: de extinctie van het bestraalde monster moet op < 0.1 worden gehandhaafd, zodat de binnenfiltering van de straling kan worden verwaarloosd. Het is wenselijk dat de fotolytische consumptie van het uitgangsmateriaal kan worden benaderd door één-exponentieel verval, zodat er geen ongewenst secundair effect is dat het fotolysisproces verstoort.</li>
		<li>Bereken de kwantum opbrengst van verdwijning (ΦDIS) met behulp van de volgende vergelijking28: ΦDIS = 1/(t90% × I0 × σ350) waarbij t90% [s] de stralings tijd is waarin 90% van het uitgangsmateriaal werd verbruikt, I0 [Einstein cm− 2 s− 1] is het aantal mollen van fotonen en σ350 [cm 2 mol− 1] is de decadische extinctiecoëfficiënt van het monster bij 350 nm. Noot: σ350 [cm2 mol− 1] = 103ε350 [M− 1 cm− 1].</li>
	</ol></li>
</ol>5. targeting van een klikbare gekooide verbinding met een HaloTag ligand
Opmerking: onderhoud de HeLa-cellen in het gemodificeerde Eagle medium van Dulbecco (DMEM, low glucose, natriumpyruvate, l-glutamine), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) met 1% antibiotica (streptomycine sulfaat, penicillaire G en Amfotericine) bij 37 °C en 5% CO2.
<ol><li>Verwijder het medium en trypsinoseer de cellen door te behandelen met trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 1 mL) bij 37 °C gedurende 1 minuut. Voeg DMEM (4 mL) toe aan de cellen en onderbreek de cellen opnieuw door ze zachtjes te pipetteren. Zaad ongeveer 5 × 105 cellen per schotel in 35 mm glasbodem gerechten in DMEM (2 ml) 24 h voor Transfectie.</li>
	<li>Verdun voor vier gerechten in een micro centrifugebuis van 1,5 mL het plasmide DNA (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg) in het gereduceerde serum medium (700 μL). Verdun het lipofection-reagens (5 μL) in het gereduceerde serum medium (150 μL) afzonderlijk in elk van de vier buisjes en laat ze gedurende 5 minuten op de omgevingstemperatuur staan.</li>
	<li>Voeg een deel van het verdunde plasmide DNA (150 μL) toe aan elk van de verdunde lipofection-reagens monsters. Inincuberen bij omgevingstemperatuur gedurende 5 min.</li>
	<li>Na het onderhouden van de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur, aspireren de DMEM en spoel de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 2 ml). Voeg het verlaagde serum medium (1,5 mL) toe.</li>
	<li>Voeg het plasmide-lipofection reagens (150 μL) complex toe aan elk gerecht. Houd de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 48 h.</li>
	<li>Aspirate het medium, voeg een portie vers bereide DMEM (1 mL) met 2 μM paBhc-hex-FITC/Halo, en inbroed de cellen bij 37 ° c en 5% CO2 gedurende 30 min.</li>
	<li>Aspirate het medium dat de gekooide verbinding bevat en spoel de cellen tweemaal met PBS + (1 mL per spoeling) om ongebonden verbindingen te verwijderen. Voeg het verlaagde serum medium (500 μL) toe en inbroed de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 minuten om de verbindingen te verwijderen die de cellen hebben ingevoerd. Opmerking: PBS + is fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met 2 mM CaCl2 en 1 mm MgCl2.</li>
	<li>Verwijder het medium en spoel de cellen tweemaal af met PBS + (1 mL). Voeg een gedeelte van een medium (1 mL) toe dat geen fenolrood bevat. Neem fluorescentie beelden op door middel van laser scanning confocale fluorescentiemicroscopie.</li>
</ol>6. fotomediated modulatie van een kinase lokalisatie met behulp van een klikbare gekooide compound
Let op: voor gebruik, onderhoud de CHO-K1-cellen in Ham's F-12 medium aangevuld met 10% FBS bij 37 °C en 5% CO2.
<ol><li>Bereid een 100 × werkoplossing (1 mM) van paBhc-AA (5) in DMSO. Opmerking: een 10 mM stockoplossing van de verbinding wordt bereid en opgeslagen in een vriezer (-20 °C).</li>
	<li>Zaad ongeveer 5 × 105 cellen per schotel in 35 mm glasbodem gerechten in DMEM (2 ml) 24 h voor Transfectie.</li>
	<li>De CHO-K1-cellen worden getransfect met een plasmide codering voor GFP-DGKγ 48 h vóór de uncaging-experimenten. Opmerking: transfectie wordt uitgevoerd volgens de stappen 5.2 – 5.5.</li>
	<li>Vervang het medium door een verlaagd serum medium (2 mL). Voeg de 100 × paBhc-AA-oplossing (20 μL) toe en inincuberen de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor tussen 5 min en 1 uur. Opmerking: de laadtijd is afhankelijk van de gebruikte verbinding.</li>
	<li>Plaats de cellen op de objectieve fase van een omgekeerde fluorescerende Microscoop uitgerust met een dubbele lichtbron fluorescentie-illuminator.</li>
	<li>Neem een fluorescerende afbeelding elke 10 s. Bestralt de cellen met 330 – 385 nm licht door een Microscoop doelstelling gedurende een geschikte tijd. U de cellen ook met 405 nm licht bestreren met behulp van een XE lamp door middel van flexibele kwarts vezels.</li>
	<li>Ga door met het opnemen van fluorescerende beelden gedurende 10 minuten.</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

