Name: Een model van zelf beperkte acute long letsel door unilaterale intra-bronchiale zuur Instillatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Leer een reproduceerbaar model voor acuut longletsel bij muizen door selectieve intra-bronchiale zuurinstillatie. Deze methode bootst ARDS na en minimaliseert dierlijk lijden door lokalisatie naar de linkerlong.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Dr. Joseph Mizgerd bedanken voor zijn bijdragen aan de ontwikkeling van de selectieve intra-bronchiale methode en voor zijn nuttige commentaren en herziening van het manuscript. Dit werk werd gesteund door nationale instituten voor gezondheids subsidies P01GM095467 (B.D.L.) en K08HL130540 (R.E.A.).

Alle onderstaande dier procedures zijn beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité in het Brigham and Women's Hospital (protocol #2016N000356).
Opmerking: Voor alle overlevings procedures werd een steriele techniek gevolgd. Voor elke operatie werd een steriel veld met een steriele draperen handdoek vastgesteld, terwijl chirurgen steriele chirurgische handschoenen, doppen, maskers en schone laboratoriumjassen droegen. Alle chirurgische instrumenten werden gesteriliseerd met behulp van een autoclaaf, en de steriliteit werd gehandhaafd met behulp van een kraal sterilisator.
1. bereiding van 0,1 N HCl
<ol><li>Voeg 11 mL ddH2O toe aan een amberkleurige glazen fles. Voeg langzaam 1 mL 37% HCl (12 N) toe om een 1 N HCl-werkvoorraad te maken. Let op: Zorg ervoor dat HCl in het water wordt toegevoegd. Dit is een veiligheidsprobleem omdat het toevoegen van water direct aan het zuur kan leiden tot het koken van zuur en spatten uit de fles. Zorg er bij het hanteren van geconcentreerde HCl voor dat het zuur wordt bewaard in een geventileerde chemische kap en dat de gepaste persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen, inclusief Labcoat, handschoenen en veiligheidsbril.</li>
	<li>Voeg langzaam 4 mL van de eerder verdunde HCl-werkvoorraad toe aan 35 mL ddH2O in een conische buis van 50 ml om een experimentele voorraad van 0,1 N HCl te maken.</li>
	<li>Meet de pH van de experimentele kolf met behulp van een elektronische pH-elektrode na tweepunt kalibratie met lage pH-oplossingen. Tiveren naar pH 1,1 met NaOH-of HCL-voorraadoplossingen indien nodig, zodat het uiteindelijke volume 40 ml is. Opmerking: Het meten van de lage pH-waarden kan moeilijk zijn. Om een nauwkeurige meting te garanderen, moet u ervoor zorgen dat de pH-elektrode goed is gekalibreerd met behulp van lage pH-normen om te voorkomen dat de meting te extrapolatie is.</li>
	<li>Filtreer direct voor het experiment 1 – 2 mL van de experimentele HCl-kolf door een steriel 0,22 μm-filter in een steriele micro centrifugebuis.</li>
</ol>2. selectieve intra-bronchiale Instillatie van HCl
<ol><li>
Het chirurgische gebied voorbereiden
	<ol>
<li>Induceren van algemene anesthesie door het leveren van een ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) mengsel door intraperitoneale injectie. Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd door zachtjes knijpen de tip van de staart of achtervoet. Gebrek aan terugtrekking reactie is vereist voorafgaand aan het maken van een huid incisie.  Extra anesthesie boluses toedienen, indien nodig.</li>
		<li>Lever 0,1 mg/kg buprenorfine subcutaan onder de Scruff van de nek. Pre-operatieve analgetische zal het effect van de anesthesie versterken en zal verzachten pre-en post-operatieve pijn als gevolg van de procedure.</li>
		<li>Gebruik elektrische Clippers om het chirurgische gebied op het ventrale oppervlak van de muis, onder de kin in het cervicaal gebied van de keel, voorzichtig te scheren met behulp van langzame neerwaartse streken. Verwijder losse vacht om de onderliggende huid volledig bloot te leggen.</li>
		<li>Bereid het chirurgische gebied voor door de geschoren plaats te Zwaben met 10% Povidon-jodiumoplossing. Reinig na het aanbrengen van de aseptische oplossing de plaats met een 70% isopropylalcohol doekje. Herhaal deze stap 3x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De luchtpijp isoleren
	<ol>
<li>Plaats de muis in een liggende positie op een schoon chirurgisch bord en bedek de muis in een steriele chirurgische draperen met behoud van de blootstelling van het chirurgische gebied. Beveilig de draperen op zijn plaats.</li>
		<li>Maak een 0,5 cm longitudinale incisie in de huid boven de luchtpijp en de speekselklieren. Gebruik licht gebogen gekrulde tang om de huid voorzichtig terug te trekken en de speekselklieren voorzichtig te scheiden om de tracheale spieren bloot te leggen.</li>
		<li>Gebruik de geserbeende Tang voor botte dissectie, duw zachtjes de paratracheale spieren uit elkaar en verpesten de fascia die de luchtpijp omdoet totdat de kraakbeen ringen van de luchtpijp volledig zijn blootgesteld.</li>
		<li>Gebruik volledig gebogen getand tang om de luchtpijp op te tillen en het bindweefsel tussen de retro-luchtpijp en de retro-fascia te scheiden. Zodra het bindweefsel loskomt, moet de punt van de Tang volledig achter de luchtpijp glijden.</li>
		<li>Houd de gebogen Tang achter de luchtpijp en pak een 10 – 15 cm stuk 4-0 gevlochten zijde hecht met de uiteinden van de Tang. Trek de hechtdraad achter de luchtpijp zodat er aan weerszijden een gelijkmatige lengte is.</li>
		<li>Zodra de hechting is op zijn plaats, Trek voorzichtig de zijkanten van de hechting naar de achterste van de muis en houd de zijkanten op zijn plaats.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selectief de linker mainstam bronchus cannuleren en HCL bijbrengen
	<ol>
<li>Neem een 24 G x 3/4 "angio katheter en steek de naald, schuin omhoog, in de voorste regio van de luchtpijp tussen de eerste en tweede tracheale ringen. Zodra de juiste inbrengen wordt bevestigd door directe visualisatie van de naaldpunt in het tracheale lumen, laat de hechting los en breng de canule over op de naald en in de luchtpijp totdat de weerstand is bereikt en trek vervolgens de naald terug. Hoek de richting van het inbrengen naar de linker hoofdstam bronchus voor selectieve instillatie in de linker long.</li>
		<li>Zodra de canule op zijn plaats is, moet u de injectie poort stevig vastgrijpen om te voorkomen dat de katheter verschuift.</li>
