Name: Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer een mechanische aanpak om connexin 43 te verstoren en de impact op endotheliale biomechanica te meten via tractions en intercellulaire spanningen. Deze methode integreert biochemische en biomechanische analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de University of Central Florida start-up funds en het National Heart, Lung en Blood Institute van het National Institute of Health under Award K25HL132098.

1. Polyacrylamide (PA) gels maken
<ol><li>
Voorbereiding van Petri schaaltje
	<ol>
<li>Bereid BIND silaan oplossing door het mengen van 200 mL ultrapuur water met 80 μL azijnzuur en 50 μL 3-(trimethoxysilyl) Propylmethacrylaat. BIND silaan is een oplossing die wordt gebruikt voor het functionaliseren van het glasbodem Petri schaaloppervlak voor hydrogel bevestiging.</li>
		<li>Roer de BIND silaan-oplossing op een roer plaat gedurende ten minste 1 uur.</li>
		<li>Behandel het centrum goed van de Petri schaal met BIND silaan oplossing voor 45 min.</li>
		<li>Verwijder BIND silaan oplossing en spoel de Petri schaal af met ultra zuiver water 2x-3x.</li>
		<li>Droog het Petri schaaloppervlak en bewaar bij kamertemperatuur voor toekomstig gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van de hydrogel oplossing
	<ol>
<li>Meng ultrazuiver water, 40% acrylamide en 2% bis-acrylamide in een centrifugebuis van 15 mL volgens tabel 1.</li>
		<li>Voeg 80 μL fluorescerende kralen toe aan de hydrogel oplossing.</li>
		<li>Schud de buis zachtjes om kralen te mengen met de geloplossing.</li>
		<li>Draai de buisdop op de centrifugebuis lichtjes aan en plaats deze in een vacuümkamer.</li>
		<li>Degas de gel-oplossing voor ten minste 45 min in vacuümkamer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hydrogel polymerisatie
	<ol>
<li>Voeg eerst 75 μL van 10% ammonium persulfaat toe (opgelost in ultra zuiver water) en voeg vervolgens 8 μL TEMED (N, N, N ', N'-Tetramethylethane-1,2-diamine) toe aan de hydrogel oplossing.</li>
		<li>Plaats 24 μL hydrogel oplossing in het midden van de Petri schaal (Zie tabel 2).</li>
		<li>Gebruik een 18 mm afdek om de hydrogel plat te maken. Dit geeft een hoogte van ~ 100 μm.</li>
		<li>Wacht minstens 30-40 min voor de polymerisatie van de gel.</li>
		<li>Dompel de gepolymeriseerde hydrogel in ultra zuiver water in om gel uitdroging te voorkomen.</li>
		<li>Bedek de Petri schaal met aluminiumfolie om fotobleking van fluorescerende kralen te voorkomen en op te slaan bij 4 °C. Let op: hydrogels kunnen een periode van maximaal 3 maanden worden bewaard, maar er wordt gesuggereerd dat deze gels niet langer dan 1 week na de fabricage worden gebruikt om de beste resultaten te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. celcultuur
<ol><li>Cultuur humane navelstreng ader endotheliale cellen (huvecs) in celkweekmedium 200 (Zie tabel van de materialen) aangevuld met 1% penicillaire-streptomycine op 0,1% gelatine gecoate kolven bij 37 °c en 5% Co2.</li>
</ol>3. micro patroon stencil voorbereiding
<ol><li>Genees een dun laagje Polydimethylsiloxaan (PDM'S) in een 100 mm Petri schaaltje door het siliconen onderstel te mengen met het siliconen Verhardend middel in een verhouding van 20:1 (basis: Uithardings middel). Opmerking: het is mogelijk om andere basis verhoudingen te gebruiken (bijv. 10:1 of 30:1). Echter, een lagere basis om te genezen agent ratio zal een stijvere patroon opleveren, terwijl een hogere basis tot genezen agent ratio een zachter patroon zal produceren.</li>
	<li>Bereid een 20:1 (Base: Cure agent) PDMS oplossing en meng voorzichtig in een 50 mL centrifugebuis. Keer de buis ondersteboven en schud krachtig meerdere malen om een goede menging van de PDMS-oplossing te verzekeren, omdat niet-uniforme menging resulteert in onvolledige polymerisatie.</li>
	<li>Verwijder bubbels die zijn geïntroduceerd uit de bovenstaande stap door de PDMS-oplossing gedurende 1 minuut te centrifugeren bij 190 x g.</li>
	<li>Giet 5-6 mL PDMS oplossing in het midden van een 100 mm Petri schaaltje en roer het gerecht tot de PDMS oplossing het gehele Petri schaaloppervlak bedekt.</li>
	<li>De PDMS oplossing 's nachts op 50-60 °C genezen. PDM'S kunnen ook op kamertemperatuur worden genezen.</li>
	<li>Verwijder een cirkelvormig, 16 mm diameter PDMS stencil met een perforatie Puncher.</li>
