Name: Een minimaal invasieve laesie techniek voor de intrinsieke spieren van de Odontophore van Aplysia californica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Leer een minimaal invasieve chirurgische techniek om diepe spieren in het voedingsapparaat van Aplysia californica te benaderen. Deze methode maakt in vivo manipulatie mogelijk om motorische controle en biomechanica te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen het harde werk erkennen dat Sherry Niggel, SiSi Lu en Joey Wu hebben gestoken in het verbeteren en valideren van deze protocollen. Dit werk werd ondersteund door NSF Grant IOS 1754869.

Aplysie is ongewervelde en wordt dus niet onderworpen aan de iauc-goedkeuring. Om het ongemak voor dieren tot een minimum te beperken, moet u ervoor zorgen dat ze volledig verdoiliseerd zijn voordat de hieronder beschreven chirurgische technieken worden toegepast.
1. selectie van dieren en Anesthetisering
<ol><li>Selecteer een actief dier door het zeewier aan te bieden en bevestig dat de bijt intervallen niet groter zijn dan tussen 3 en 5 sec.</li>
	<li>
Anesthetiseer het dier met 0,333 molaire magnesium chloride (zie tabel 1) door het injecteren in de buurt van het hoofd met een 18 G naald op een 60 mL spuit zodat de hoogste concentratie anestheticum rond de buccale massa zal zijn.
	<ol>
<li>Zorg voor het doordringen van zowel het buitenste epitheel en de binnenste weefsellaag met de naald. Zorg ervoor dat de injectie ruwweg onder de rhinophore, halverwege tussen de rhinophore en de voet, en de naald moet schuin binnenkomen, wijzend in de richting van de kaken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na 10 min, zachtjes proberen om een PIN in de Gill en rhinophore invoegen, controleren of deze niet intrekken, om voldoende anesthetisering.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de lippen en kaak van de slug ontspannen zijn, zodat de odontophore kan worden blootgesteld. Opmerking: De rimpel op de lippen van Fig. 2a geeft aan dat de lippen en kaak van het dier niet voldoende ontspannen zijn om de chirurgische ingreep zonder schade te kunnen uitvoeren. De gladde, ontspannen lippen van Figuur 2b geven aan dat de kaken volledig ontspannen zijn.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig2.jpg"> Figuur 2: spanning en ontspanning in Anesthetized Aplysia monden. A) aplysie die een hoge mate van spierspanning rond de lippen vertoont. Dit correleert met kaak spanning en contraaangeeft verder te gaan met de operatie. B) aplysia met ontspannen lippen, met de binnenkant van kaken (lichtgrijs). Kleuren weer overeenkomen met die waargenomen in het dier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<ol start="5"><li>Als de lippen van een dier niet ontspannen zijn, Injecteer dan 30 mL magnesium chloride en wacht nog eens 5 min. Als dit niet resulteert in lip-ontspanning, terug te keren naar een geïsoleerde container met goede waterstroom om ze te herstellen (zie stap 4) en ga verder met een ander dier.</li>
</ol>2. blootstellen van het Radulaire oppervlak
<ol><li>Plaats de slug zodanig dat het hoofd naar beneden hangt, waardoor de buccale massa zich tegen de kaken kan vestigen.</li>
	<li>Druk met de duim en wijsvinger om de buccale massa naar de kaken te duwen en houd de buccale massa op zijn plaats.</li>
	<li>Draai de kaken zodat deze zichtbaar zijn. Op hetzelfde moment, handhaven van de druk op de buccale massa, zodat de boeg van de buccale massa zichtbaar door de kaken. (Figuur 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig3.jpg"> Figuur 3: ondersteuning van de buccale massa tegen de binnenkant van de kaken. Vingers ondersteunen de buccale massa die tegen de binnenrand van de kaken is geduwd tot de punt van de boeg zichtbaar is. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<ol start="4"><li>Werk voorzichtig de uiteinden van de stompe Tang in de spleet van de odontophore en gebruik ze om het radulaire oppervlak door de kaken te hetsen. Als de kaken niet voldoende ontspannen zijn, gebruik dan de tang om de rand van de spleet voorzichtig te vatten om dit proces te ondersteunen. Let op: Deze druk riskeert meer schade aan het dier.</li>
	<li>Zodra het oppervlak is blootgesteld, werk de kaken duidelijk van het voorste gedeelte van het radulaire oppervlak helemaal rond de omtrek. Hierdoor wordt de odontophore minder snel teruggetrokken (Figuur 4). Zorg ervoor dat niet meer dan de helft van de wanden van de odontophore wordt blootgesteld.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig4.jpg"> Figuur 4: partiële eversie van de Odontophore. Het radulaire oppervlak is volledig blootgesteld, maar de zijkanten van de odontophore zijn niet blootgelegd, waardoor dit slechts een gedeeltelijke eversion. Verdere eversie zal waarschijnlijk resulteren in schade aan het dier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Opmerking: Een volledige eversie van de odontophore zal grote spier schade veroorzaken waarvan de dieren erg traag zijn om te herstellen.
3. chirurgische incisies
<ol><li>
Zodra het radulaire oppervlak volledig is blootgesteld, regelt u de slug onder een dissectie bereik voor de operatie.
	<ol>
<li>U ook een brede rubberen band en een derde hand gebruiken om de kaken en het radulaire oppervlak voor de operatie te stabiliseren, vooral tijdens het leren. Dit, echter, voegt tijd en verhoogde weefselschade aan de procedure, waardoor het minder ideaal op de lange termijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats het radulaire oppervlak zodanig dat de gespleten zijde de onderzoeker gezichten.</li>
	<li>Pak het radulaire oppervlak voorzichtig in de buurt van de radular Base, zodat een horizontale vouw loodrecht op de anatomische plooi wordt gevormd. Gebruik een fijne schaar om door deze vouw te snijden, waardoor een incisie langs de anatomische kreuken wordt (Figuur 5).</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig5.jpg"> Figuur 5: plaats van incisie op het Radulaire oppervlak. A) radculair oppervlak, met een incisie. B) radculair oppervlak met cirkels die laten zien waar de strengen van de bilaterale i7-spier hechten; gestippelde lijnen tonen de locatie van de dalende spieren onder het radulaire oppervlak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<ol start="4"><li>Verleng deze initiële incisie tot 3-5 cm om toegang te geven tot het inwendige van de buccale massa.</li>
	<li>Pas het licht aan zodat het direct door deze incisie wijst.</li>
	<li>Deel de randen van de incisie zodat de achterkant van het lumen van de odontophore en de dunne verticale strengen van de i7-spier zichtbaar zijn. (Figuur 6)</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig6.jpg"> Figuur 6: locatie van i7 door het Radulaire oppervlakte incisie. Kijkend door de incisie, kunnen beide strengen van i7 worden gezien tussen de binnenste oppervlakken van I4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<ol start="7"><li>Reik door de incisie, pak beide strengen van i7, en trek ze omhoog door de incisie, waar zo veel als de spier kan worden weggesneden als praktisch is (Figuur 7).</li>
</ol><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig7.jpg"> Afbeelding 7: de i7-spier streng door de incisie trekken. De i7-spier is zeer elastisch en kan omhoog worden getrokken door de incisie voor verwijdering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Opmerking: Met de praktijk is het meestal effectiever om i7 te lokaliseren door te voelen dan door het zicht.
4. postoperatieve zorg
<ol><li>Nadat laesies zijn uitgevoerd, pak de voorste tentakels en duw omlaag op het radulaire oppervlak om de slug terug te keren naar de oorspronkelijke configuratie.</li>
	<li>Plaats postoperatieve dieren in een beschermde omgeving met een goede waterstroom. Verhoogde oxygenatie versnelt het herstel. Zorg ervoor dat de dieren alert en responsief zijn op de dag na de operatie. Als dit niet het geval is, kan worden aangenomen dat ze niet worden hersteld. Opmerking: Dieren zullen meestal beginnen te voeden op de eerste of tweede dag na de operatie. Zelfs dieren die moeite hebben met bijten moeten zeewier worden aangeboden, want het is onze anekdotische waarneming dat het herstel van een dier wordt verbeterd door zijn pogingen om te eten.</li>
</ol>5. voor Subradulaire vezel laesie
<ol><li>Volg de stappen van 1,1 tot en met 3,5</li>
	<li>Steek de punt van een klein recht scalpel blad (#11 of iets dergelijks) door de incisie met de scherpe rand naar boven gekanteld. Schuif de fijne spiervezels voorzichtig van de onderzijde van het radulaire oppervlak. (Figuur 8).</li>
</ol><img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig8.jpg"> Figuur 8: de Subradulaire vezels Lesioneren. De rand van het scalpel-blad wordt naar boven gekanteld door de incisie aan de onderzijde van het radulaire oppervlak, zodat het zachtjes de sub-radulaire vezels kan wegkrabben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<ol start="3"><li>Ga terug naar stap 4,1.</li>
</ol>