		<li>Gebruik een P200 pipet en steriele P200 pipetpunten om 2,5 mL/kg (50 μL voor een muis van 20 g) steriele gefilterde 0,1 N HCl in de katheter te installeren, gevolgd door een identiek volume lucht.</li>
		<li>Trek de katheter snel op en til de chirurgische kaart op tot een hoek van 60 ° gedurende 30 sec.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Het chirurgische gebied sluiten
	<ol>
<li>Leg de chirurgische plank plat en verwijder de hechting van achter de luchtpijp.</li>
		<li>Gebruik 4-0 Wax gecoate gevlochten zijde hechtmiddel om de huid incisie te sluiten met 2 – 3 steken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. postoperatieve zorg
<ol><li>Zodra de incisie is gesloten, plaats de muis op de linker kant op een warme verwarmingspad totdat de muis herstelt van anesthesie. Begin met het bewaken van de muis voor pijn en activiteitsniveau voordat u terugkeert naar de normale behuizing. Opmerking: Buprenorfine dient te worden toegediend bij 0,1 mg/kg subcutaan elke 6-12 h gedurende de eerste 24 uur. Als aanhoudende doorbraakpijn aanwezig is, verlengt u het analgetische regime totdat de pijn afneemt.</li>
</ol>4. hele Long bronchoalveolaire lavage (BAL) en leukocyten Immunophenootypering
<ol><li>
Euthaniseer de muis door het toedienen van 3x de dosis ketamine/xylazine gebruikt in stap 2.1.1.
	<ol>
<li>Om interstitiële en intravasculaire neutrofielen te onderscheiden, injecteert u een geselecteerde fluorophore-gelabelde Ly6G antilichaam 5 min voorafgaand aan euthanasie. Dit etiket moet geschikt zijn voor detectie doorstroming cytometrie om intravasculaire neutrofielen te onderscheiden van Long interstitiële en alveolaire neutrofielen, die tijdens het weefsel preparaat met een andere de zullen worden geëtiketteerd (zie hieronder).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de muis op een chirurgisch bord en haak de anterieure snijtanden rond een lus van 2-0 gevlochten zijde hecht.</li>
	<li>Volg stap 2.2.2 – 2.2.6. om de luchtpijp voor de cannulatie voor te bereiden. Opmerking: Zorg ervoor dat het diafragma niet wordt doorgeprikt om de trans-alveolaire oppomp druk tijdens Long spoeling te maximaliseren; de linker long-compliance neemt af na letsel, wat een hogere trans-alveolaire druk vereiste voor Long spoeling kan vereisen.</li>
	<li>Laat de luchtpijp na stap 2.3.1, maar niet de katheter onder de Carina; plaats de katheter parallel aan de luchtpijp.</li>
	<li>Met de katheter ingebracht, bind de hechtdraad rond de luchtpijp om de katheter op zijn plaats te houden.</li>
	<li>Instill en trekken twee opeenvolgende 1 mL aliquots van ijskoude PBS-/-(zonder magnesium of calcium) met 0,6 mM EDTA met behulp van een 1 cc spuit. Voor immunophenootypering doorstroming cytometrie, verwijder elke aliquot en keer terug naar een 5 mL polystyreen FACS buis op ijs.</li>
	<li>Om euthanasie te garanderen, voert u een Thoracotomie uit met behulp van een chirurgische schaar gevolgd door een hart punctie. De longen kunnen worden geoogst voor verdere verwerking.</li>
	<li>Centrifugeer de BAL gedurende 10 minuten bij 800 g bij 4 °C om de cellen te pellet.</li>
	<li>Decanteer de supernatant in een 2 mL micro centrifugebuis en ALIQUOT in 1,5 mL micro centrifugebuizen. Bewaren bij-80 °C voor verdere analyse.</li>
	<li>Respendeer de celpellet in PBS-/-met 2% FBS voor differentiële analyse van leukocyten door Flowcytometrie.</li>
	<li>Om interstitiële en intravasculaire neutrofielen te differentiëren, verwijdert u de linker-en rechter long afzonderlijk en verwerkt u de longen voor Flowcytometrie zoals in Abdulnour et al. 20146.</li>
	<li>Beits de resulterende celsuspensie met behulp van geselecteerde FACS antilichamen, zorg ervoor dat u vlek voor Ly6G die is geconjugeerd met een andere de dan het Ly6G antilichaam uit stap 4.1.1.</li>
</ol>5. beoordeling van de permeabiliteit van de alveolaire barrière met behulp van Evan's Blue Dye (EBD)
<ol><li>Injecteer de blauwe kleurstof van Evan (40 mg/kg) 30 minuten voorafgaand aan euthanasie.</li>
	<li>Euthaniseer de muis met een overdosis ketamine/xylazine (stap 4,1).</li>
	<li>Om de alveolaire barrière-integriteit te meten, volgt u de stappen 4.2 – 4.9 voor BAL verzameling.</li>
	<li>Breng 100 μL BALF over naar een heldere bodem 96-well microplaat, samen met 100 μL dubbele EBD-normen. Gebruik PBS-/-als een blanco.</li>
	<li>Gebruik een microplaat lezer om de absorptie van het BALF bij 620 nm en 740 nm te meten. Gebruik de extinctie bij 740 nm om te corrigeren voor Heem besmetting in de monsters7.</li>
	<li>Om de integriteit van de vasculaire barrière te meten, parfumerde u de longen door langzaam 5 mL ijskoude PBS-/-door de rechter ventrikel van het hart te injecteren. Verwijder de linker long.</li>
	<li>Droog de linker long voor 72 uur bij 58 °C om overtollig water te verwijderen.</li>
	<li>Verwerk het gedroogde longweefsel zoals in Radu en Chernoff 20138, en meet de gemiddelde bij 620 nm en 740 nm.</li>
</ol>6. Long histologie
<ol><li>Trek de luchtpijp uit door de stappen 4.1 – 4.5 te volgen.</li>
	<li>Om druk de longen op 20 cm H2O te fixeren, gebruik een ring standaard en klem om een 60 ml spuit met ventiel geregelde slang te verheffen en gevuld met een selecte fixatieve oplossing (bijv. zink fixeermiddel), zodat de meniscus van de fixatieve oplossing 20 cm boven de Longen.</li>
	<li>Bevestig de slang aan de katheter en open de waarde. Vul de longen langzaam met fixeermiddel totdat ze stoppen met opblazen.</li>
	<li>Verwijder de katheter 3/4 van de weg uit de luchtpijp. Bind de luchtpijp af met hechtdraad voordat u de katheter volledig verwijdert om het verlies van fixatief te minimaliseren.</li>
	<li>Verwijder de longen en het hart en bloc. Opmerking: Zorg ervoor dat de longen tijdens het verwijderen niet worden doorgeprikt om de druk geïnfundeerd fixatief te behouden.</li>
	<li>Bevestig de longen 24 uur in 25 mL fixeermiddel bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de vaste longen voor opeenvolgende 20 min intervallen in PBS-/-, 30% ethanol en 50% ethanol.</li>
	<li>Na de laatste wasbeurt, bewaar de longen in 70% ethanol voor histologie verwerking zoals in Eickmeier et al. 20139.</li>
</ol>