	<li>Gebruik een biopsie punch om kleine gaten te maken in de PDMS stencil. Dit protocol maakt gebruik van een 1,25 mm diameter biopsie Punch.</li>
	<li>Steriliseer PDMS stencils door ze eerst in te voegen in 70% ethanol voor 2-3 min, aspireren van overtollige ethanol en vervolgens plaatsen onder een UV-licht voor 5 min.</li>
</ol>4. collageen-I hydrogel coating
<ol><li>Verwijder de dekslip van de hydrogel en aspiraat overtollige vloeistof.</li>
	<li>Plaats de PDMS stencil op het hydrogel oppervlak. Opmerking: pincet kan worden gebruikt om licht druk toe te passen op PDMS stencil om een waterdichte afdichting tussen de PDMS stencil en hydrogel oppervlak te garanderen. Onze PDMS stencils zijn waterdicht en voorkomen zo water toegang tussen de gel top oppervlak en PDMS stencil bodemoppervlak. Ook de hydrogel stijfheid hoeft niet aangepast te worden aan de PDMS stijfheid.</li>
	<li>Bedek het hydrogel oppervlak met sulfosuccinimidyl-6-(4-azido-2-nitrofenylamino) hexanoaat (sulfo-SANPAH) opgelost in een 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfoninezuur) bufferoplossing bij een concentratie van 1:1000 en plaats onder een UV- lamp (vermogen 36 W) gedurende 8 min.</li>
	<li>Aspireren de overmaat sulfo-SANPAH en HEPES oplossing en spoel de hydrogel tweemaal met 0,1 M HEPES gevolgd door een extra twee spoelen met ultra zuiver water.</li>
	<li>Aspirate overtollige Ultra-zuiver water en vacht hydrogels met 0,1 mg/mL collageen-ik overnacht bij 4 °C.</li>
	<li>Bedek de gerechten en Bescherm fluorescerende kralen tegen fotobleaching. Opmerking: PDMS-stencils worden gebruikt om monolayers met micro patronen te maken. Micro-patroon monolagen worden gebruikt omdat ze toestaan dat meerdere monolagen van dezelfde geometrie en afmetingen gelijktijdig worden geobserveerd tijdens elk experiment. Echter, moeten micro patronen niet worden gewenst de bovenstaande stappen kunnen worden gevolgd met uitzondering van stap 4,2.</li>
</ol>5. creëren van huvec monolagen op hydrogels
<ol><li>Gebruik 1x trypsine om cellen los te maken van weefselkweek kolven voor 3-5 min in de incubator.</li>
	<li>Voeg na trypsinisatie celkweek media toe aan de trypsine-oplossing en voeg deze toe aan de centrifugebuis van 15 mL.</li>
	<li>Centrifugeer de celoplossing 3 min bij 1710 x g. Een kleine, witte pellet van cellen moet zichtbaar zijn aan de onderkant van de centrifugebuis.</li>
	<li>Aspireren de supernatant en respenderen cellen in de media tot een concentratie van 50 x 104 cellen/ml.</li>
	<li>Verwijder collageen-I uit de hydrogel en spoel 1x met PBS.</li>
	<li>Voeg 75 x 103 cellen toe aan de bovenkant van het PDMS stencil en laat cellen ten minste 1 uur in de incubator bij 37 °c en 5% Co2hechten aan het hydrogel oppervlak.</li>
	<li>Verwijder het PDMS stencil en voeg ten minste 2 mL media toe aan de Petri schaal. Dompel de PDMS stencil in 10x trypsine om eventuele bijgevoegde cellen te verwijderen en te steriliseren door te spuiten met 70% ethanol en vervolgens 5 minuten onder het UV-licht te plaatsen.</li>
	<li>Plaats de Petri schaal in de incubator en wacht minstens 36 uur of totdat er een confluente monolaag wordt waargenomen.</li>
</ol>6.2,5 dihydroxychalcone behandeling voor Cx43 verstoring
<ol><li>Los 2,5 dihydroxychalcone (chalcone) op in dimethylsulfoxide (DMSO) om een 0,1875 mg/mL stamoplossing te maken.</li>
	<li>Verdun de stamoplossing met celkweek media om een lage Chalcon concentratie (0,2 μg/ml) aliquot en een hoge Chalcon concentratie (2 μg/ml) aliquot te maken.</li>
</ol>7. gegevensverzameling
<ol><li>Lokaliseer de celeilanden met een microscoop.</li>
	<li>Verwerven fase contrast en kraal beelden aan beeld cellen morfologie en hydrogel verplaatsingen, respectievelijk. Opmerking: dit protocol gebruikt een 10x-doelstelling voor het verzamelen van gegevens.</li>
	<li>Maak aan het einde van het experiment cellen los met 10x trypsine en verkrijg een afbeelding van het geloppervlak zonder cellen (referentiebeeld).</li>
</ol>8. immunokleuring
<ol><li>Fixeer monolagen met 4% formaldehyde en inincuberen bij 37 °C gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Verwijder 4% formaldehyde en Voeg 0,2% Triton X-100 gedurende 5 min bij 37 °C toe aan permeabilize cellen.</li>
	<li>Verwijder 0,2% Triton X-100 en spoel monolagen af met PBS 2x-3x.</li>