<ol><li>Pinsker, H., Kupfermann, I., Castellucci, V., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+and+Dishabituation+of+the+GM-Withdrawal+Reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Habituation and Dishabituation of the GM-Withdrawal Reflex in Aplysia.</a> Science. 167, 1740-1742 (1970).</li>
<li>Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Behavior+in+Aplysia%3A+A+Simple+System+for+the+Study+of+Motivation%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Biology%22%5BJournal%5D)">Feeding Behavior in Aplysia: A Simple System for the Study of Motivation.</a> Behavioral Biology. 10, 1-26 (1974).</li>
<li>Susswein, A. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+as+a+regulator+of+behavior%3A+New+ideas+from+Aplysia+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide as a regulator of behavior: New ideas from Aplysia feeding.</a> Progress in Neurobiology. 97, 304-317 (2012).</li>
<li>Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aplysia+feeding+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Scholarpedia%22%5BJournal%5D)">Aplysia feeding biomechanics.</a> Scholarpedia. 2, 4165(2007).</li>
<li>Neustadter, D. M., Drushel, R. F., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinematics+of+the+buccal+mass+during+swallowing+based+on+magnetic+resonance+imaging+in+intact%2C+behaving+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinematics of the buccal mass during swallowing based on magnetic resonance imaging in intact, behaving Aplysia californica.</a> Journal of Experimental Biology. 205, 939-958 (2002).</li>
<li>Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinematics+of+multifunctionality%3A+comparisons+of+biting+and+swallowing+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica.</a> Journal of Experimental Biology. 210, 238-260 (2007).</li>
<li>Brezina, V., Evans, C. G., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+membrane+ion+currents+of+a+model+molluscan+muscle%2C+the+accessory+radula+closer+muscle+of+Aplysia+california.+I.+Hyperpolarization-activated+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the membrane ion currents of a model molluscan muscle, the accessory radula closer muscle of Aplysia california. I. Hyperpolarization-activated currents.</a> Journal of Neurophysiology. 71, 2093-2112 (1994).</li>
<li>Evans, C. G., Rosen, S., Kupfermann, I., Weiss, K. R., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Radula+Opener+Neuromuscular+System+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Radula Opener Neuromuscular System in Aplysia.</a> Journal of Neurophysiology. 76 (2), 1267-1281 (1996).</li>
<li>Cullins, M. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+Fabrication+and+Implantation+in+Aplysia+californica+for+Multi-channel+Neural+and+Muscular+Recordings+in+Intact%2C+Freely+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals.</a> Journal of Visualized Experiment. (40), 1791(2010).</li>
<li>Dudek, F. E., Cobbs, J. S., Pinsker, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bag+cell+electrical+activity+underlying+spontaneous+egg+laying+in+freely+behaving+Aplysia+brasiliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Bag cell electrical activity underlying spontaneous egg laying in freely behaving Aplysia brasiliana.</a> Journal of Neurophysiology. 42, 804-817 (1979).</li>
<li>Hermann, P., Maat, A., Jansen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neural+Control+of+Egg-Laying+Behaviour+in+the+Pond+Snail+Lymnaea+Stagnalis%3A+Motor+Control+of+Shell+Turning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Neural Control of Egg-Laying Behaviour in the Pond Snail Lymnaea Stagnalis: Motor Control of Shell Turning.</a> Journal of Experimental Biology. 197, 79-99 (1994).</li>
<li>Jansen, R. F., Pieneman, A. W., Ater Maat, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Generation+in+the+Buccal+System+of+Freely+Behaving+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Pattern Generation in the Buccal System of Freely Behaving Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Neurophysiology. 82, 3378-3391 (1999).</li>
<li>Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+the+appetitive+and+consummatory+phases+of+feeding+behavior+in+Aplysia%3A+a+lesion+study%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of the appetitive and consummatory phases of feeding behavior in Aplysia: a lesion study.</a> Behavioral Biology. 10, 89-97 (1974).</li>
<li>Scott, M. L., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+consummatory+feeding+behavior+after+bilateral+lesions+of+the+cerebral-buccal+connectives+in+Aplysia+california%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Recovery of consummatory feeding behavior after bilateral lesions of the cerebral-buccal connectives in Aplysia california.</a> Brain Research. 585, 272-274 (1992).</li>