<ol><li>Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaron%2C+RM+%22Harrison%27s+Principles+of+Internal+Medicine%2C+20e%22">Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e</a>. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).</li>
<li>Bellani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+Patterns+of+Care%2C+and+Mortality+for+Patients+With+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome+in+Intensive+Care+Units+in+50+Countries%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries.</a> The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).</li>
<li>The ARDS Definition Task. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%3A+The+Berlin+DefinitionThe+Berlin+Definition+of+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS.</a> The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).</li>
<li>Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).</li>
<li>Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -E. E., Engstrom, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+Proresolving+Mediators+in+Innate+and+Adaptive+Immune+Responses+in+Airway+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases.</a> Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maresin+1+biosynthesis+during+platelet-neutrophil+interactions+is+organ-protective%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526(2014).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+permeability+assessed+by+fluorescent-labeled+dextran+instilled+intranasally+into+mice+with+LPS-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li>
<li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+assay+to+test+blood+vessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An in vivo assay to test blood vessel permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. 73 (73), e50062(2013).</li>
<li>Eickmeier, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspirin-triggered+resolvin+D1+reduces+mucosal+inflammation+and+promotes+resolution+in+a+murine+model+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury.</a> Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+isoforms+differentially+regulate+leukocyte+responses+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).</li>
<li>Fukunaga, K., Kohli, P., Bonnans, C., Fredenburgh, L. E., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclooxygenase+2+Plays+a+Pivotal+Role+in+the+Resolution+of+Acute+Lung+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury.</a> Journal of Immunology. 174 (8), 5033(2005).</li>
<li>Colby, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D3+and+Aspirin-Triggered+Resolvin+D3+Are+Protective+for+Injured+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).</li>
<li>Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phosphatidylinositol+3-kinase+by+polyisoprenyl+phosphates+in+neutrophil-mediated+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).</li>
<li>Mandell, L. A., Niederman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Aspiration Pneumonia.</a> New England Journal of Medicine. 380 (7), 651-663 (2019).</li>
<li>Seki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-inflammatory+and+proresolving+mediator+resolvin+E1+protects+mice+from+bacterial+pneumonia+and+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).</li>
<li>Abdulnour, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspirin-triggered+resolvin+D1+is+produced+during+self-resolving+gram-negative+bacterial+pneumonia+and+regulates+host+immune+responses+for+the+resolution+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation.</a> Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).</li>
<li>Traber, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-epithelial+cross+talk+coordinates+synthesis+of+the+tissue-protective+cytokine+leukemia+inhibitory+factor+during+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia.</a> American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).</li>
<li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+lung+epithelium+in+neutrophil+recruitment+during+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).</li>
<li>Acute Respiratory Distress Syndrome Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilation+with+Lower+Tidal+Volumes+as+Compared+with+Traditional+Tidal+Volumes+for+Acute+Lung+Injury+and+the+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+contributes+to+ventilator-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+activates+xanthine+oxidoreductase+through+MAP+kinase-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).</li>
<li>Serhan, C. N., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvins+in+inflammation%3A+emergence+of+the+pro-resolving+superfamily+of+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven intra-bronchiale instillatie methode maakt gebruik van selectieve cannulatie van de linker hoofdstam bronchus om HCl in de linker long te brengen, resulterend in unilaterale en zelf beperkte Murine acute long letsel. Dit murinezuur long letsel model vertegenwoordigt nauwkeurig de ontstekingsreactie, histopathologie en fysiologische disfunctie die wordt waargenomen bij menselijke ARDS, waarbij maagzuur aspiratie een veelvoorkomend precipiterende of bijdragende factor4is. Blootstelling van de Murine luchtweg aan lage pH HCl resulteert in verhoogde permeabiliteit van de alveolaire-capillair barrière, alveolaire oedeem, en diepe neutrofiele infiltratie op de plaats van letsel. Deze bijwerkingen worden niet waargenomen in de onbeschadigde rechter long. Daarnaast produceert dit model snelle ontstekingsreacties die piek binnen 24 uur na zure instillatie, en deelt veranderingen in genexpressie met menselijke ARDS, zoals de differentiële expressie van fosfolipase D isovormen10.
Hoewel dit muriene preklinisch model veel van de kenmerken van ARDS op de moleculaire, cellulaire en weefsel niveaus reproduceert, wordt de menselijke ARDS niet volledig weer gerecapituleren. De definitie van ARDS omvat bilaterale Long betrokkenheid3, terwijl de hier beschreven instillatie methode resulteert in ontwerp in eenzijdige longziekte. Bovendien vereisen de dieren geen continue mechanische ventilatie, immobiliteit of parenterale sedatie. De hier gepresenteerde resultaten (vide supra) en elders6,9,11,12,13 tonen aan dat eenzijdig zuur-geïnduceerde long letsel het merendeel van de pathologische kenmerken van Een unieke kans om de juiste Long te gebruiken als interne controle en om de resolutie fase van deze ziekte te bestuderen. Als zodanig, het model hier besproken modellen ARDS Pathobiologie, maar maakt ook mechanistische onderzoek van fundamentele longweefsel reacties op letsel en resolutie mechanismen die relevant kunnen zijn voor het aanpakken van deze belangrijke ziekte.
Instillatie van HCl staat voor direct acuut long letsel, dus het is een modellerings aspect van de pathofysiologie geassocieerd met aspiratie pneumonitis. Bovendien wordt de initiële linker long belediging in dit model gegenereerd met behulp van steriele HCl in plaats van bacteriën beladen maaginhoud gezien in sommige menselijke aspiratie gebeurtenissen die ook tot longontsteking14leiden kunnen. Bij mensen kan aspiratie van pathogene bacteriën resulteren in secundaire bacteriële pneumonie die de acute ontstekingsreactie vererveert, het initiële long letsel verlengt en de gevoeligheid van de patiënt voor de ontwikkeling van ARDS14verhoogt. Deze potentiële beperking is verholpen door onderzoekers die opzettelijk pathogene bacteriën Escherichia coli (E. coli)15 in een steriele HCL hebben gebracht. Bovendien is deze methode gebruikt om pathogeen-gemedieerde ontsteking eenzijdige bacteriële pneumonie kan worden geïnduceerd door selectieve Long instillatie van bacteriën, zoals E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16en Streptococcus pneumoniae18 . Het zelf beperkte acute long letsel model dat hier wordt beschreven, kan ook worden gebruikt om door de ventilator veroorzaakte long letsel (VILI) te bestuderen, een belangrijke oorzaak van verhoogde sterfte in menselijke ARDS19. Experimentele diermodellen van VILI omvatten meestal mechanische ventilatie in naïeve muizen met getijden volumes die veel hoger zijn dan wat klinisch wordt gebruikt om long letsel te veroorzaken (> 15 ml/kg; Zie vorig werk20,21). In de richting van een meer klinisch relevant model van VILI, kan intra-bronchiale zuur instillatie, zoals hier beschreven, als eerste worden gebruikt om niet-dodelijke longschade te induceren, gevolgd door mechanische ventilatie bij getijden volumes binnen klinisch bereik (6-12 mL/kg). Dit hypothetische diermodel kan onderzoekers in staat stellen om VILI op een klinisch relevante manier te bestuderen zodra ze ontwikkeld en gevalideerd zijn. Samen benadrukken deze Murine modellen de veelzijdigheid van de selectieve intrabronchiale instillatie methode om eenzijdige Long insulten te genereren die sterk lijken op pathologieën geassocieerd met menselijke longziekten.
Naast het toestaan van selectieve instillatie van verschillende schadelijke agentia op de linker long, vereist de techniek van intra-bronchiale instillatie na tracheostomie geen verlengde training, lange proces tijd of complexe apparatuur, en in ervaren handen veroorzaakt minimale ellende voor de dieren. Desondanks kunnen er verschillende problemen optreden tijdens de selectieve HCl-instillatie procedure die de experimentele resultaten kan beïnvloeden. Onjuiste cannulatie van de linker hoofdstam bronchus kan resulteren in bilaterale long letsel dat de overleving van experimentele muizen vermindert en het gebruik van de rechter Long als een onbeschadigde interne controle constideert. Dit kan worden vermeden door de katheter voldoende naar de linker long te vissen tijdens de cannulatie totdat de weerstand is bereikt. Na de injectie van HCl, moet een bolus van lucht worden geïnjecteerd, de katheter snel verwijderd, en het chirurgische bord gebracht rechtop in een hoek van 60 °. Deze stappen zijn cruciaal om ervoor te zorgen dat het zuur de distale luchtwegen van de linker long bereikt en voorkomt de reflux van zuur in de rechter long en luchtpijp, die proximale letsel kan veroorzaken. Binnen 24 uur na instillatie wordt de verwonding in de linker long diffuus met uitgebreid longoedeem, wat zowel de distale als de proximale linker long beïnvloedt.
Tijdens de ontwikkeling van de methode in volwassen 8-12 week oude muizen, 2,5 ml/kg intra-bronchiale HCL aanzienlijke nog subletale acute long letsel geproduceerd; lagere doses HCl resulten niet in reproduceerbaar en homogeen long letsel. Hoewel we dit model niet hebben uitgevoerd in jongere (bijv. 3-6 weken oud) of oudere muizen (bijv. 10-14 maanden oud), verwachten we dat het gewicht gebaseerde dosering van HCl zal resulteren in een long letsel fenotype vergelijkbaar met wat wordt opgemerkt in 8-12 week oude muizen. We raden onderzoekers aan HCl-doses te titreren om de gewenste mate van long letsel te bereiken voorafgaand aan het uitvoeren van experimenten met muizen bij extremen van gewicht.
Deze selectieve zuur instillatie procedure biedt een niet-dodelijk muriene model van steriele weefsel ontsteking die de behoefte aan ondersteunende zorg, zoals mechanische ventilatie, vermindert. Met verlengde overleving van gewonde muizen heeft de zuur-geïnduceerde ontsteking voldoende tijd om zichzelf op te lossen. De resolutie fase van dit model is gebruikt voor het identificeren van tijdelijk gereguleerde endogene bioactieve lipidenbemiddel kers, genoemd gespecialiseerde Pro-oplossend mediatoren (spms), zoals lipoxin A4 (Lxa4), maresin 1 (MaR1), en protectins6 ,11,12,16. Het toedienen van exogene Spm's aan gewonde muizen versnelt de resolutie van zuur geïnduceerde long letsel door het dempende ontstekingsmechanismen en het bevorderen van catabasis van het gewonde longweefsel. Deze spms bevorderen de klaring van alveolaire oedeem12, verhogen de efferocytose van apoptotische neutrofielen door gerekruteerde macrofagen16, en versnellen de re-epithelialisatie van de luchtwegen en longblaasjes12 te verminderen vasculaire lekkage en weefselhypoxie. In een model van pathogeen-geïnduceerde long letsel vertoonde 15-epi-resolvin D1 ook antimicrobiële acties door verhoogde bacteriële fagocytose door macrofagen en verbeterde bacteriële klaring van de geïnfecteerde longen16. Het onderzoeken van deze endogene afwikkelings mechanismen biedt inzicht in mogelijke nieuwe therapeutische strategieën voor patiënten met ARDS5.
Voor de beste studie van de spatiotemporele regeling van afwikkelings mechanismen zijn in vivo experimentele modellen nodig. Acute long letsel modellen moeten relevante acute ontstekingsreacties en orgaandisfunctie omvatten met betrokkenheid van hostresolutie ter bevordering van moleculaire en cellulaire processen. Deze mechanismen kunnen worden gekwantificeerd met behulp van de vastgestelde resolutie indices22. De selectieve intra-bronchiale instillatie methode voor het genereren van unilaterale acute long letsel is in dit verband nuttig gebleken voor de test endogene resolutie bemiddel kers en trajecten. Toekomstige studies die ons begrip van deze actieve oplossings processen verdiepen, hebben de belofte om tot therapeutische agonisten te leiden die de bioacties van endogene lipidenmediatoren nabootsen om de resolutie van ontstekingen te verbeteren en de morbiditeit te verzachten en sterfte van ARDS en andere belangrijke longziekten.