	<li>Bedek monolaag met 2% boviene serumalbumine (BSA) oplossing voor 45 min bij 37 °c.</li>
	<li>Verwijder de 2% BSA-oplossing en spoel de monolagen af met PBS 2x-3x.</li>
	<li>Voeg primair Cx43 antilichaam toe met een concentratie van 1:400 tot het monster en inincubatie 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder primair antilichaam en spoel het monster af met PBS 2x-3x.</li>
	<li>Voeg secundair antilichaam toe met een concentratie van 3:200 en inincubatie gedurende 2 uur bij 37 °C. Opmerking: monsters moeten worden bedekt om fotobleking te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder secundair antilichaam en spoel af met PBS 2x-3x.</li>
	<li>Afdek monster met afdekmedium (Fluromount-G DAPI) en afdichting met een afdekplaat van 18 mm.</li>
</ol>9. implementatie van tractiekracht microscopie (tfm) en monolaag stress microscopie (MSM)
<ol><li>
Berekening hydrogel vervorming Opmerking: een stap-voor-stap verplaatsings procedure met behulp van MATLAB wordt hieronder gegeven.<ol>
<li>Open het hoofdbestand Traction. m in MATLAB (voor alle MATLAB-routines Zie aanvullende materialen). Opmerking: Volg de instructies in de code om de MATLAB-map in te stellen.</li>
		<li>Definieer de volgende variabelen: afbeeldingsformaat, pixel-naar-micron conversie, jeugdige modulus, Poisson-ratio en Microscoop-doelstelling.</li>
		<li>Zoek de kraal, trypsine-afbeelding en fase-afbeelding met behulp van de Open files subroutine. Opmerking: voor grote gegevenssets is het het beste om bestanden in sequentiële volgorde te noemen. Bestanden moeten bijvoorbeeld de naam ' bestandsnaam1. TIF ', ' bestandsnaam2. TIF ', enzovoort hebben.</li>
		<li>Definieer een vierkante ROI (regio van belang) rond de monolaag van de cel en voer de cell_cropper subroutine uit om de oorspronkelijke afbeelding uit te snijden.</li>
		<li>Voer de displacement_finder subroutine uit om verplaatsingen te berekenen.</li>
		<li>Voer de Dedrift -subroutine uit om eventuele extra niet-cellulaire verplaatsingen te verwijderen die het gevolg kunnen zijn van een Microscoop-fase drift.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Berekening van de tracties Opmerking: hier worden onbeperkte tractie berekend met behulp van onze op maat gemaakte MATLAB-routine. Stap voor stap tractie berekening met de eerder genoemde MATLAB-routine wordt hieronder gegeven.<ol>
<li>Definieer de volgende variabelen binnen de tractie. m routine: randvoorwaarde, geldikte, gelhoogte en dedrift.</li>
		<li>Voer de traction_finder subroutine uit om tractie te berekenen en voer de plot_traction subroutine uit om tractie te plotten. Alle tracties in x-Direction (TX) en y-Direction (Ty) samen met de bijbehorende pixel locaties kunnen worden gevonden in een bestand Traction. dat dat wordt gegenereerd door de code.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Berekening van intercellulaire spanningen Opmerking: stap voor stap instructies voor intercellulaire stress berekening met behulp van de eerder genoemde MATLAB-routine worden hieronder gegeven.<ol>
<li>Voer de mark_circular_domain subroutine uit om de grens van de monolaag op te geven. Deze routine zal alle bijgesneden fase beelden opeenvolgend te vragen voor de gebruiker om handmatig een grens rond de monolayer tekenen. Houd een notitie bij van de nXPts die zijn gegenereerd in het opdrachtvenster en gebruik ze later als raster parameters in zowel de X-as als de Y-as voor FEM-analyse (zie stap 9.3.2).</li>
		<li>Voer Run_StressCode uit om intercellulaire spanningen te berekenen. Deze subroutine direct leest parameters van "model.in" bestand en voert "Island. exe" om FEM-analyse uit te voeren. Voordat u deze routine uitvoert, moet u ervoor zorgen dat alle parameters in het bestand model.in , d.w.z. raster parameters in X en Y, pixel-naar-micron-conversie, jeugdige modulus van de gel, Poisson-verhouding, monolaag-hoogte en monolaag-patroon (strip of gat), worden bewerkt Correct.</li>
		<li>Plot alle FEM-resultaten met behulp van de plot_FEM_results subroutine. Opmerking: alle gegenereerde resultaten worden automatisch opgeslagen in de map Results in de map MATLAB.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+and+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li>