We ontwikkelden eerder BHC gekooide verbindingen van verschillende biologisch actieve moleculen die hoge fotolytische efficiënties vertonen28,45,46,47. Met als doel het uitbreiden van het repertoire van BHC kooien groepen, rapporteerden we ook platforms van modulaire gekooide verbindingen die gemakkelijk kunnen worden gewijzigd door de introductie van verschillende functionele eenheden32,40,41. Het huidige protocol vertegenwoordigt daarom een methode voor de synthese van een klikbare precursor van BHC kooien groepen die kan worden gewijzigd via de koper (I)-gekatalyseerde huisgen cyclisering. De synthese van de klikbare precursor, paBhcCH2Oh (2), werd bereikt via een vier stappen-reactie sequentie beginnend bij de in de handel verkrijgbare 4-bromoresorcinol (Figuur 1a). Het voordeel van dit protocol is dat er geen moeizame zuiveringsstappen nodig zijn (bijv. kolom chromatografische scheidingen).
Als klikbaar precursor paBhcCH2Oh (2) kan worden gebruikt om verschillende functionele groepen te maskeren, klikbaar gekooide verbindingen van amines, alcoholen, en carbonzuren werden gesynthetiseerd met behulp van 2 als de precursor (Figuur 1b). Amines werden gewijzigd als hun carbamaten terwijl alcoholen werden gemodificeerd als hun carbonaten. In algemene procedures 1 en 2 werd CDI gebruikt voor de bereiding van klikbare carbamaten, terwijl 4-nitrofenyl chloroformaat werd gebruikt voor de bereiding van carbonaten. Zoals aangegeven door het reactiemechanisme, kunnen beide reagentia worden gebruikt voor de bereiding van carbamaten en carbonaten. Er moet ook worden opgemerkt dat de opbrengst van de gewenste gekooide verbinding afhankelijk is van de chemische structuur van het molecuul dat moet worden gekooide. Andere voorbeelden zijn te zien in onze vorige rapporten28,30,33,48.
Klik op modificatie werd vervolgens uitgevoerd met een lichte wijziging van de gerapporteerde procedure49. De toevoeging van tris (triazolylmethyl) amine-gebaseerde liganden is noodzakelijk om de gewenste producten te verkrijgen in goede tot hoge opbrengsten. Aangezien een verscheidenheid van aziden gemakkelijk beschikbaar zijn zowel uit commerciële bronnen als uit literatuur procedures, kunnen we verschillende modulaire gekooide verbindingen met extra eigenschappen, zoals oplosbaarheid in water en cellulaire targeting vermogen (Figuur 2) voorbereiden.
De kwantum opbrengst van fotolyse werd vervolgens gemeten volgens een gerapporteerde procedure28,50. Figuur 3 toont aan dat de fotolytische consumptie van 2 'glc-paBhcmoc-PTX en de vrijlating van PTX werden benaderd door single-exponentiële verval en stijging, respectievelijk, suggereren geen innerlijke filtering van de straling of ongewenste secundaire effecten. Er werden verbeterde fotolyse kwantum opbrengsten (Φ) en fotolysisefficiënties (εφ) waargenomen voor de klikbare pabhc gekooide verbindingen in vergelijking met die van de eerder gerapporteerde BHC gekooide verbindingen (tabel 1)41, 43. aangezien de efficiëntie van fotolyse (εφ) van BHC gekooide verbindingen meer dan 100 maal hoger is dan die van 2-nitrobenzyl-type gekooide verbindingen48, is de duidelijke verbetering als gevolg van de aanwezigheid van pabhc kooien groepen duidelijk een voordeel voor dit systeem.
Als proof-of-concept-experiment werd een hydrofiele groep geïntroduceerd in 2-paBhcmoc-PTX (4) en een cellulaire targeting ligand werd geïntroduceerd in Compound 3 (Figuur 2). De oplosbaarheid in water van 2 'glc-paBhcmoc-PTX was 650 maal hoger dan die van de ouder PTX (tabel 1). Selectieve cellulaire targeting werd bereikt met behulp van een tag-probe-systeem, en paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) met het halotag ligand werd met succes getarget op het celmembraan van gekweekte zoogdiercellen die het halotag/EGFR-fusie-eiwit uitdrukken ( Figuur 4). Foto-gemedieerde modulatie van de subcellulaire lokalisatie van een kinase werd ook bereikt met behulp van een klikbare gekooide compound 5 (Figuur 5).
Concluderend hebben we met succes een methode gedemonstreerd voor de voorbereiding van klikbare platformen voor fotogekooide verbindingen van biologisch interessante moleculen die gemakkelijk kunnen worden gewijzigd met extra eigenschappen, zoals oplosbaarheid in water en een cellulaire targetingmogelijkheid. Aangezien de pabhc kooien groep kan worden gebruikt om moleculen met veranderbare functionele groepen voor te bereiden, is de toepassing van dit protocol niet beperkt tot de hierin beschreven moleculen. Met behulp van een modulair platform, namelijk de pabhc kooien groep, kunnen de gewenste gekooide verbindingen gemakkelijk worden voorbereid, en hun fysische en chemische eigenschappen kunnen worden gemoduleerd via Klik modificatie.