Acuut respiratoir nood syndroom (ARDS) is een belangrijke oorzaak van acuut respiratoir falen1. Het is een veelvoorkomende en dodelijke of invaliderende ziekte die optreedt bij 10% van alle patiënten die worden toegelaten tot Intensive Care-eenheden wereldwijd2. Volgens de definitie3van Berlijn wordt ARDS gedefinieerd door het acute begin van hypoxische respiratoire insufficiëntie (< 1 week) en bilaterale pulmonale infiltraten op borst radiografen die niet worden verklaard door hartfalen4. De onderliggende Pathobiologie wordt gekenmerkt door een overmatige ontstekingsreactie. De longen kunnen direct gewond raken, zoals bij pneumonie of met maagzuur aspiratie, of indirect, zoals bij sepsis of na meervoudige bloedtransfusies4. Na de eerste belediging vordert de pathogenese van ARDS in drie fasen: exsudatieve, proliferatieve en fibrotische fasen1. Deze fasen worden gekenmerkt door verschillende moleculaire en cellulaire immuun-en reparatie mechanismen die de prognose bepalen voor ARDS-patiënten. Ondersteunende zorg blijft de steun Piler voor ARDS patiënten; op dit moment zijn er geen effectieve farmacologische behandelingen voor ARDS, dus er is een dringende behoefte aan nieuw onderzoek naar deze verwoestende aandoening4.
Disregulatie van de aangeboren immuunrespons tijdens de exsudatieve fase draagt bij tot de acute aanvang van ARDS en geassocieerde respiratoire insufficiëntie1. Potente pro-inflammatoire mediator signalering organiseert de initiële immuunresponsen, wat leidt tot verstoring van de alveolaire-capillaire barrière, diffuus alveolaire oedeem en neutrofiele infiltratie op de plaats van longweefsel letsel4. Bij ARDS, ineffectieve remsignalen voor acute ontsteking predisponeren voor Long falen en kan tijdige catabasis van het gewonde longweefsel5vertragen. Daartoe kan het preklinisch onderzoek naar de endogene initiërende en Pro-Resolution mechanismen van ARDS nieuwe therapeutische strategieën onthullen. Een dergelijk onderzoek vereist zelf beperkte experimentele in vivo-modellen van acute long letsel die nauw lijken op kenmerken van menselijke ARDS, waardoor ondervraging van mechanismen die aan de initiatie-en afwikkelings fasen van weefsel letsel zijn toe te wijzen.
Het Murine-model dat hier wordt gepresenteerd, produceert direct acuut long letsel dat de kardinale pathobiologische processen van exsudatieve ARDS aantoont, namelijk alveolaire-capillaire barrière verstoring en neutrofiele infiltratie. De methode is gebaseerd op selectieve intra-bronchiale instillatie van HCl via de cannulatie van de linker mainstam bronchus, waarbij de verwonding en ontstekingsreactie op de linker long worden gelokaliseerd; de onbeschadigde rechter long kan worden gebruikt als een interne controle voor bepaalde bepalingen van weefsel letsel en ontsteking. Bovendien is eenzijdig long letsel niet-dodelijk en onthult het een afwikkelings programma. Dit biedt een apart venster in de resolutie van longontsteking die kan worden gebruikt voor de identificatie van endogene Pro-oplossend bemiddel kers en cellulaire mechanismen en om nieuwe therapeutische lanen te openen voor ARDS die de resolutie fysiologie benadrukt en Farmacologie.

