Ontwerp, synthese en fotochemische eigenschappen van aanklikbare gekooide verbindingen

Het algemene doel van deze procedure is om een praktische methode voor de voorbereiding van fotogekacaged verbindingen met extra eigenschappen zoals water oplosbaarheid of cellulaire targeting vermogen. Met behulp van een eenvoudige synthetische procedure kan deze techniek worden gebruikt om het laboratorium uit te breiden over gekooide verbindingen en om gekooide verbindingen met extra eigenschappen te maken zonder afbreuk te doen aan hun lichtgevoeligheid. Deze synthese kan worden uitgevoerd in een standaard laboratorium als onze klikbare gekooide verbindingen zijn stabiel om foto-bestraling wanneer opgelost in niet-nucleofiele organische oplosmiddelen zoals dichloormethaan of dimethylsulfoxide.

Demonstreren van de procedure met Hirona Sasaki zal Akinobu Suzuki, een post-doc, Hanami Aoki en Rei Watahiki, grad studenten van het laboratorium. Begin met het toevoegen van 709,6 milligram paBhc methanol en 397,6 milligram n n-carbonyldiimidazol in een kolf met 30 milliliter. Voeg droge zes milliliter dichloormethaan toe aan de kolf en roer de oplossing een uur lang op omgevingstemperatuur.

Voeg aan het einde van de incubatie 342,8 milligram 4-Dimethylaminopyridine en 552 microliter van tert-butyl zes-amino hexylcarbamaat toe en roer de oplossing bij omgevingstemperatuur nog eens drie uur. Gebruik vervolgens een roterende verdamper onder vacuüm om het oplosmiddel en andere vluchtige materialen te verwijderen en gebruik silica gel flash kolom chromatografie om het residu direct te zuiveren. Om een functionele eenheid in de klikbare kooiverbinding te installeren, los 249 milligram koper twee sulfaatpentahydraat op in 10 milliliter ion-geruild water om een 0.1 molaire kopersulfaatoplossing te geven.

Los acht milligram twee priempacja-mock paclitaxel op, 7,5 milligram tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine, 162,4 milligram natrium-l-ascorbaat en 3,1 milligram 15-chloro-3, 6, 9-trioxypentyldecyl azide in een gemengd oplosmiddel van 2,5 milliliter fosfaatbuffer van 0,1 molair fosfaat en 0,5 milliliter dimethylsulfoxide. Voeg vervolgens 81,2 microliter 0,1 molaire kopersulfaatoplossing toe aan het reactiemengsel en roer het mengsel 80 minuten bij omgevingstemperatuur, waarbij de voortgang van de reactie met HPLC wordt gecontroleerd. Los aan het einde van de reactie de neerslagsmiddelen op met 3,5 milliliter van een 75%acetyl nitryl wateroplossing en breng de resulterende oplossing rechtstreeks aan op het semi-preparatieve HPLC-systeem om het gewenste product te zuiveren.

Voor kwantumefficiëntiemetingen, onder fluorescerende lampen bedekt met UV-licht afgesneden filter, verdun de monstervoorraad oplossing in 10 microliters van dimethylsulfoxide met 10 milliliter KMOPS buffer. Breng een aliquot van de oplossing over in dezelfde reageerbuis die wordt gebruikt in de fotoreactie van de chemische actinometer. Bestraal de monsteroplossing met 350 nanometer licht gedurende vijf seconden, waarbij 50 microliter aliquots periodiek uit de bestraalde oplossing worden verwijderd voor analyse door HPLC.

Bepaal vervolgens de bestralingstijd in seconden waarin 90% van het uitgangsmateriaal reageerde door de tijdsafhankelijke verdwijning van het uitgangsmateriaal aan te passen. Voor HaloTag ligand targeting van een klikbare gekooide verbinding, oogst de doelcel populatie van belang met een geschikte cel dissociatie reagens en re-suspend de cellen in een 2,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter van DMEM concentratie. Dan zaad ongeveer 10 tot de vijfde cellen per schotel in 35 milliliter glazen bodemschotels voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

De volgende ochtend, verdun 14 microgram van de PC DNA drie halo epidermale groeifactor receptor plasma DNA in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis met 700 microliter van verminderd serum medium. Voeg vervolgens vijf microliters van het lipofectionreagens toe in 150 microliter van verlaagd serummedium aan elk van de vier buizen en laat de buizen vijf minuten bij omgevingstemperatuur staan. Voeg aan het einde van de incubatie 150 microliter verdund plasma-DNA toe aan elk van de verdunde lipofectionrecagemonsters en ontcubeer de monsters bij omgevingstemperatuur nog eens vijf minuten.