<li>de Boer, P. A., Jansen, R. F., ter Maat, A., van Straalen, N. M., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinction+between+retractor+and+protractor+muscles+of+the+freshwater+snail%E2%80%99s+male+organ+has+no+physiological+basis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The distinction between retractor and protractor muscles of the freshwater snail’s male organ has no physiological basis.</a> Journal of Experimental Biology. 213, 40-44 (2010).</li>
<li>Chiel, H. J., Weiss, K. R., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+identified+histaminergic+neuron+modulates+feeding+motor+circuitry+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An identified histaminergic neuron modulates feeding motor circuitry in Aplysia.</a> Journal of Neuroscience. 6, 2427-2450 (1986).</li>
<li>Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+patterns+of+the+B31%2FB32+pattern+initiators+innervating+the+I2+muscle+of+the+buccal+mass+during+normal+feeding+movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica.</a> Journal of Neurophysiology. 75, 1309-1326 (1996).</li>
<li>Kier, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+hydrostatic+skeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The diversity of hydrostatic skeletons.</a> Journal of Experimental Biology. 215, 1247-1257 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De meest kritische stappen binnen het protocol zijn de noodzaak om ervoor te zorgen dat het dier volledig verdoiliseerd is, en dat de eversie van de buccale massa net genoeg is om toegang te krijgen tot de onderliggende spieren. Het kan enige oefening nodig om deze stappen te perfectioneren, maar zodra ze worden beheerst, de opbrengst van operaties is waarschijnlijk groter dan 85% van alle experimenten gedaan. De belangrijkste manier om het protocol correct te wijzigen en op te lossen is om tijd te besteden aan het doen van dissecties van de buccale massa, zodat de locaties van de inwendige spieren volledig duidelijk zijn voor de onderzoeker. Omdat de voorgestelde incisie door het radulaire oppervlak onvermijdelijk enige schade aan de onderliggende sub-radulaire vezels veroorzaakt, kan het gepast zijn om de exacte locatie van de incisie te wijzigen om specifieke gebieden van deze vezels te vermijden.
Een beperking van de chirurgische techniek is dat het niet-specifieke effecten kan hebben op het voeren van reacties, zoals de sterkte van het trekken. Een manier om deze beperking te overwinnen is om dieren te laten dienen als hun eigen controles. Bovendien is het van cruciaal belang om een Sham-laesie groep te hebben die wordt onderworpen aan het gehele chirurgische protocol, behalve voor het verwijderen van de specifieke spier (d.w.z. i7 of de Srf's). Door deze suggesties te volgen, zal een onderzoeker de effecten van variabiliteit tussen dieren verminderen en een intrinsieke maatstaf van de niet-specifieke effecten van chirurgie hebben.
Eerder werk heeft benaderingen gebruikt door de lichaams wand om te laesie of opnemen van zenuwen13,14, of spieren15,16,17. In ons laboratorium, we hebben anekdotische waargenomen dat lichaams muur incisies vaak gepaard gaan met een significant verlies van Hemolymfe en dus van lichaams volume. Dieren vereisen vaak enkele dagen om te herstellen van deze, en als het lichaam wand laesie niet zorgvuldig wordt gehecht, dieren kunnen niet herstellen. Bovendien onthult een postmortemkeuring van de dieren een aanzienlijke littekenvorming rond de incisie en een sterke immuunrespons (anekdotische waarnemingen). In tegenstelling, dieren vertonen geen verlies van Hemolymfe of verandering in lichaams volume na herstel van het protocol hier beschreven (op basis van waarnemingen in 96 dieren).
Toekomstige toepassingen van de techniek kunnen deze uitbreiden naar andere spieren binnen het voeder apparaat van Aplysia en naar andere dieren. We hebben ons geconcentreerd op het verwijderen van de i7-spieren en sub-radulaire vezels. Deze zelfde algemene chirurgische technieken bieden ook toegang tot de meeste andere spieren van de odontophore. Sommige hiervan, zoals het inwendige gedeelte van de i5-spier, zijn het best toegankelijk via het radulaire oppervlak. Anderen, zoals de binnenste folders van I4, kunnen beter worden bereikt door het uitwendige epitheel van de odontophore. We hebben voorbereidende proeven gemaakt waarbij een incisie onder de radulaire spleet van de gedeeltelijk veroorzaakte odontophore toegang mogelijk maakte tot een geslepen haak die vervolgens kon worden gebruikt om een andere spier binnen de odontophore, de spier i88, te laten vallen. Omdat het chirurgische protocol dat hier wordt beschreven, de hoofd lichaamsholte niet opent, is er geen hechten vereist.
Het protocol dat we hebben beschreven, kan van algemeen belang zijn voor andere onderzoekers die werken aan weke delen structuren die anders moeilijk te manipuleren zouden zijn, bijvoorbeeld het Voer apparaat van andere weekdieren. Meer in het algemeen zou dit protocol andere nieuwe chirurgische benaderingen voor de analyse van zachte structuren zoals tongen, Trunks of tentakels18kunnen suggereren.