<table><tbody><tr><td>10x Zinc Fixatiemiddel</td><td>BD Biosciences</td><td>552658</td><td></td></tr><tr><td>2-0 Gevlochten zijden hechtdraad</td><td>Surgical Specialties</td><td>SP118</td><td></td></tr><tr><td>24 G x 3/4" Wegwerp Safelet I.V. Katheter</td><td>Excel</td><td>26751</td><td></td></tr><tr><td>33 mm, 0.22 &micro;m spuitfilter unit</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>4" Lang gekarteld licht gebogen Graefe-forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>4" Lang gekarteld volledig gebogen Graefe-forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>4.5 " Micro dissectieschaart</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td></td></tr><tr><td>6" Crile Wood naaldhouder</td><td>Roboz</td><td>RS-7860</td><td></td></tr><tr><td>60 mL spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis FITC-Ly6G antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-9668-82</td><td>Voorkeurs fluorofoor kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Anti-muis PE-Ly6G antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-9668-82</td><td>Voorkeurs fluorofoor kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Parelsterilisaator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine-oplossing Swabstick</td><td>Betadine</td><td>67618-153-01</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td>NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5</td></tr><tr><td>Duidelijke vlakbodem 96-wells microplaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos's Fosfaat Gebufferde Saline (PBS) zonder Ca2+ of Mg+</td><td>life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Elektrische scheerapparaten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blauwe Kleurstof</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingskussen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur, 37%</td><td>Millipore-Sigma</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Henry-Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Microplaat reader (640, 720 nm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipet tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH sonde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ring stand met verlengingsklem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele Alcohol Prep Pads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Steriele Muis Drape 8" x 8" met Ovale Adhesive Fenestratie</td><td>Steris</td><td>88VCSTF</td><td></td></tr><tr><td>Steriele Nitril Handschoenen</td><td>Kimberly-Clark</td><td>56890</td><td></td></tr><tr><td>Steriele Handdoek Drape</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>Was Gecoate 4-0 Gevlochten Zijden Hechtdraad</td><td>Covidien</td><td>SS733</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AKORN</td><td></td><td>NDC: 59399-111-50</td></tr></tbody></table>

een model van zelf beperkte acute long letsel door unilaterale intra-bronchiale zuur instillatie