Spoel aan het einde van de incubatie de cellen met twee milliliter PBS per schaal en voeg 1,5 milliliter verlaagd serummedium toe aan elke cultuur. Voeg 150 microliters van het plasmide lipofection reagenscomplex toe aan elk gerecht en breng de cellen 48 uur terug naar de celkweek incubator. Aan het einde van de incubatie, aspirate de supernatants en voeg een milliliter vers bereide DMEM aangevuld met twee micromolar paBhc hex fitzi halo aan elk gerecht.

Na 30 minuten bij 37 graden Celsius, aspirate het medium met de gekooide verbinding en spoel de cellen twee keer met een milliliter PBS plus om eventuele niet-gebonden verbindingen te verwijderen. Voeg 500 microliter van verminderd serummedium toe aan elk gerecht en breng de cellen nog 30 minuten terug naar de couveuse van de celkweek om de verbindingen te verwijderen die in de cellen zijn gekomen. Aan het einde van de incubatie, spoel de cellen twee keer met een milliliter PBS plus per schotel en voeg een milliliter medium zonder fenol rood aan elke cultuur.

Neem vervolgens de florescentie beelden op door confocale florescentiemicroscopie te laserscannen. Voor foto-gemedieerde modulatie van de kinase lokalisatie met behulp van een klikbare gekooide verbinding, zaad ongeveer vijf keer 10 tot de vijfde TOC-A-one cellen in twee milliliter van Ham's F12 medium per 35 milliliter glazen bodem schotel. De volgende dag, transfect de cellen met de plasmid codering voor GFP diacylglycerol kinase gamma voor 48 uur zoals net aangetoond.

Vervang na het einde van de transfectie de transfectiesupernatant door twee milliliter verlaagd serummedium. Voeg 20 microliters van 100 keer paBhcAA werkoplossing toe aan de cellen voor een incubatie van vijf tot 60 minuten bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Plaats de schotel aan het einde van de incubatie op het objectieve stadium van een omgekeerde fluorescerende microscoop die is uitgerust met een fluorescentieverlichting met dubbele lichtbron.

Beeld de cellen elke 10 seconden gedurende 10 minuten terwijl de cellen worden bestraald op de juiste experimentele tijdstippen en golflengtes volgens het experimentele protocol. Met behulp van deze methode zoals aangetoond, klikbare gekooide verbindingen van een aantal biologisch interessante moleculen, waaronder paclitaxel en arachidonic zuur, kan met succes worden gesynthetiseerd. Extra eigenschappen zoals de wateroplosbaarheid en cellulaire targeting vermogen kan worden geïntroduceerd in de paBhc mock paclitaxel via de koper een gekatalyseerde cyclization klikreactie.

Deze klikbare gekooide paclitaxels kunnen vervolgens worden gefotolysed om hun ouderverbindingen te produceren bij bestraling op 350 nanometer. De fysieke en fotochemische eigenschappen van de aanklikbare gekooide verbindingen worden samengevat in de tabel. In live cel experimenten, de targeting van paBhc hex fitzi halo naar gekweekte zoogdiercellen tijdelijk uitdrukken van een HaloTagged eiwit en epidermale groeifactor receptor induceert een groene florescence signaal van de fluorescein moiety PAHBHC hex fitzi halo op het celmembraan.

Verder veroorzaakt de behandeling van CHO-K1 cellen die GFP diacyl glycerol kinase gamma uitdrukken met arachidonic acid modulatie van de subcellulaire lokalisatie van diacyl glycerol kinase gamma. Vergelijkbare veranderingen in diacyl glycerol kinase gamma lokalisatie worden ook waargenomen in paBhc-AA behandelde cellen na blootstelling aan UV-licht. Bij het uitvoeren van de caging experimenten in waterige oplossingen verhogen cultuur medium, zorg ervoor dat altijd werken onder tl-lamp met korte golf lengte afgetopt filter.

Na deze procedure u kooiverbindingen bestuderen die overvloedig aanwezig zijn geweest voor gebruik in biologische experimenten als gevolg van een gebrek aan wateroplosbaarheid, membraan doorlaatbaarheid of cellulaire targeting vermogen.