Het voersysteem van aplysia californica heeft een lange geschiedenis van gebruik als een modelsysteem voor het begrijpen van leren en geheugen1, gemotiveerd gedrag2,3, en de interactie tussen gedrag, biomechanica en neurale controle tijdens het voeden4. Het heeft zeer toegankelijke neurale circuits, met een relatief klein aantal grote, identificeerbare neuronen. Het dier heeft een semi-open bloedsomloop, waardoor het mogelijk is om toegang te krijgen tot veel van zijn interne structuren zonder aanzienlijke schade te veroorzaken. Het is ook robuust voor vele manipulaties zowel in vivo en in vitro, waardoor het een zeer Tractable model voor de analyse van gedrag en neurale circuits.
Om de neurale patronen te begrijpen die aanleiding geven tot voedingsgedrag, is het belangrijk om de onderliggende mechanica van de zachte structuur te beschrijven die het voedings orgaan vormt, de buccale Mass4. Hoewel er werk is gedaan om de buitenste spieren te karakteriseren die de buccale massa5,6vormen, zijn de binnenste spieren van de onderliggende structuur binnen de buccale massa die het oppervlak van de grasper, de odontophore, regelt, grotendeels ontoegankelijk voor in vivo experimenten. Hoewel er in vitro studies zijn geweest over de functies van sommige van deze spieren7,8, het gebrek aan directe toegang tot deze spieren heeft het moeilijk gemaakt om hun rol in intact te bestuderen, dieren te gedragen.
De meeste technieken voor het implanteren van elektroden of laesies in aplysie of soortgelijke slakken scan vereisen dat de lichaams wand wordt geopend9,10,11,12. Het openen van de lichaams wand veroorzaakt epitheel letsel, en de incisie moet veilig worden verzegeld om te voorkomen dat Hemolymfe ontsnappen. Er worden nog ernstigere moeilijkheden gesteld bij het bereiken van de binnenste spieren van de grasper van Aplysie (spieren die aan het radulaire oppervlak of binnen de odontophore liggen): na het betreden van de hoofd lichaamsholte moet men dan door een aantal gedeelte van de spier wand van de buccale massa om toegang te krijgen tot de inwendige structuren (Figuur 1a). Dit geaccumuleerde letsel en moeilijkheden van de toegang heeft de aanpak via conventionele middelen problematisch gemaakt, omdat dieren niet goed herstellen van deze operaties (van dieren met volledige eversies, slechts 17% herwonnen elke voeding vermogen, N = 12. Rond 85% van de niet-everted dieren herwonnen de mogelijkheid om te voeden, N = 84).
De i7-spier, die is gekarakteriseerd als een radulaire opener8, is diep in de odontophore zelf, verdere complicerende toegang. Het strekt zich uit tussen de basis van de radulaire stalken (figuur 1c) en de onderzijde van het radulaire oppervlak, door een lumen in de odontophore (figuur 1c). Aan drie zijden van de i7 spieren zijn muren van de spier, en de vierde wand bestaat uit de radulaire Stalk. Voor de toepassing van een biomechanische studie zou een ernstige aantasting van een van deze structuren de normale werking van het voeder apparaat in gevaar brengen. We ontwikkelden een nieuwe aanpak van het werken van de odontophore uit door de kaken, en het uitvoeren van de operatie door middel van een incisie naar het dunne, kraakbeenachtige radulaire oppervlak, dat het mogelijk maakte om de i7 spier te laesie, evenals onlangs beschreven fijne spiervezels die ren net onder het radulaire oppervlak, waarnaar we verwijzen als de sub-radulaire vezels (figuur 1c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig1.jpg"> Figuur 1: anatomische overzicht. A) plaats van de buccale massa in aplysie. B) uitwendige anatomie van odontophore. Het oppervlak van radula en radular SAC zijn geel; spieren die de odontophore samenstellen, worden in rood weergegeven op basis van hun werkelijke kleuren. C) Sagittaal gedeelte van odontophore, met de locatie van sub-radulaire vezels (gebogen roze lijn) en i7-spier (rechte roze lijn). Dwarsdoorsnede van de i6 spier wordt weergegeven in donkerrood. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Blunt forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11210-10</td><td>2 paar</td></tr><tr><td>Scalpel blade (#11)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Webcam</td><td>Logitech</td><td>c920</td><td>voor het opnemen van gegevens</td></tr></tbody></table>