<li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates%3A+A+guide+to+recent+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+%28STFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li>
<li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Journal+of+Science+%26+Technical+Research%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).</li>
<li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear%2C+intercellular+stress%2C+and+endothelial+cell+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li>
<li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+forces+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+forces%3A+a+useful+parameter+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li>
<li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li>
<li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706(2018).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+stress+microscopy%3A+limitations%2C+artifacts%2C+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172(2013).</li>
<li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li>
<li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li>
<li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li>
<li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li>
<li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327(2019).</li>
<li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li>
<li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li>
<li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+phosphorylation+in+brain%2C+cardiac%2C+endothelial+and+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li>
<li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li>
<li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li>
<li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C5%27-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li>
<li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li>
<li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+cytotoxicity+of+2%2C5-dihydroxychalcones+and+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pharmacal+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Onze groep, evenals anderen, heeft met succes tfm en MSM gebruikt om de invloed van celcelknooppunten in verschillende pathologische en fysiologische cellulaire processen in vitro7,15,18,27 te sonde . Bijvoorbeeld, Hardin et al. presenteerde een zeer inzichtelijke studie die suggereert intercellulaire stress transmissie begeleidt paracellulaire gap vorming in endotheliale cellen<sup class="xref...

Het veld dat verwijst naar de studie van de effecten van fysieke krachten en van mechanische eigenschappen op cellulaire en weefsel fysiologie en pathologie staat bekend als Mechanobiology1. Een paar nuttige technieken die zijn gebruikt in de mechanobiologie zijn monolaag stress microscopie en tractiekracht microscopie. Tractiekracht microscopie maakt het mogelijk voor de berekening van tracties gegenereerd op de celsubstraat interface, terwijl monolaag stress microscopie maakt het mogelijk voor de berekening van intercellulaire spanningen gegenereerd tussen aangrenzende cellen binnen een monolaag2 ,3,4,5,6. Resultaten opgeleverd uit eerdere methoden hebben gesuggereerd dat cel-afgeleide mechanische spanningen spelen een cruciale rol bij het bepalen van het lot van een groot aantal cellulaire processen3,4,5. Bijvoorbeeld, bij blootstelling aan een externe mechanische kracht, een groep cellen migreren als een collectief kan hun morfologie veranderen en polariseren hun vorm te uitlijnen en te migreren langs de richting van de toegepaste kracht door, gedeeltelijk, het genereren van tractie7, 8. Tractions bieden een metriek die kan worden gebruikt voor het evalueren van de contractiliteit van de cel en worden berekend met behulp van tractiekracht microscopie (TFM). Tractiekracht microscopie (TFM) begint met de bepaling van celgeïnduceerde substraat vervormingen gevolgd door de berekening van het tractie veld met behulp van een wiskundig rigoureuze, op mechanica gebaseerde computationele benadering. Aangezien de mogelijkheid om te berekenen tractie al geruime tijd is geweest, onderzoekers hebben gebruikt tfm om te onthullen de impact tractie hebben op een groot aantal processen, met inbegrip van kanker9, wondgenezing10 en beoordeling van engineered cardiale weefsel11.