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

Selectieve intra-bronchiale instillatie van zoutzuur (HCl) op de Murine linker mainstam bronchus veroorzaakt acuut weefsel letsel met histopathologische bevindingen vergelijkbaar met humaan acuut respiratoir nood syndroom (ARDS). Het resulterende alveolaire oedeem, alveollaire-capillaire barrière schade en leukocyten infiltratie hebben voornamelijk invloed op de linker long, waarbij de rechter long behouden blijft als een onbeschadigde controle en waardoor dieren kunnen overleven. Dit model van zelf beperkte acute long letsel maakt onderzoek mogelijk van weefsel resolutie mechanismen, zoals macrofaag efferocytose van apoptotische neutrofielen en restitutie van alveolaire-capillaire barrière-integriteit. Dit model heeft bijgedragen aan het identificeren van belangrijke rollen voor resolutie agonisten, waaronder gespecialiseerde Pro-oplossend mediatoren (Spm's), die een basis vormen voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen voor patiënten met ARDS.

Selectieve intra-bronchiale HCl-instillatie resulteert in eenzijdig acuut long letsel
De methode van selectieve intra-bronchiale instillatie van HCl in de linker mainstam bronchus wordt geïllustreerd in Figuur 1a. Het daaropvolgende acute long letsel omvat de gehele linker long, en na intraveneuze toediening van EBD en Long perfusie bleef de EBD alleen in de linker long (Figuur 1b). EBD extravasatie in de linker long werd gekwantificeerd en bleek significant verhoogd ten opzichte van Sham selectieve instillatie (figuur 1c; aangepast van Abdulnour et al. 20146). In reactie op Long letsel, circulerende leukocyten diapedese in het ontstoken weefsel. In dit model ondergaan vasculaire neutrofielen trans-endotheliale migratie in het gewonde Long interstitium. Interstitiële neutrofielen geaccumuleerd in de linker long 24 uur na HCl-instillatie, in tegenstelling tot de rechter long waar weinig interstitiële neutrofielen worden waargenomen (figuur 1d). Deze resultaten wijzen erop dat de intra-bronchiale instillatie methode van de selectieve linker onderstam resulteerde in een acute Long blessure aan Murine die grotendeels was gelokaliseerd in de linker long en die pathologische veranderingen produceerde die ook met menselijke ARDS worden gezien, waaronder verhoogde alveolaire-capillair barrière breuk en neutrofiele infiltratie.
Eenzijdige acute long letsel maakt onderzoek van afwikkelings mechanismen mogelijk
Om de resolutie fase van zuur-geïnduceerde acute long letsel te bestuderen, moeten muizen de initiële belediging kunnen overleven. In tegenstelling tot de intratracheale HCl, leidt de instillatie in alleen de linker mainstam bronchus tot een zelf-beperkt letsel met uniforme overleving in anders gezonde muizen. Longen kunnen bij muizen worden verkregen op een vroeg of later tijdstip zoals in Figuur 2a. Long histologie toont weefsel letsel en ontsteking op het orgel en cellulair niveau met exsudatieve ontsteking 24 h na letsel gekenmerkt door gekenmerkt alveolaire oedeem en neutrofiele infiltratie in de linker long. Merk op dat er geen significant letsel of leukocyten instroom is in de onbeschadigde controle rechter Long (Figuur 2a). 72 h na letsel, oedeem en cellulaire infiltraten aanzienlijk verlaagd, wat neerkomt op een oplossing exsudative fase. Alveolaire neutrofielen kunnen worden gecontroleerd door Flowcytometrie (CD45+/Cd68-/F4/80-/Ly6g+/cd11b+) verkregen door gehele Long lavage. Neutrofielen stijgen in de linker long 24 h na de initiële verwonding en daling aanzienlijk op 48 en 72 h (Figuur 2b). Als latere tijdpunten worden onderzocht, zullen de neutrofiele getallen terugkeren naar baseline en mechanismen in latere fasen van catabasis, zoals fibroproliferatieve reacties, kunnen worden bestudeerd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60024/60024fig1v2.jpg"> Figuur 1: selectieve intra-bronchiale HCL-instillatie produceert eenzijdige long letsel, gedefinieerd door alveolaire barrière breuk en neutrofiele infiltratie. A) weergave van de cannulatie van de Murine linker mainstam bronchus voor selectieve instillatie van HCl in de linker long. (B) naar rechts (RL) en linker (LL) longen blootgesteld aan selectieve zuur instillatie en geperfundeerd na intraveneuze Evan 's Blue Dye. C) kwantificering van interstitiële Evan 's blauwe kleurstof van gehomogeniseerde, geperfundeerd Lung 24 h na zure verwonding of schijnvertoning; figuur aangepast van Abdulnour et al. 20146. Waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM, waarbij n ≥ 5. *p < 0,05, Mann-Whitney U test.D) representatieve stroom cytometrie van intravasculaire (I.V.; de 1) en interstitiële (I.S.; de 2) neutrofielen als percentage van de totale CD45+ cellen in verwerkte Long 24 h na zure schade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60024/60024fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60024/60024fig2.jpg"> Figuur 2: eenzijdige acute long letsel is zichzelf aan het oplossen. A) representatieve H & E histologie (10x) van de linker longen verkregen bij naïeve muizen (0 uur) of muizen 24, 48, 72 H na letsel, samen met de bijbehorende rechter long van dezelfde muis (schaalbalk = 250 μm). B) representatieve stroom cytometrie van alveolaire neutrofielen (Ly6G+ CD11b+) verkregen uit gehele Long spoeling als percentage van de totale CD45+ cellen in naïeve (0 h) muizen of muizen 24, 48 en 72 h na zure schade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60024/60024fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Selectieve intra-bronchiale zuur instillatie naar de linker long bij muizen resulteert in unilaterale en zelf beperkte acute longschade die het menselijk acute respiratoir Distress syndroom (ARDS) veroorzaakt door maagzuur aspiratie.