een minimaal invasieve laesie techniek voor de intrinsieke spieren van de odontophore van aplysia californica

A Minimally Invasive Lesion Technique for Muscles Intrinsic to the Odontophore of Aplysia californica

Aplysia californica is een modelsysteem voor het bestuderen van de neurale beheersing van leren en gedrag. Dit dier heeft een semi-open bloedsomloop, waardoor het mogelijk is om toegang te krijgen tot veel van zijn interne structuren zonder aanzienlijke schade te veroorzaken. Veel manipulaties kunnen zowel in vivo als in vitro gemakkelijk worden uitgevoerd, waardoor het een zeer Tractable model is voor de analyse van gedrag en neurale circuits. Om beter inzicht te krijgen in de functies van de spieren binnen de voedende grasper, hebben we een techniek ontwikkeld om ze te lesioneren zonder de hoofd lichaamsholte van het dier te openen of de buitenste lagen van het voedings orgaan te beschadigen (d.w.z. de buccale massa). In deze techniek wordt de grasper gedeeltelijk binnengejaagd, waardoor directe toegang tot de spier massa mogelijk is. Met deze procedure kunnen dieren snel en betrouwbaar herstellen. Dit heeft het mogelijk gemaakt om de i7-spieren en sub-radulaire vezels te laesie, waardoor we kunnen aantonen dat beide spieren aanzienlijk bijdragen aan de opening in vivo.