De implementatie van TFM en MSM samen kan worden onderverdeeld in drie essentiële stappen die in de volgende volgorde moeten worden uitgevoerd: ten eerste worden de door de cellen geproduceerde hydrogel vervormingen bepaald; Ten tweede worden tracties teruggewonnen uit hydrogel vervormingen; en ten derde wordt een eindige-element benadering gebruikt om de normale en shear intercellulaire spanningen binnen de gehele monolayer te berekenen. Om gelverplaatsingen te berekenen werden fluorescentie kraal beelden met cellen vergeleken met de referentie kraal afbeelding (zonder cellen) met behulp van een aangepaste-geschreven partikel afbeelding velocimetrie (PIV) routine. De cross-correlatie window grootte en overlapping voor PIV analyse werden gekozen als 32 x 32 pixels en 0,5, respectievelijk. Op dit moment werden pixel verschuivingen omgezet in micron door vermenigvuldiging met een pixel-naar-micron conversiefactor (voor onze Microscoop, deze omrekeningsfactor is 0,65) om in-plane verplaatsingen te verkrijgen. Fouten in verband met het negeren van verplaatsingen buiten het vlak zijn verwaarloosbaar12,13. Na de berekening van de gelverplaatsingen zijn er twee soorten tractie metingen die kunnen worden gebruikt, beperkte tracties en onbelemmerd tractie8,14. Onbeperkte tracties bieden het veld tractie voor het hele gezichtsveld (inclusief regio's met en zonder cellen), terwijl beperkte tractie het tractie veld alleen bieden voor regio's met cellen14. Vervolgens worden intercellulaire spanningen berekend met behulp van monolaag stress microscopie (MSM), wat een Verleng deel is van de tractiekracht microscopie. De implementatie van MSM is gebaseerd op de veronderstelling dat lokale tracties die worden uitgeoefend door een monolaag van cellen op de celsubstraat interface moeten worden afgewogen door mechanische krachten die worden overgebracht tussen cellen op de celcelinterface, zoals vereist door de wetten van Newton7 ,12,13. Een belangrijke aanname hier is dat de celmonolayer kan worden behandeld als een dun elastisch blad omdat de tractie verdeling in de monolaag bekend is en de kracht balans niet afhankelijk is van eigenschappen van het celmateriaal. Een andere belangrijke aanname is dat de tractie krachten worden gecompenseerd door lokale intercellulaire spanningen binnen het optische gezichtsveld (binnen de monolayer) en de invloed van deze kracht balans is minimaal in de distale regio (buiten de monolayer)13. Daarom zijn de grens omstandigheden die worden gedefinieerd door intercellulaire spanningen, verplaatsingen of een combinatie van beide op de monolaag-grens cruciaal voor het uitvoeren van MSM13. Rekening houdend met de bovenstaande informatie gebruiken we MSM om een eindige-elementanalyse (FEM) uit te voeren om de maximale hoofdspanning (σMax) en minimale hoofdbelasting (σmin) te herstellen door het stress vlak op elk punt in de monolaag. Deze belangrijkste spanningen worden vervolgens gebruikt om de gemiddelde normale intercellulaire stress van het 2D te berekenen [(σMax + σmin)/2] en 2D maximale shear intercellulaire stress [(σMax -σmin)/2] binnen de gehele monolaag 12,13. Deze procedure wordt uitvoeriger beschreven door tambe et al.12,13
Monolaag stress microscopie (MSM) zorgt voor de berekening van cel-cel intercellulaire spanningen gegenereerd binnen een monolaag6,7,8,12,13. Deze intercellulaire spanningen zijn gesuggereerd belangrijk voor weefsel groei en herstel, wondgenezing, en kanker metastasen12,15,16,17. Bovendien, intercellulaire spanningen zijn voorgesteld om ook belangrijk in de endotheliale Celmigratie en endotheliale barrièrefunctie17,18. Hoewel er beide zijn gesuggereerd om een cruciale rol te spelen in de endotheliale intercellulaire stress generatie en-transmissie, blijft de rol van de kloof knooppunten ongrijpbaar, terwijl de knooppunten van de celcellen, zoals nauwe kruisingen en aanhekings knooppunten, allebei een Gap-knooppunten verbinden fysiek aangrenzende cellen en zorgen voor een pad voor elektrische stroom en moleculen (< 1 kDa) om tussen de naburige cellen19,20,21te passeren. Hoewel endotheelcellen Express Cx37, Cx40, en Cx43 gap-knooppunten19,22, Cx43 is aantoonbaar de belangrijkste in termen van ziekteprogressie23. Bewijs van Cx43's belang kan worden gevonden in het feit dat genetische deletie van Cx43 in muizen resulteert in hypotensie24 en nadelige effecten heeft op angiogenese25. Daarnaast is Cx43 gedocumenteerd om belangrijk te zijn voor Celmigratie en proliferatie en in de progressie van atherosclerose18,22,23,24,25 .