Een model van zelf beperkte acute long letsel door unilaterale intra-bronchiale zuur Instillatie

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...

De selectieve intra-bronchiale methode is significant omdat het onderzoekers een reproduceerbaar en niet-dodelijk model biedt voor het bestuderen van acute longletsel, een belangrijke oorzaak van acuut ademhalingsnoodsyndroom bij de mens. Het voordeel van de selectieve intra-bronchiale techniek is de lokalisatie van de ontstekingsreactie op de linkerlong die de rechterlong aanbiedt als een ongewonde controle en het minimaliseren van dierenleed. Het aantonen van deze procedure zal Alexander Tavares, een technicus en pregraduate student in ons lab.Om 0,1 normaal zoutzuur voor te bereiden, voeg 11 milliliter dubbel gedestilleerd water toe aan een amberglasfles, gevolgd door de langzame toevoeging van een milliliter van 37%12 normaal zuur. Voeg vervolgens langzaam vier milliliter van een normale zuurbewerkingsbouillon toe in 35 milliliter dubbel gedestilleerd water in een conische buis van 50 milliliter. Gebruik vervolgens een elektronische pH-sonde om de pH van de 0,1 normale voorraadoplossing te meten, waarbij u een pH van 1,1 met behulp van natriumhydroxide of zuurvoorraadoplossing meet, indien nodig tot een eindvolume van 40 milliliter.Voordat u met de procedure begint, filtert u één tot twee milliliter van de zuuroplossing via een steriel 0,22 microliterfilter in een steriele microcentrifugebuis en bevestigt u een gebrek aan reactie op pijnreflex bij een verdoofde muis. Met behulp van elektrische tondeuses in langzame neerwaartse slagen zachtjes scheren het chirurgische gebied op het ventrale oppervlak van de muis onder de kin in het cervicale gebied van de keel. Verwijder losse haren, en wattenstaafje de blootgestelde huid met drie opeenvolgende 10%povidone-jodium oplossing en 70% isopropyl alcohol swabs.Wanneer de huid is voorbereid, plaats de muis in de supine positie op een schone chirurgische raad, en bedek het dier met een steriele chirurgische gordijnen. Maak een longitudinale opening van 0,5 centimeter in de huid boven de luchtpijp en speekselklieren en gebruik licht gebogen getande getande tangen om de huid zorgvuldig in te trekken. Scheid voorzichtig de speekselklieren om de tracheale spieren bloot te leggen en gebruik licht gebogen getande getande tangen om de paratracheale spieren voorzichtig uit elkaar te duwen.Plaag de fascia rond de luchtpijp tot de kraakbeenachtige ringen van de luchtpijp volledig zijn blootgesteld, en gebruik volledig gebogen gekartelde tangen om het bindweefsel tussen de retrotrachea en de retrofascia weg te werken. Schuif volledig gebogen getande tangen achter de luchtpijp en til de luchtpijp op. Zodra het puntje van de tang achter de luchtpijp is, pak een 10 tot 15 centimeter stuk van 4-0 gevlochten zijdehechting met de uiteinden van de tangen en trek de hechting achter de luchtpijp, zodat er een gelijkmatige lengte aan weerszijden.De chirurgische raad kan worden gedraaid om het chirurgische gebied dichter bij de dominante hand voor de volgende stappen te brengen. Trek vervolgens voorzichtig de uiteinden van de hechting naar het voorste van de muis en houd de uiteinden op zijn plaats. Voor cannulation van de linker mainstem bronchus, bloot de naald van een 24-gauge door 3/4-inch angiocatheter en steek de naald schuine kant omhoog in het binnengebied van de luchtpijp tussen de eerste en tweede tracheale ringen.Wanneer de naaldpunt kan worden gevisualiseerd in het tracheale lumen, laat u de hechting los en vervolgens de canule over de naald in de luchtpijp die naar de linkerzijde van de muis hengelt. Wanneer weerstanden ondervonden, trek de naald. Zodra de canule op zijn plaats is, stevig grijpen de injectiepoort om te voorkomen dat de katheter verschuiven en zet een P-200 micropipette tip in de poort.Breng vervolgens 50 microliter van de gefilterde 0,1 normale zuuroplossing in de katheter, gevolgd door een gelijk volume lucht. Deze stap vereist nauwkeurige manipulatie van de canule, terwijl de luchtwegen wordt belemmerd, en moet snel en soepel worden voltooid om de juiste luchtstroom te herstellen en de schade aan de luchtwegen te minimaliseren. Trek de katheter snel terug en kantel de chirurgische raad onder een hoek van 60 graden.Na 30 seconden, leg de chirurgische raad plat, en verwijder de hechting van achter de luchtpijp. Gebruik dan een 4-0 wax-gecoate gevlochten zijde hechting om de huid incisie te sluiten met twee tot drie steken. De acute longschade als gevolg van intra-bronchiale zuur instillatie omvat de gehele linker long.Inderdaad, na intraveneuze toediening van Evans blauwe kleurstof en longperfusie, wordt de kleurstof alleen gedetecteerd in de linkerlong. Kwantificering van de kleurstof extravasatie in de linker long is aanzienlijk verhoogd ten opzichte van schijnselectieve instillatie. Interstitiële neutrofielen accumuleren 24 uur na zuurinstillatie in de linkerlong in tegenstelling tot de rechterlong waarin weinig interstitiële neutrofielen worden waargenomen.Long histologie onthult weefselletsel en ontsteking op het orgaan en cellulaire niveaus met exsudatieve ontsteking 24 uur na letsel zoals gekenmerkt door gemarkeerde alveolaire oedeem en neutrofiele infiltratie in de linker long. Merk op dat het ontbreken van significante verwonding of leukocyten toevloed in de niet-gewonde controle juiste long. 72 uur na de verwonding zijn het oedeem en de cellulaire infiltreren aanzienlijk verminderd, wat neerkomt op een oplossende exsudatieve fase.Zoals beoordeeld door flow cytometrie, alveolaire neutrofielen verhogen in de linker long 24 uur na de eerste schade, en aanzienlijk dalen op 48 en 72 uur. Het is belangrijk om de katheter in de luchtpijp te visualiseren voordat u verdergaat. Hoek de canule naar de linker hoofdstam bronchus tijdens het inbrengen en volg de zure instillatie met 50 microliter lucht.Bronchoalveolaire lavage vloeistofanalyse, longantologie, immuuncelfenotypering door stromingscytometrie, live muisbeeldvorming en longfunctietesten kunnen allemaal worden uitgevoerd om de ontsteking en resolutie te beoordelen. De ontwikkeling van dit zelfgelimiteerde model van acute longletsel heeft onderzoekers in staat gesteld om een belangrijke bijdrage te leveren aan het gebied van resolutiebiologie. Vergeet niet dat geconcentreerd zoutzuur gevaarlijk is en dat het moet worden behandeld in een chemische kap het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