Vorig werk had gesuggereerd dat de i7-spier droeg bij aan de opening van de grasper8. Onze eigen anatomische studies suggereerden dat de sub-radulaire vezels ook kunnen bijdragen aan de grasper opening. Om deze hypotheses te testen, werden dieren geïnduceerd om beten te genereren, zowel voor als na het ontvangen van een chirurgische ingreep. Schijn dieren werden onderworpen aan alle chirurgische stappen, waaronder de incisie in het radulaire oppervlak, maar geen inwendige spieren werden verwijderd. Dieren die aan een i7-laesie onderworpen waren, hadden beide i7-spieren verwijderd. Dieren die aan een subradulaire vezel laesie onderworpen waren, hadden ~ 25% van de sub-radulaire vezels onmiddellijk onder de incisie verwijderd. Schijn laesies hadden geen significant effect op de breedte van de opening op het hoogtepunt van bijten, terwijl de laesies van zowel i7 als sub-radulaire vezels de beet breedte significant reduceerde (Figuur 9).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60030/60030fig9.jpg"> Figuur 9: resultaten van laesies bij openingsbreedte tijdens piek bijten. Getoonde gegevens zijn de verschillen tussen de gemiddelde genormaliseerde openingsbreedte van de radula voor en na de chirurgische ingreep voor 5 dieren in elk van de 3 groepen (Sham, i7 laesie, of SRF laesie), waarbij elk dier als eigen controle fungeert. Gemiddelden werden genomen van 5 beten vóór, en 5 beten na de chirurgische ingreep om het gemiddelde genormaliseerde verschil te bepalen. Openingsbreedte was de afstand van het centrum van radula tot de radulaire rand bij de piek tractie, genormaliseerd door de afstand van het binnenste oppervlak van de radulaire basis tot de gespleten zijranden van het radulaire oppervlak. De verschillen worden weergegeven als de gemiddelden plus of min de standaarddeviatie. Nadat werd vastgesteld dat de verschil gegevens normaal werden verdeeld, werd de waarschijnlijkheid dat de laesie geen effect had, bepaald (d.w.z. dat de nulhypothese werd getest dat de effecten van de chirurgische ingrepen gemiddeld nul zouden zijn) door een gekoppelde t-toets aan elke onafhankelijke groep. De gegevens laten zien dat de schijn laesie geen significant effect had, terwijl een laesie van de i7-spieren of een laesie van de sub-radulaire vezels een significant effect had op radulaire opening (p < 0,031 voor de i7-laesie groep, aangegeven met een enkele asterisk , of p < 0,002 voor de groep SRF-laesie, aangeduid met een dubbel sterretje). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60030/60030fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Lichaamsgewicht</td>
			<td>Magnesium chloride dosis</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 200 g</td>
			<td>1/2 lichaamsgewicht</td>
		</tr>
<tr>
<td>200-350 g</td>
			<td>1/3 lichaamsgewicht</td>
		</tr>
<tr>
<td>350-450 g</td>
			<td>1/4 lichaamsgewicht</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Magnesium chloride dosering door lichaamsgewicht.

Hier presenteren we een protocol voor minimaal invasieve chirurgische lesioning van spieren intrinsiek aan het Voer apparaat van de mariene weekdieren Aplysia californica om de rollen van deze spieren te begrijpen tijdens het voeden gedrag.

Een minimaal invasieve laesie techniek voor de intrinsieke spieren van de Odontophore van Aplysia californica

Aplysia californica is a model system for studying the neural control of learning and behavior. This animal has a semi-open circulatory system, making it ...