Gekooide verbindingen zijn ontworpen synthetische moleculen waarvan de oorspronkelijke functies worden tijdelijk gemaskeerd door covalent bijgevoegde foto-verwijderbaar bescherming groepen. Interessant is dat gekooide verbindingen van biologisch relevante moleculen een onmisbare methode vormen voor de spatiotemporele controle van de cellulaire fysiologie1,2,3,4,5 ,6. In 1977 rapporteerden Engels en Schlaeger de 2-nitrobenzylester van cAMP als membraan permeabel en fotolabile derivaat van cAMP7. Het volgende jaar, Kaplan rapporteerde de 1-(2-nitrofenyl) ethyl ester van ATP (NPE-ATP) en noemde deze compound "gekooide" ATP8. Sindsdien, een reeks van fotochemisch verwisselbare bescherming groepen zoals 2-nitrobenzyls, p-hydroxyphenacyls9, 2-(2-nitrofenyl) ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-Yls12, 13, en (coumarin-4-yl) methyls14,15,16 zijn gebruikt voor de bereiding van gekooide verbindingen.
De synthese van gekooide verbindingen met wenselijk aanvullende eigenschappen zoals membraan permeabiliteit, oplosbaarheid in water, en cellulaire targeting vermogen zou worden verwacht dat het vergemakkelijken van de biologische toepassingen van de cel. Aangezien de fysische en fotochemische eigenschappen van deze moleculen voornamelijk afhangen van de chemische structuur van de fotochemisch verwijderbare beschermende groepen die worden gebruikt om ze voor te bereiden, is een divers repertoire van foto-caging groepen vereist. De structurele diversiteit van de momenteel beschikbare kooien-groepen die hoge fotolysisefficiënties vertonen, is echter beperkt. Dit kan een belemmering vormen voor het verhogen van het gebruik van gekooide verbindingen.
Om dit probleem aan te pakken, is het repertoire van foto-caging groepen uitgebreid door de chemische modificatie van bestaande fotoroemovable Bescherm groepen of het ontwerp van nieuwe fotolabile chromophores met superieure fotomophysical en fotochemische eigenschappen. Voorbeelden zijn nitrodibenzofuraan (ndbf) 17, [3-(4, 5-dimethoxy-2-nitrofenyl) -2-butyl] (dmnpb) 18,19, een calcium-gevoelige 2-nitrobenzyl photocage20, gesubstitueerde coumarinylmethyls (DEAC45021 , Deadccm22, 7-azetidinyl-4-methylcumarin23, en styryl coumarinen24), cyanine derivaten (cyet-pan)25, en bodipy derivaten26,27.
Bovendien, we eerder ontwikkeld de (6-Broom-7-hydroxycoumarin-4-yl) methyl (BHC) groep en met succes gesynthetiseerd verschillende gekooide verbindingen van neurotransmitters28, tweede boodschappers29,30, en oligonucleotiden31,32,33 exposeren grote een-en twee-Fobe excitatie doorsneden. Als extra eigenschappen gemakkelijk kunnen worden geïnstalleerd in de kooien groepen zonder afbreuk te doen aan hun lichtgevoeligheid, dan kan het repertoire van gekooide verbindingen worden uitgebreid34,35,36, 37,38,39. We hebben daarom modulaire gekooide verbindingen ontworpen die uit drie delen bestaan, namelijk de BHC-groep als een foto-responsieve kern, chemische handvatten voor de installatie van extra functionaliteiten, en de moleculen die moeten worden gemaskeerd40, 41.
Dus, dit artikel biedt een praktische methode voor de bereiding van gekooide verbindingen van biologisch relevante moleculen. Het huidige protocol beschrijft methoden voor het opstellen van een klikbare platform voor foto-caging groepen, de invoering van extra functionaliteiten om het repertoire van gekooide verbindingen uit te breiden, de meting van hun fysische en fotochemische eigenschappen en het celtype selectieve targeting van een klikbare gekooide compound voor verdere mobiele toepassing.

