Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Dit 3D co-cultuur sferoïde systeem is ontworpen om fysiologische angiogenese na te bootsen. Het zal effectief zijn voor de evaluatie van potentiële angiogene modulatoren en biedt voorspelbare informatie voorafgaand aan in vivo studies. Dit systeem maakt gebruik van co-cultuur sferoïden gevormd door twee vasculaire voorloper cellen en kan worden gebruikt om cellulaire interacties te onderzoeken, ontkiemen, en de buisvormige rijping van fysiologische angiogenese.

Als we patiëntencellen kunnen gebruiken om co-cultuur sferoïden te vormen, kunnen we dit systeem gebruiken om gepersonaliseerde behandelingen te ontwikkelen voor abnormale angiogenese-gerelateerde ziekten, zoals kanker. Dit testsysteem kan de gevoeligheid en efficiëntie van studies van angiogenese en medicijnontwikkeling verhogen. Begin met het gebruik van 05% trypsin-EDTA om ECFCs en MSCs los te koppelen van respectievelijk 80 tot 90% confluent celculturen gedurende drie of vijf minuten in een celkweek incubator.

Activeer trypsine met vers compleet DMEM-medium en pipet de cellen een paar keer om een enkele celsuspensie te genereren. Verzamel de cellen door centrifugatie, gevolgd door twee wasbeurten met serumvrij medium. Verdun de ECFCs na de tweede wasbeurt tot een drie maal 10 tot de zes cellen per milliliter van de gemiddelde concentratie en de MSCs tot twee keer 10 tot de zes cellen per millimeter van de gemiddelde concentratie in individuele twee milliliter microcentrifugebuizen.

Pellet de cellen door centrifugatie, en zorgvuldig aanzuigen alle, maar de laatste 15 tot 25 microliter van supernatant uit elk celmonster. Vervolgens resuspend elke pellet in 250 microliter verdunningsstof C van een fluorescerende kleurstof kit, en voorzichtig pipette de cel suspenen om een volledige dispersie te garanderen. Voeg 250 microliter vers bereide 20-micromolar PKH67 toe aan de buis van ECFCs.

Voeg 250 microliter pkh26 toe aan de buis van MSCs. Meng onmiddellijk beide celsuspensies. Na vijf minuten bij kamertemperatuur met schudden, beschermd tegen licht, stop het kleurproces met een incubatie van één minuut in 0,5 milliliter FBS per buis.

Verzamel aan het einde van de incubatie de cellen door centrifugatie en verwijder de supernatant voorzichtig, gevolgd door twee wasbeurten in twee milliliter vers volledig medium per wasbeurt. Dan schorten de cellen in respectievelijk medium in 15-milliliter buizen. Voor de sferoïdegeneratie verdunt u na de tweede wasbeurt eerst de celsuspensies in de juiste concentratie van endotheelcelgroeimedium MV2, aangevuld met 20%methyhylcelluloseoplossing en 5%foetale runderserumconcentratie.

Voeg vervolgens elke celsuspensie toe in een gesteriliseerd polystyreen rechthoekig reservoir. Gebruik een multichannel pipet om ongeveer 125 microliter druppeltjes cellen toe te voegen aan de cover van een 150-millimeter kweekplaat. Wanneer alle cellen zijn toegevoegd, omkeren de dekking over de bodem van een schotel met 15 milliliter PBS, en plaats de platen in de cel cultuur incubator voor 24 uur.

De volgende dag, spoel de schotel dekt met vijf milliliter PBS in een 50-milliliter buis per schotel. Spoel de deksels met nog eens vijf milliliter PBS om eventuele resterende sferoïden te verzamelen en pellet de sferoïden door middel van centrifugatie. Gooi alle, behalve de laatste 100 tot 200 microliter supernatant, en tik voorzichtig op de wand van de buis, zodat de sferoïden vrij worden opgehangen in de resterende supernatant.