Het voedingssysteem van Aplysia is al lang gebruikt als een modelsysteem voor de studie van motorische controle en zachte lichaamsbiomechanica. Echter, de spieren diep in de voeding grijper zijn ontoegankelijk voor in vivo manipulatie. Deze operatie stelt ons in staat om toegang te krijgen tot deze spieren in anders intact gedragende dieren.Dit biedt ons niet alleen voor het eerst toegang, maar de techniek omvat een enkele incisie tot één enkel deel van een slak, wat betekent dat de schade aan de andere regio's relatief klein is. De beste voorbereiding is om zorgvuldige dissecties van de buccale massa te doen en zich grondig vertrouwd te maken met de anatomie. Selecteer een actief dier door het zeewier aan te bieden en te bevestigen dat de beetintervallen niet langer zijn dan vijf seconden.10 minuten na de verdoving, probeer voorzichtig om een speld in de kieuw en rhinophore te steken, controlerend of deze niet terugtrekken om voldoende anesthesie te verzekeren. Zorg ervoor dat de lippen van de slak glad zijn, wat aangeeft dat de kaken volledig ontspannen zijn. Op deze manier wordt odontophore blootgesteld.In het geval dat kreuken op de lippen verschijnt, zijn de lippen en kaak van het dier niet voldoende ontspannen voor de chirurgische ingreep. Raadpleeg het manuscript voor tips over het opwekken van lipontspanning. Plaats de slak zo dat het hoofd naar beneden hangt, waardoor de buccale massa zich tegen de kaken kan nestelen.Druk uitoefenen met de duim en wijsvinger om de buccale massa naar de kaken te duwen, waarbij de buccale massa op zijn plaats blijft. Draai de kaak zo dat ze zichtbaar zijn. Tegelijkertijd moet u de druk op de buccale massa handhaven, zodat de boeg van de buccale massa zichtbaar is door de kaken.Werk voorzichtig de uiteinden van de stompe tangen in de spleet van de odontophore en gebruik ze om het radulaire oppervlak door de kaken te gebruiken. Als de kaken niet voldoende ontspannen zijn, gebruik dan de tangen om de rand van de kloof voorzichtig te grijpen om dit proces te ondersteunen. Zodra het oppervlak is blootgesteld, werk de kaken duidelijk van het voorste gedeelte van het radulaire oppervlak helemaal rond de omtrek.Dit maakt de odontophore minder kans om in te trekken. Zorg ervoor dat niet meer dan de helft van de wanden van de odontophore wordt blootgesteld. Zodra het radulaire oppervlak volledig is blootgesteld, schik de slak onder een dissectiemicroscoop voor de operatie.Voor wetenschappers met minder ervaring, gebruik maken van een brede rubberen band en een derde hand om de kaken en radulaire oppervlak te stabiliseren voor de operatie. Plaats het radulaire oppervlak zodat de gespleten kant tegenover de onderzoeker staat. Pak het radulaire oppervlak in de buurt van de radulaire basis, zodat een horizontale vouw loodrecht op de anatomische vouw wordt gecreëerd.Gebruik fijne schaar om door deze vouw te snijden, waardoor een incisie langs de anatomische vouw. Breid deze initiële incisie uit tot drie tot vijf centimeter om toegang te krijgen tot het interieur van de buccale massa. Pas het licht zo aan dat het direct terug wijst door deze incisie.Deel de randen van de incisie zodat de achterkant van het lumen van de odontophore en de dunne verticale strengen van de I7-spier zichtbaar zijn. Reik in de incisie. Pak beide strengen van I7 en trek ze omhoog door de incisie, waar zo veel van de spier kan worden weggesneden als praktisch is.Nadat laesies zijn uitgevoerd, pak de voorste tentakels en duw ze naar beneden op het radulaire oppervlak om de slak terug te keren naar de oorspronkelijke configuratie. Plaats postchirurgische dieren in een beschermde omgeving met een goede waterstroom. Zorg ervoor dat de dieren alert en responsief zijn op de dag na de operatie.Op de eerste of tweede dag na de operatie beginnen de dieren zich te voeden. Om subradulaire vezellaesie uit te voeren na chirurgische incisie, steek het puntje van een klein, recht scalpelblad door de incisie met de scherpe rand naar boven schuin. Schraap voorzichtig de fijne spiervezels van de onderkant van het radulaire oppervlak.Voer vervolgens postoperatieve zorg uit zoals voorheen. In deze anatomische studie hadden schijnlaesies geen significant effect op de breedte van de opening op het hoogtepunt van het bijten. Terwijl zowel I7 als subd radulaire vezelletsels de beetbreedte aanzienlijk verminderden.Het belangrijkste om te onthouden is dat de lippen en kaken van het dier volledig ontspannen zijn voordat u probeert om de grijper door de kaken te duwen. Waarschijnlijk zijn zowel I7 als de subradulaire vezels multifunctionele spieren en we hebben alleen bepaalde aspecten van het gedrag geïdentificeerd waaraan ze bijdragen. Bovendien geeft deze techniek van het uittrekken van de odontophore toegang tot hele delen van de anatomie die voorheen ontoegankelijk waren.Naast het openen van anatomische regio's en zachte lichaamsbiomechanica, hopen we dat dit kan dienen als basis voor andere onderzoekers die werken met zachte structuren die anders moeilijk te onderzoeken zouden kunnen zijn.

a-minimally-invasive-lesion-technique-for-muscles-intrinsic-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een techniek is beschreven voor het implanteren van...