<table><tbody><tr><td>acetonitrile, EP</td><td>Nacalai</td><td>00404-75</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile, super dehydrated</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>010-22905</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4-bromoresorcinol</td><td>TCI Chemicals</td><td>B0654</td><td></td></tr><tr><td>N,N&rsquo;-carbonyldiimidazole</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>034-10491</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Kanto</td><td>07278-71</td><td></td></tr><tr><td>Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9%</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>032-12511</td><td></td></tr><tr><td>dichloromethane, dehydrated</td><td>Kanto</td><td>11338-05</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC)</td><td>TCI Chemicals</td><td>D0254</td><td></td></tr><tr><td>4-dimethylaminopyridine</td><td>TCI Chemicals</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide, dehydrated -super-</td><td>Kanto</td><td>10380-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Sigma</td><td>D6046-500ML</td><td></td></tr><tr><td>dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>054-07225</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 4-Chloroacetoacetate</td><td>TCI Chemicals</td><td>C0911</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-08335</td><td></td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-01076</td><td></td></tr><tr><td>inverted fluorescent microscope IX-71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOLUTE Phase Separator, 15 mL</td><td>Biotage</td><td>120-1906-D</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>lipofection reagent</td></tr><tr><td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td><td>Dojindo</td><td>345-01804</td><td>MOPS</td></tr><tr><td>4-nitrophenylchloroformate (4-NPC)</td><td>TCI Chemicals</td><td>C1400</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td>reduced serum medium contains no phenol red</td></tr><tr><td>1,10-Phenanthroline Monohydrate</td><td>Nacalai</td><td>26707-02</td><td></td></tr><tr><td>Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps</td><td>Rayonet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>W01SRM19-5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate Trihydrate</td><td>Nacalai</td><td>31115-05</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric Acid, 96-98%</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>190-04675</td><td></td></tr><tr><td>Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)</td><td>ALDRICH</td><td>762342-100MG</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodium Citrate Dihydrate</td><td>Nacalai</td><td>31404-15</td><td></td></tr><tr><td>Xenon light source, MAX-303</td><td>Asahi Spectra</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ontwerp, synthese en fotochemische eigenschappen van aanklikbare gekooide verbindingen

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

Gekooide verbindingen maken de foto-gemedieerde manipulatie van de celfysiologie met hoge spatiotemporele resolutie. De beperkte structurele diversiteit van de momenteel beschikbare kooien-groepen en de moeilijkheden bij synthetische modificatie zonder afbreuk te doen aan de efficiëntieverbeteringen van fotolyse zijn echter belemmeringen voor het uitbreiden van het repertoire van gekooide verbindingen voor levende cellen Toepassingen. Aangezien de chemische modificatie van coumarin-type foto-caging groepen een veelbelovende benadering is voor de bereiding van gekooide verbindingen met diverse fysische en chemische eigenschappen, rapporteren we een methode voor de synthese van klikbare gekooide verbindingen die kunnen worden gewijzigd gemakkelijk met verschillende functionele units via de koper (I)-gekatalyseerde Huisgen cyclisering. Het modulaire platform molecuul bevat een (6-Broom-7-hydroxycumarine-4-yl) methyl (BHC) groep als een foto-caging groep, die een hoge fotolyse efficiëntie vertoont in vergelijking met die van de conventionele 2-nitrobenzyls. Er worden algemene procedures gepresenteerd voor het bereiden van klikbare gekooide verbindingen die aminen, alcoholen en carboxylaten bevatten. Extra eigenschappen zoals de oplosbaarheid in water en de mogelijkheid van de celtargeting kunnen gemakkelijk worden opgenomen in klikbare gekooide verbindingen. Bovendien werden de fysische en fotochemische eigenschappen, waaronder de fotolyse Quantum yield, gemeten en bleken ze superieur te zijn aan die van de corresponderende BHC gekooide verbindingen. Het beschreven protocol zou daarom kunnen worden beschouwd als een mogelijke oplossing voor het gebrek aan structurele diversiteit in de beschikbare gekooide verbindingen.