Voeg het juiste volume van het endotheelcelgroeimedium MV2 toe, aangevuld met 5%foetaal runderserum en 40%methylbylcelluloseoplossing aan elke buis om de sferoïden opnieuw op te stellen bij een 100 sferoïden per milliliter van gemiddelde concentratie. Gebruik een 1-milliliter pipet tip gesneden om een drie-tot vijf-millimeter diameter om voorzichtig mengen de sferoïde suspensies. Gebruik een nieuwe wide-tip, een-milliliter pipet om de sferoïde sferoïde suspensie oplossing te mengen met een geneutraliseerde type I collageen gel op een een-op-een verhouding op ijs.

Voeg 900 microliter van elke sferoïde-opschorten collageen gel oplossing in de putten van een voorverwarmde 24-well plaat. Laat de suspensies gedurende 30 minuten polymeriseren in de incubator van de celkweek, alvorens de sferoïden te bedekken met 100 microliter van endotheelcelgroeimedium MV2, aangevuld met 2,5%FBS en 50 nanogram per milliliter VEGF aan de ECFC-only sferoïden en medium aangevuld met FBS alleen aan de MSC en ECFC-plus-MSC sferoïde culturen. Plaats vervolgens elke plaat in een real-time celrecorder geïnstalleerd in een celcultuur incubator, en willekeurig richten op vijf tot 10 sferoïden op een 10x vergroting om de ontkiemende vorming van elke fluorescentie-gelabelde sferoïde elk uur gedurende 24 uur te controleren.

Om de sferoïde ontkiemen te kwantificeren, importeer je de beeldbestanden naar ImageJ en meet je het aantal en de lengte van spruiten die het juiste fluorescerende signaal uitdrukken van vijf willekeurig geselecteerde sferoïden per experimentele groep. Voor ECFC-plus-MSC sferoïden is het aantal spruiten en de cumulatieve spruitlengte aanzienlijk hoger in vergelijking met die van ECFC-only sferoïden op alle tijdstippen. SFERoïden vormen geen spruiten, maar tonen een individuele migratie van de MSC buiten sferoïden.

De etikettering van ECFC met groen-fluorescerende kleurstof en MSC met rood-fluorescerende kleurstof alvorens te combineren om ECFC-plus-MSC sferoïden te genereren toont aan dat ECFC-gemedieerde spruitstructuren met MSCs worden behandeld, wat suggereert dat gecombineerde MSC's functioneren als perivasculaire cellen tijdens de spruitvorming, waardoor de spruitstabiliteit en duurzaamheid worden verbeterd door de nauwe associatie tussen twee vasculaire cellen. ECFC-plus-MSC sferoïden voorbehandeld met een angiogenese remmer vertonen een verminderd spruitaantal en een cumulatieve spruitlengte op een dosisafhankelijke manier in vergelijking met de controle ecfc-plus-MSC sferoïden. In parallelle experimenten tonen ECFC-only sferoïden die met de remmer zijn voorbesteed, gevolgd door stimulatie met VEGF, ook een verminderd groeifactor-geïnduceerde spruitaantal en cumulatieve spruitlengte op een dosisafhankelijke manier.

Van belang is een hogere concentratie angiogeneseremmer nodig om ECFC-plus-MSC-sferoïden te remmen in vergelijking met ECFC-only sferoïden. Tumorgroei wordt aanzienlijk geremd bij met hoge dosis angiogenese inhibitor behandelde dieren in vergelijking met zowel met controle behandelde dieren als met lage dosis angiogenese inhibitor behandelde dieren in een menselijk xenograft tumormuismodel. De plasmaconcentratie van bevacizumab bij met hoge dosis behandelde muizen bedroeg 568 plus of min 40,62 microgram per milliliter, wat dichter bij de IC50-waarde van bevacizumab lag voor het remmen van de cumulatieve spruitlengte in ECFC-plus-MSC-sferoïden in plaats van ECFC-only sferoïden.

Dit suggereert dat het ECFC-plus-MSC co-culture sferoïde systeem geschikt is voor het voorspellen van effectieve plasmaconcentraties voorafgaand aan een dierstudie. Met behulp van een wide-tip, one-mL pipet om voorzichtig mengen van de sferoïden terwijl ze in collageen gel op ijs is belangrijk voor de bescherming van de integriteit van de sferoïden. We kunnen dit systeem aanpassen om andere celtypen in te voeren, zoals immuuncellen en andere extracellulaire matrices om cel-matrix crosstalk te onderzoeken tijdens angiogenese.