a-model-self-limited-acute-lung-injury-unilateral-intra-bronchial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een muismodel voor de ventilator geïnduceerde longschade is een belangrijk instrument om een ​​acute longbeschadiging...

Druk gecontroleerde ventilatie te Acute Lung Injury in Muizen Braken

We hebben een muislongletselmodel ontwikkeld door intra-tracheale injectie van bacteriën Pseudomonas aeruginosa. Dit model bootst longletsel tijdens pneumonie na en is klinisch relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Dit protocol induceert acute longschade bij een muis met een hoge nauwkeurigheid die vergelijkbaar is met de pathogenese van acide pneumonitis die bij mensen wordt waargenomen. We genereren een maximale acute niet-dodelijke lage pH-longschade en houden rekening met verschillen in de anatomische ademhalingsstructuur van knaagdieren-mensen door middel van een open tracheale opening gekoppeld aan circumferentiële drukontlasting.

Open Tracheostomie Maagzuur Aspiration muizenmodel van Acute Lung Injury Resultaten in Maximal Acute Lung Injury nonlethal

Hier gepresenteerd is een stap-voor-stap procedure om acute longschade in muizen induceren door directe intratracheal lipopolysaccharide instillatie en uit te voeren FACS analyse van bloedmonsters, bronchoalveolaire lavage vloeistof, en longweefsel. Minimale invasieve, eenvoudige handling, goede reproduceerbaarheid, en titratie van de ziekte ernst zijn voordelen van deze aanpak.

Inducerende acute Long blessure bij muizen door directe Intratracheal lipopolysaccharide instillatie

We beschrijven een model van zoutzuur-geïnduceerd acute respiratory distress syndrome (ARDS) bij biggen die sedatie krijgen met gehalogeneerde middelen, isofluraan en sevofluraan, via een apparaat dat wordt gebruikt voor geïnhaleerde intensive care-sedatie. Dit model kan worden gebruikt om de biologische mechanismen van gehalogeneerde middelen op longletsel en -herstel te onderzoeken.

Levering van gehalogeneerde agent in varkensmodel van acuut respiratoir distress-syndroom via een apparaat van het type intensive care-afdeling

Een combinatie van oppervlakteactieve stof washout met 0,9% zoutoplossing (35 ml/kg lichaamsgewicht, 37 °C) en een hoge getijdevolumeventilatie met een lage PEEP om matig beademingsgeïnduceerd longletsel (VILI) te veroorzaken, resulteert in experimenteel acuut respiratoir distress syndroom (ARDS). Deze methode biedt een model van longletsel met lage/ beperkte rekrutering om het effect van verschillende ventilatiestrategieën voor langere periodes te bestuderen.

Oppervlakteactieve depletie in combinatie met schadelijke ventilatie resulteert in een reproduceerbaar model van het Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Het huidige protocol beschrijft een longletselmodel bij muizen die oliezuur gebruiken om acuut respiratoir distress syndroom (ARDS) na te bootsen. Dit model verhoogt de ontstekingsmediatoren op oedeem en vermindert de longcompliantie. Oliezuur wordt gebruikt in de zoutvorm (oleaat) omdat deze fysiologische vorm het risico op embolie vermijdt.

Muismodel van door oliezuur geïnduceerd acuut respiratoir distress-syndroom

Dit manuscript beschrijft de opstelling van een infectieus model van longontsteking bij muizen en de respectieve karakterisering van letselresolutie, samen met methoden voor het kweken van bacteriën en intratracheale instillatie. Een nieuwe benadering met behulp van hoogdimensionale flowcytometrie om het immuunlandschap te evalueren, wordt ook beschreven.

Experimenteel model om de resolutie van longontsteking te evalueren

Hier stellen we een protocol voor intratracheale lipopolysaccharide (LPS) levering via niet-invasieve orofaryngeale endotracheale intubatie. Deze methode minimaliseert het trauma van de chirurgische procedure voor het dier en levert LPS nauwkeurig af aan de luchtpijp en vervolgens aan de longen.

Niet-invasieve intratracheale lipopolysaccharide-instillatie bij muizen

In deze studie is aangetoond dat een niet-invasieve endotracheale installatietechniek ALI bij ratten ontwikkelt met behulp van een basislaryngoscoop om een precieze LPS-afgifte aan de longen te garanderen. De LPS wordt toegediend via een endotracheale buis met behulp van een laryngoscoop. De omvang van het longletsel wordt op meerdere tijdstippen beoordeeld.

Niet-invasieve endotracheale toediening van lipopolysaccharide om acute longschade bij knaagdieren te induceren

Leer een reproduceerbaar model voor acuut longletsel bij muizen door selectieve intra-bronchiale zuurinstillatie. Deze methode bootst ARDS na en minimaliseert dierlijk lijden door lokalisatie naar de linkerlong.

Een model van zelf beperkte acute long letsel door unilaterale intra-bronchiale zuur Instillatie

Meer video's verkennen