Klikbaar gekooide verbindingen van sommige biologisch interessante moleculen, met inbegrip van arachidonzuur en paclitaxel, werden met succes gesynthetiseerd (Figuur 1)28,41. Aanvullende eigenschappen zoals de oplosbaarheid in water en cellulaire targeting werden in paBhcmoc-PTX geïntroduceerd via de koper (I)-gekatalyseerde Huisgen cyclisatie ("Klik"-reactie) (Figuur 2). Deze klikbare gekooide PTXs werden vervolgens gefotolyseerd om hun ouder PTXs te produceren bij bestraling bij 350 nm (Figuur 3), en de fysische en fotochemische eigenschappen van de klikbare gekooide verbindingen zijn samengevat in tabel 1. De kwantum opbrengsten van klikbare gekooide verbindingen 2 '-GLC-paBhcmoc-PTX (φDIS 0,14) en pabhc-AA (φDIS 0,083) waren meer dan tweemaal die van conventionele BHC gekooide verbindingen 2 '-bhcmoc-PTX (φDIS 0,040) en BHC-AA (Φdis 0,038)43. Bovendien werd een verbeterde oplosbaarheid in water waargenomen voor 2 '-GLC-paBhcmoc-PTX, die een glucose groep bevat.
Bij Live-celexperimenten werd de targeting van paBhc-hex-FITC/Halo op de gekweekte zoogdiercellen met een transitieve uitdrukking van een fusie-eiwit van een HaloTag-eiwit en epidermale groeifactor receptor (EGFR) succesvol bereikt. Er werd een groene fluorescentie van het fluoresceïne deel van pabhc-hex-FITC/Halo waargenomen op het celmembraan (Figuur 4). Foto-gemedieerde modulatie van de subcellulaire lokalisatie van een kinase werd bereikt met behulp van een paBhc gekooide compound. De translocatie van diacylglycerolkinase γ (DGKγ) is gemeld om te worden geactiveerd in de aanwezigheid van arachidonzuur (AA)44. De CHO-K1-cellen met een transitieve uitdrukking van GFP-DGKγ werden behandeld met AA of paBhc-AA (5). Toevoeging van AA veroorzaakte de modulatie van de subcellulaire lokalisatie van DGKγ (Figuur 5A, B). Vergelijkbare veranderingen in de lokalisatie van DGKγ werden waargenomen voor de paBhc-AA-behandelde cellen na blootstelling aan UV-licht (Figuur 5C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg"> Figuur 1: voorbereiding van de klikbare gekooide verbindingen. A) reagentiaen condities: A. ethyl 4-chloroacetoacetaat/conc. H2dus4/RT/7 dagen/91% opbrengst, b. 1 M HCl/reflux/3 dagen/97% opbrengst. c. N-methylpropargylamine/HCHO/EtOH, vervolgens toevoegen (1) en warmte bij reflux voor 17 h/79% opbrengst. B) syntheses van het klikbare gekooide AMINE, PTX en arachidonzuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg"> Figuur 2: installatie van functionele eenheden in aanklikbare gekooide verbindingen. A) synthesevan een in water oplosbare GEKOOIDE PTX via de koper (I)-gekatalyseerde huisgen cyclisering. B) structuren van aanklikbare gekooide verbindingen die de ligand van halotag bevatten voor cellulaire targeting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg"> Figuur 3: Photolysis van 2 '-GLC-paBhcmoc-PTX (6). Monsters (10 μM) in K-MOPS-oplossing (pH 7,2) werden bestraald bij 350 nm. A) typische HPLC-sporen voor de fotolyse van 6 (gemeten bij 254 nm). Monsters werden geanalyseerd op de gespecificeerde stralings tijd. B) tijdsverloop voor de fotolyse van 6. Blauwe cirkels tonen het verbruik van 6. De ononderbroken lijn toont de kleinste kwadraten curve geschikt voor een eenvoudige rottende exponentiële voor 6. Rode vierkantjes geven de opbrengst van PTX weer. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (± SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg"> Figuur 4: fluorescentie beelden van gekweekte zoogdiercellen, geïnhaleerd met paBhc-hex-FITC/Halo (8). Cellen die met pcDNA3-Halo-EGFR zijn gefuseerd, werden gedurende 30 minuten geïnhaleerd met een 2 μM-oplossing van compound 8 bij 37 °c. De beelden werden verkregen na herhaald wassen met PBS +. Mock-behandelde HEK293T cellen (A: differentiële interferentie contrast (DIC) afbeelding en D: fluorescentie beeld). HEK293T cellen (b en E) en HeLa-cellen (C en f) die een transitieve uitdrukking geven aan Halo-EGFR (b en C: dic-afbeeldingen en E en f: fluorescentie beelden). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg"> Afbeelding 5: fluorescentie beelden na UV-bestraling van de CHO-K1-cellen geïnineerd met BHC gekooide arachidonzuur. De CHO-K1-cellen werden met een fusie proteïne DGKγ-EGFP getransffecteerd. A) eenfluorescentie beeld van de in het transport geperfectioneerde cellen. B) 100 s na de toevoeging van een 10 μM-oplossing van arachidonzuur. C) cellen werden geïnincubeerd met een 10 μM-oplossing van pabhc-AA (5) bij 37 °c gedurende 5 min. (D) 100 s na 20-s UV-bestraling (330 – 385 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Verbindingen</td>
			<td>λMax (nm)a
</td>
			<td>εMax (M-1 cm-1)b
</td>
			<td>φDISc
</td>
			<td>εφDISd
</td>
			<td>Oplosbaarheid (μM)e
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ptx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-bhcmoc-PTX</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0,040</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-paBhcmoc-PTX</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0,059</td>
			<td>670</td>
			<td>8,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 '-GLC-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0,14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
<tr>
<td>BHC-AA</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0,038</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>paBhc-AA</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0,083</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: fysische en fotochemische eigenschappen van de klikbare gekooide verbindingen. a. absorptiemaximum (nm), b. molaire absorptiviteit bij λMax (M− 1 cm− 1), c. kwantum opbrengst van het verdwijnen van de uitgangsmaterialen bij 350 nm, d. Het product van molaire absorptiviteit en de kwantum opbrengst van verdwijning bij 350 nm, e. De concentratie van de verzadigde oplossing in K-MOPS (pH 7,2) (μg mL− 1).