Elektrode Fabrication en Implantatie in Aplysia californica Voor Multi-channel Neurale en gespierd Recordings in Intact, Vrij Behaving Dieren

We zien hoe veranderingen in de intracellulaire vrije calciumconcentratie en synaptische werkzaamheid kan gelijktijdig monitoren in een ganglion bereiding...

Volgen van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie en Synaptic werkzaamheid in de Mollusc<em&gt; Aplysia</em

We beschrijven een techniek om extracellulair op te nemen en te stimuleren van zenuwen, spieren, en individuele geïdentificeerde...

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Voorbereiding voor het uitlokken en opnemen Feeding Motor Programma&#39;s met Fysiologische Mutaties in<em&gt; Aplysia californica</em

Deze video beschrijft hoe larvale filets te bereiden die worden gebruikt om sensorische dendritische arborization (da) neuronen en hun bijbehorende epidermale cellen te visualiseren. Het aanbevolen protocol laat in detail zien hoe spierweefsel uit de lichaamswand kan worden verwijderd met behoud van de morfologie van de cellen, wat de immunostaining en visualisatie van de anders verduisterde da-neuronen en epidermale cellen verbetert.

Larvale filetvoorbereiding: een methode om intacte sensorische neuronen en bijbehorende epidermale cellen te visualiseren

In dieren met grote geïdentificeerde neuronen...

Extracellulair Het identificeren van Motor Neuronen voor een Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

We beschrijven de ontleding van het zenuwstelsel van het mariene...

Isolatie van sensorische neuronen van<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Voor Patch Clamp Recordings van Glutamaterge Currents

Zeeslak Aplysia californica is veel gebruikt als een neurobiologisch model voor de studies op cellulaire en moleculaire basis van gedrag. Hier wordt een methodologie beschreven voor het verkennen van het zenuwstelsel van Aplysia voor de elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen van geïdentificeerde neurale circuits.

Aplysia Ganglia voorbereiding voor elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen

De werkzaamheid van intramusculaire opname en retrograad transport van moleculen naar corresponderende motorische neuronen hangt af van de locatie van de injectieplaatsen ten opzichte van de motorische eindplaten (MEP's). Hier beschrijven we hoe je MEP's op skeletspieren kunt lokaliseren om het retrograad transport van tracers naar motorische neuronen te optimaliseren.

Intramusculaire injecties Langs de Motor End Plates: een minimaal invasieve benadering van Shuttle Tracers Rechtstreeks in Motor Neuronen

Studies van neuronale morfogenese met behulp van Drosophila larvale dendritische arborization (bis) neuronen profiteren van in situ visualisatie van neuronale en epidermale eiwitten door immunofluorescentie. We beschrijven een werkwijze die immunofluorescentie analyse van da neuronen en omliggende epidermale cellen verbetert door het verwijderen spierweefsel van de larvale lichaamswand.

Verwijdering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Spier Weefsel van Larvale Filets voor Immunofluorescentie Analyse van sensorische neuronen en opperhuidcellen

We beschrijven een nieuwe experimentele techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME), die is gebaseerd op het bewijsmateriaal bellen dat skelet spierweefsel levensvatbare myogenic cellen, die vergemakkelijken donor-cel-gemedieerde myogenesis bevat kunnen wanneer ingeplant een host spier.

Minimaal invasieve spier insluiten (MIME) - een roman experimentele techniek ter vergemakkelijking van de Donor-cel-gemedieerde Myogenesis

Dit protocol presenteert een methode voor het weergeven van neuronale populatieactiviteit met eencellige resolutie bij niet-transgene ongewervelde soorten met behulp van absorptiespanningsgevoelige kleurstoffen en een fotodiode array. Deze aanpak maakt een snelle workflow mogelijk, waarbij beeldvorming en analyse in één dag kunnen worden nagestreefd.

Op fotodiode gebaseerde optische beeldvorming voor het opnemen van netwerkdynamica met single-neuronresolutie in niet-transgene ongewervelde dieren

Leer een minimaal invasieve chirurgische techniek om diepe spieren in het voedingsapparaat van Aplysia californica te benaderen. Deze methode maakt in vivo manipulatie mogelijk om motorische controle en biomechanica te bestuderen.

Een minimaal invasieve laesie techniek voor de intrinsieke spieren van de Odontophore van Aplysia californica

Meer video's verkennen