In dit protocol gebruikten we tfm en MSM om te onderzoeken of tractie en intercellulaire stress generatie binnen de confluente, endotheliale monolaag zou worden beïnvloed door de verstoring van de endotheliale gap junction Cx43. We verstoorde Cx43 met 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), een molecuul gedocumenteerd voor de remming van Cx43 expressie26. Chalcon werd gebruikt om Cx43 te verstoren in plaats van siRNA, omdat Chalcon eerder werd gerapporteerd door Lee et al. om Cx43 uitdrukking26te verstoren. Daarnaast waren we vooral geïnteresseerd in de invloed van chalcone op het endotheel omdat het ook is gemeld dat het een anti-inflammatoire en anti-bloedplaatjes verbinding is die mogelijk kan worden gebruikt voor de preventie en behandeling van verschillende vasculaire pathologieën26. Chalcone behandelingen werden uitgevoerd een uur na het begin van het experiment, chalcone-behandelde monolagen werden afbeelding gemaakt voor een totaal van zes uur, en beeldverwerking werd uitgevoerd met een aangepaste geschreven MATLAB code om te bepalen tractie en vervolgens intercellulaire Benadrukt. Onze resultaten toonden een algehele afname van de tractie en intercellulaire spanningen, wat suggereert dat Cx43 een sleutelrol speelt in de endotheliale biomechanica.

<table><tbody><tr><td>18 mm coverslip</td><td>ThermoFisher</td><td>18CIR-1</td><td>Onmisbaar om polyacrylamide gels plat te maken</td></tr><tr><td>2% bis-acrylamide</td><td>BIO-RAD</td><td>1610143</td><td>Component van polyacrylamide gel</td></tr><tr><td>2&prime;,5&prime;-Dihydroxychalcone</td><td>SIGMA</td><td>IDF00046</td><td>Om de Cx43 structuur te verstoren</td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td><td>SIGMA</td><td>2530-85-0</td><td>Stockoplossing om bind-silaanmengsel met azijnzuur en ultra-zuiver water te maken</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>Component van polyacrylamide gel</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>64-19-7</td><td>Onmisbaar om bind-zoutoplossing te maken</td></tr><tr><td>Alexa Fluro 488 geiten-anti-muis IgG;</td><td>ThermoFisher</td><td>Catalog # A-11001</td><td>Secundaire antistof</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>BIO-RAD</td><td>1610700</td><td>Polyacrylamide gel polymerisatiemiddel</td></tr><tr><td>Rundserumalbumine (BSA)</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td>Om blokkeeroplossing te maken</td></tr><tr><td>Rund Type I Atelo-Collageen Oplossing, 3 mg/mL, 100 mL</td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005-100ML</td><td>Gebruiken als extracellulaire matrix</td></tr><tr><td>Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>21040CV</td><td>Bufferoplossing nodig voor celcultuur</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>67-68-5</td><td>Om chalcone op te lossen en stockoplossing te maken</td></tr><tr><td>Fluoromount-G met DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4959-52</td><td>Montagemedium voor immunokleuring gebruikt om te kleuren voor DAPI</td></tr><tr><td>Fluorescente microsfeer Carboxylaat-gemodificeerde korrels</td><td>ThermoFisher</td><td>F8812</td><td>0,5 micrometer carboxylaat-gemodificeerde korrels (rood), 2% vaste stoffen</td></tr><tr><td>HEPES bufferoplossing 1 M</td><td>SIGMA</td><td>7365-45-9</td><td>Onmisbaar om</td></tr><tr><td>LVES</td><td>ThermoFisher</td><td>A1460801</td><td>Onmisbare HUEVC media 200 supplement</td></tr><tr><td>Medium 200</td><td>ThermoFisher</td><td>M200500</td><td>Onmisbaar medium voor HUVEC celcultuur</td></tr><tr><td>Muis monoklonaal Cx43 antilichaam (CX - 1B1)</td><td>ThermoFisher</td><td>Catalog #13-8300</td><td>Primaire antistof voor Cx43</td></tr><tr><td>Petrischaal (35 mm dia)</td><td>CellVis</td><td>D35-20-1.5H</td><td>35 mm petrischaal met een 20 mm middenputje</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td><td>Proteochem</td><td>102568-43-4</td><td>Onmisbaar om polyacrylamide geloppervlak te functionaliseren</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Siliconen Elastomer Kit</td><td>DOW corning</td><td>2646340</td><td>Siliconen elastomeer met uithardingsmiddel om PDMS te maken</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BIO-RAD</td><td>1610801</td><td>Polyacrylamide gel polymerisatiemiddel</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>9002-93-1</td><td>Om cellen te permeabiliseren</td></tr><tr><td>Trypsine -EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td>Gebruikt om cellen los te maken</td></tr></tbody></table>