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de synthese en meting van de fotochemische eigenschappen van modulaire gekooide verbindingen met aanklikbare delen.

Ontwerp, synthese en fotochemische eigenschappen van aanklikbare gekooide verbindingen

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

Het algemene doel van deze procedure is om een praktische methode voor de voorbereiding van fotogekacaged verbindingen met extra eigenschappen zoals water oplosbaarheid of cellulaire targeting vermogen. Met behulp van een eenvoudige synthetische procedure kan deze techniek worden gebruikt om het laboratorium uit te breiden over gekooide verbindingen en om gekooide verbindingen met extra eigenschappen te maken zonder afbreuk te doen aan hun lichtgevoeligheid. Deze synthese kan worden uitgevoerd in een standaard laboratorium als onze klikbare gekooide verbindingen zijn stabiel om foto-bestraling wanneer opgelost in niet-nucleofiele organische oplosmiddelen zoals dichloormethaan of dimethylsulfoxide.Demonstreren van de procedure met Hirona Sasaki zal Akinobu Suzuki, een post-doc, Hanami Aoki en Rei Watahiki, grad studenten van het laboratorium. Begin met het toevoegen van 709,6 milligram paBhc methanol en 397,6 milligram n n-carbonyldiimidazol in een kolf met 30 milliliter. Voeg droge zes milliliter dichloormethaan toe aan de kolf en roer de oplossing een uur lang op omgevingstemperatuur.Voeg aan het einde van de incubatie 342,8 milligram 4-Dimethylaminopyridine en 552 microliter van tert-butyl zes-amino hexylcarbamaat toe en roer de oplossing bij omgevingstemperatuur nog eens drie uur. Gebruik vervolgens een roterende verdamper onder vacuüm om het oplosmiddel en andere vluchtige materialen te verwijderen en gebruik silica gel flash kolom chromatografie om het residu direct te zuiveren. Om een functionele eenheid in de klikbare kooiverbinding te installeren, los 249 milligram koper twee sulfaatpentahydraat op in 10 milliliter ion-geruild water om een 0.1 molaire kopersulfaatoplossing te geven.Los acht milligram twee priempacja-mock paclitaxel op, 7,5 milligram tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine, 162,4 milligram natrium-l-ascorbaat en 3,1 milligram 15-chloro-3, 6, 9-trioxypentyldecyl azide in een gemengd oplosmiddel van 2,5 milliliter fosfaatbuffer van 0,1 molair fosfaat en 0,5 milliliter dimethylsulfoxide. Voeg vervolgens 81,2 microliter 0,1 molaire kopersulfaatoplossing toe aan het reactiemengsel en roer het mengsel 80 minuten bij omgevingstemperatuur, waarbij de voortgang van de reactie met HPLC wordt gecontroleerd. Los aan het einde van de reactie de neerslagsmiddelen op met 3,5 milliliter van een 75%acetyl nitryl wateroplossing en breng de resulterende oplossing rechtstreeks aan op het semi-preparatieve HPLC-systeem om het gewenste product te zuiveren.Voor kwantumefficiëntiemetingen, onder fluorescerende lampen bedekt met UV-licht afgesneden filter, verdun de monstervoorraad oplossing in 10 microliters van dimethylsulfoxide met 10 milliliter KMOPS buffer. Breng een aliquot van de oplossing over in dezelfde reageerbuis die wordt gebruikt in de fotoreactie van de chemische actinometer. Bestraal de monsteroplossing met 350 nanometer licht gedurende vijf seconden, waarbij 50 microliter aliquots periodiek uit de bestraalde oplossing worden verwijderd voor analyse door HPLC.Bepaal vervolgens de bestralingstijd in seconden waarin 90% van het uitgangsmateriaal reageerde door de tijdsafhankelijke verdwijning van het uitgangsmateriaal aan te passen. Voor HaloTag ligand targeting van een klikbare gekooide verbinding, oogst de doelcel populatie van belang met een geschikte cel dissociatie reagens en re-suspend de cellen in een 2,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter van DMEM concentratie. Dan zaad ongeveer 10 tot de vijfde cellen per schotel in 35 milliliter glazen bodemschotels voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.De volgende ochtend, verdun 14 microgram van de PC DNA drie halo epidermale groeifactor receptor plasma DNA in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis met 700 microliter van verminderd serum medium. Voeg vervolgens vijf microliters van het lipofectionreagens toe in 150 microliter van verlaagd serummedium aan elk van de vier buizen en laat de buizen vijf minuten bij omgevingstemperatuur staan. Voeg aan het einde van de incubatie 150 microliter verdund plasma-DNA toe aan elk van de verdunde lipofectionrecagemonsters en ontcubeer de monsters bij omgevingstemperatuur nog eens vijf minuten.Spoel aan het einde van de incubatie de cellen met twee milliliter PBS per schaal en voeg 1,5 milliliter verlaagd serummedium toe aan elke cultuur. Voeg 150 microliters van het plasmide lipofection reagenscomplex toe aan elk gerecht en breng de cellen 48 uur terug naar de celkweek incubator. Aan het einde van de incubatie, aspirate de supernatants en voeg een milliliter vers bereide DMEM aangevuld met twee micromolar paBhc hex fitzi halo aan elk gerecht.Na 30 minuten bij 37 graden Celsius, aspirate het medium met de gekooide verbinding en spoel de cellen twee keer met een milliliter PBS plus om eventuele niet-gebonden verbindingen te verwijderen. Voeg 500 microliter van verminderd serummedium toe aan elk gerecht en breng de cellen nog 30 minuten terug naar de couveuse van de celkweek om de verbindingen te verwijderen die in de cellen zijn gekomen. Aan het einde van de incubatie, spoel de cellen twee keer met een milliliter PBS plus per schotel en voeg een milliliter medium zonder fenol rood aan elke cultuur.Neem vervolgens de florescentie beelden op door confocale florescentiemicroscopie te laserscannen. Voor foto-gemedieerde modulatie van de kinase lokalisatie met behulp van een klikbare gekooide verbinding, zaad ongeveer vijf keer 10 tot de vijfde TOC-A-one cellen in twee milliliter van Ham's F12 medium per 35 milliliter glazen bodem schotel. De volgende dag, transfect de cellen met de plasmid codering voor GFP diacylglycerol kinase gamma voor 48 uur zoals net aangetoond.Vervang na het einde van de transfectie de transfectiesupernatant door twee milliliter verlaagd serummedium. Voeg 20 microliters van 100 keer paBhcAA werkoplossing toe aan de cellen voor een incubatie van vijf tot 60 minuten bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Plaats de schotel aan het einde van de incubatie op het objectieve stadium van een omgekeerde fluorescerende microscoop die is uitgerust met een fluorescentieverlichting met dubbele lichtbron.Beeld de cellen elke 10 seconden gedurende 10 minuten terwijl de cellen worden bestraald op de juiste experimentele tijdstippen en golflengtes volgens het experimentele protocol. Met behulp van deze methode zoals aangetoond, klikbare gekooide verbindingen van een aantal biologisch interessante moleculen, waaronder paclitaxel en arachidonic zuur, kan met succes worden gesynthetiseerd. Extra eigenschappen zoals de wateroplosbaarheid en cellulaire targeting vermogen kan worden geïntroduceerd in de paBhc mock paclitaxel via de koper een gekatalyseerde cyclization klikreactie.Deze klikbare gekooide paclitaxels kunnen vervolgens worden gefotolysed om hun ouderverbindingen te produceren bij bestraling op 350 nanometer. De fysieke en fotochemische eigenschappen van de aanklikbare gekooide verbindingen worden samengevat in de tabel. In live cel experimenten, de targeting van paBhc hex fitzi halo naar gekweekte zoogdiercellen tijdelijk uitdrukken van een HaloTagged eiwit en epidermale groeifactor receptor induceert een groene florescence signaal van de fluorescein moiety PAHBHC hex fitzi halo op het celmembraan.Verder veroorzaakt de behandeling van CHO-K1 cellen die GFP diacyl glycerol kinase gamma uitdrukken met arachidonic acid modulatie van de subcellulaire lokalisatie van diacyl glycerol kinase gamma. Vergelijkbare veranderingen in diacyl glycerol kinase gamma lokalisatie worden ook waargenomen in paBhc-AA behandelde cellen na blootstelling aan UV-licht. Bij het uitvoeren van de caging experimenten in waterige oplossingen verhogen cultuur medium, zorg ervoor dat altijd werken onder tl-lamp met korte golf lengte afgetopt filter.Na deze procedure u kooiverbindingen bestuderen die overvloedig aanwezig zijn geweest voor gebruik in biologische experimenten als gevolg van een gebrek aan wateroplosbaarheid, membraan doorlaatbaarheid of cellulaire targeting vermogen.