perturbing endotheliale biomechanica via connexin 43 structurele verstoring

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Endotheelcellen zijn opgericht voor het genereren van intercellulaire spanningen en tractie's, maar de rol gap knooppunten spelen in endotheliale intercellulaire stress en tractie generatie is momenteel onbekend. Daarom presenteren we hier een op mechanica gebaseerd protocol om de invloed van Gap Junction connexin 43 (Cx43) op endotheliale biomechanica te hebben door de confluente endotheliale monolagen bloot te stellen aan een bekende Cx43 remmer 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) en meten van de impact van deze remmer op tractie en intercellulaire spanningen. We presenteren representatieve resultaten, die een afname vertonen in zowel tractie en intercellulaire spanningen onder een hoge Chalcon dosering (2 μg/ml) in vergelijking met controle. Dit protocol kan worden toegepast op niet alleen Cx43, maar ook op andere tussen punten, mits de juiste remmer wordt gebruikt. Wij geloven dat dit protocol nuttig zal zijn op het gebied van cardiovasculaire en mechanobiologie onderzoek.

Fase contrast beelden van controle, 0,2 μg/ml, en 2 μg/ml Chalcon behandelde monolagen werden 30 minuten voor Chalcon behandeling (Figuur 1A-C) en 2 uur na Chalcon behandeling (figuur1D-F) genomen. Cel-geïnduceerde kraal verplaatsingen (μm) werden waargenomen te verminderen in zowel de lage dosis Chalcon en hoge dosis Chalcon voorwaarden (Figuur 2E, F</strong...

Hier presenteren we een op mechanica gebaseerd protocol om de gap junction connexin 43 te verstoren en de daaropvolgende impact te meten die dit heeft op endotheliale biomechanica via observatie van tracties en intercellulaire spanningen.

Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Dit protocol is belangrijk omdat het het mogelijk maakt om opheldering te krijgen van de rol die cellulaire krachten spelen in veel fysiologische en pathologische processen, zoals wondgenezing en kankermetastasen, bijvoorbeeld. Het belangrijkste voordeel van deze op mechanica gebaseerde techniek is het vermogen om tegelijkertijd celcelverbindingen te verstoren en de impact ervan op celgegenereerde mechanische krachten, voornamelijk tracties en intercellulaire stressoren, te meten. Ons protocol is van toepassing op een breed scala aan pathofysiologische processen, zoals metastasen van kanker, atherosclerose en hypertensie, bijvoorbeeld.Onze methoden kunnen worden geïntegreerd om zowel biochemische als biomechanische analyse uit te voeren met organ-on-chip modellen, bio-engineered weefselconstructies, in vitro drug delivery systemen en weefsel co-cultuur systemen. Ons protocol is vrij eenvoudig uit te voeren. We raden degenen die dit protocol voor de eerste keer doen echter aan om geduld te hebben en niet door de stappen van dit protocol te haasten.Ons protocol heeft unieke stappen die mogelijk niet duidelijk zijn voor nieuwe gebruikers. Daarom moedigen we gebruikers aan om onze geschreven stapsgewijze procedures te volgen en visuele demonstraties als leidraad te gebruiken. Om te beginnen, bereid Blind-silane oplossing door het mengen van 200 milliliter ultra zuiver water met 80 microliter azijnzuur en 50 microliter van silaan methacrylaat.Roer de Bind-silane oplossing minstens een uur op een roerplaat. Behandel het midden goed van een petrischaaltje met de Bind-silane oplossing gedurende 45 minuten. Verwijder de Bind-silane oplossing en spoel de petrischaal twee tot drie keer af met ultra zuiver water.Droog het petrischaaloppervlak en bewaar op kamertemperatuur voor toekomstig gebruik. Om de hydrogeloplossing voor te bereiden, meng je 12,49 milliliter ultrazuiver water tot 2,062 milliliter van 40% acrylamide en 375 microliter van 2%bisacrylamide in een centrifugebuis van 15 milliliter. Voeg 80 microliter tl-kralen toe aan de hydrogeloplossing.Schud de buis