design-synthesis-photochemical-properties-clickable-caged

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Adenovirus deeltjes zijn ontworpen om zowel de onnatuurlijke aminozuur analoog azidohomoalanine of de azido suiker...

Chemoselectieve Wijziging van Viral oppervlakken via bioorthogonal Klik Chemie

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

Organische kleurstofmoleculen en oleic zuur gecoate upconverting nanodeeltjes zijn niet wateroplosbaar. Dit protocol beschrijft een ‘plug and play’ methode die de overdracht van organische kleurstofmoleculen en upconverting deeltjes van hun oorspronkelijke hydrofobe oplosmiddel naar water mogelijk maakt.

Een &#39;Plug and Play&#39; methode om water verspreidende Nanoassemblies bevattende een Amfifiele Polymer, organische kleurstoffen en Upconverting Nanodeeltjes maken

Fotostabiele cyanine kleurstoffen worden aan oligonucleotiden gekoppeld om hybridisatie te controleren door energieoverdracht.

Synthese van golflengteverschuivende DNA hybridisatie sondes met behulp Fotostabiele Cyanine Dyes

Dit protocol geeft de belangrijkste stappen voor de bioconjugatie van een cysteïne bevattend eiwit een maleïmide, zoals zuivering reagens, reactieomstandigheden, bioconjugaat zuivering en karakterisering bioconjugaat.

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

We beschrijven hier een methode voor de identificatie van klein molecuul-bindende eiwitten met behulp van fotoaffiniteitslabeling. Het voordeel van deze techniek is dat binding en covalente labeling van de doeleiwitten plaatsvindt binnen de levende cellulaire omgeving, waardoor het risico van verstoring van de native eiwitstructuur en bindingscondities bij cellyse wordt geëlimineerd.

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Hier presenteren we een protocol om chemisch verkennende sondes op een specifieke plaats in een antilichaamfragment in te brengen door genetisch een azid-bevattend aminozuur in te bouwen en vervolgens het azid te koppelen aan een chemische sonde door spanningsgepromoveerde azid-alkyn cycloadditie (SPAAC).

Efficiënt en Site-specifiek antilichaam Labeling by-stam bevorderde azide-alkyn Cycloadditiereacties

In dit protocol was gekooide proteïne kinase A (PKA), een Cellulaire signaaltransductie bioeffector, geïmmobiliseerd op een oppervlak van nanoparticle, microinjected in het cytosol en geactiveerd door de upconverted UV-licht van nabij-infrarood (NIR) bestraling, inducerende stroomafwaarts stress vezel desintegratie in het cytosol.

Een geïntegreerd systeem op afstand trigger intracellulaire signaaltransductie door Kinase Upconversion Nanoparticle-gemedieerde Photoactivation

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Dit protocol beschrijft licht geactiveerd nucleaire translocatie van gasten in levende cellen met behulp van gekooide moleculaire lijm tags. Deze methode is veelbelovend voor site-selectieve nucleaire-targeting drug delivery.

Spatiotemporally gecontroleerde nucleaire translocatie van gasten in levende cellen gekooide moleculaire lijm als Photoactivatable Tags gebruiken

Ontdek de synthese van klikbare gekooide verbindingen met extra eigenschappen zoals wateroplosbaarheid en celdoelgerichtheid. Deze methode behoudt de fotosensitiviteit voor toepassingen in de neurowetenschap.

Ontwerp, synthese en fotochemische eigenschappen van aanklikbare gekooide verbindingen

Meer video's verkennen