voorzichtig om de kralen te mengen met de geloplossing. Houd de dop los op de centrifugebuis en plaats deze in een vacuümkamer. Ontgas de geloplossing gedurende ten minste 45 minuten in de vacuümkamer.Om de hydrogel te polymeriseren, voeg je eerst 75 microliters van 10% ammoniumpersulfaat toe en voeg dan acht microliters van TEMED toe aan de hydrogeloplossing. Plaats 24 microliter van de hydrogeloplossing in het midden van de petrischaal. Druk op de hydrogel met een afdekslip van 18 millimeter om de hydrogel plat te maken en maak een hoogte van ongeveer 100 micrometer.Wacht minstens 30 tot 40 minuten op gelpolymeerisatie. Dompel de gepolymeriseerde hydrogel onder in ultra zuiver water om geluitdroging te voorkomen. Bedek de petrischaal met aluminiumfolie om fotobleaching van fluorescerende kralen te voorkomen en op te slaan op vier graden Celsius.Meng eerst de PDMS siliconenbasis met het siliconen uithardingsmiddel met een verhouding van 20 tot één in een centrifugebuis van 50 milliliter. Keer de buis ondersteboven en schud meerdere keren krachtig om een goede mix van de PDMS-oplossing te garanderen. Verwijder de bellen in de PDMS-oplossing door één minuut te centrifugeren bij 190 keer G.Pour vijf tot zes milliliter van de PDMS-oplossing in het midden van een petrischaal van 100 millimeter en roer de schotel tot de PDMS-oplossing het gehele petrischaaloppervlak bedekt.Genees de PDMS-oplossing 's nachts op 50 tot 60 graden Celsius. Verwijder vervolgens een cirkelvormige PDMS-stencil met een gat puncher met een diameter van 16 millimeter. Gebruik een biopsiepunch met een diameter van 1,25 millimeter om kleine gaatjes in het PDMS-stencil te maken.Steriliseren PDMS stencils door ze onder te dompelen in 70% ethanol gedurende twee tot drie minuten, aspirating off overtollige ethanol en vervolgens onder een UV-licht gedurende vijf minuten. De overtollige vloeistof aanzuigen en de afdekslip uit de hydrogel verwijderen. Plaats het PDMS-stencil op het hydrogeloppervlak en gebruik een pincet om lichtdruk op het PDMS-stencil toe te passen om een waterdichte afdichting tussen het PDMS-stencil en het hydrogeloppervlak te garanderen.Bedek het oppervlak van de hydrogel met Sulfo-SAMPA opgelost in 0,1 molaire HEPES-bufferoplossing bij een concentratie van één tot 1.000 en plaats de hydrogel gedurende acht minuten onder een UV-lamp met een vermogen van 36 watt. Spoel de overtollige Sulfo-SAMPA- en HEPES-oplossing aan en spoel de hydrogel twee keer af met 0,1 molaire HEPES, gevolgd door nog eens twee spoelingen met ultra zuiver water. Aspirate overtollig ultra zuiver water en gebruik een 200-microliter pipet om de hydrogel te coaten met 0,1 milligram per milliliter collageen-1.Bedek de schotel om de tl-kralen te beschermen tegen fotobleaching en bewaar de hydrogel op vier graden Celsius 's nachts. Voeg nu drie milliliter 1X Trypsine toe in de kolf en plaats deze drie tot vijf minuten in de couveuse bij 37 graden Celsius om de cellen los te maken van de weefselkweekkolf. Na trypsinization, voeg drie milliliter van celcultuur media in de kolf, werveling om te mengen, en breng het mengsel in een 15-milliliter centrifuge buis.Centrifugeer de celoplossing gedurende drie minuten bij 1, 710 keer G.Aspirate de supernatant en schort de cellen in media opnieuw op tot een concentratie van 50 keer 10 tot de vier cellen per milliliter. Haal de hydrogelschotel uit de koelkast. Haal het collageen-1 uit de hydrogel en spoel één keer af met PBS.Voeg 75 keer 10 aan de derde cellen toe aan de bovenkant van het PDMS-stencil en laat de cellen zich minstens een uur hechten aan het hydrogeloppervlak in de couveuse bij 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Verwijder het PDMS-stencil en dompel het PDMS-stencil gedurende 10 tot 15 seconden onder in 10x Trypsin om eventuele aangesloten cellen te verwijderen. Voeg ten minste twee milliliter media toe aan de petrischaal en steriliseer het stencil door te spuiten met 70% ethanol en plaats vervolgens vijf minuten onder het UV-licht.Plaats de petrischaal minstens 36 uur in de couveuse, of totdat een confluent monolayer wordt waargenomen. Fasecontrastbeelden van 30 minuten voor de behandeling met chalcone en twee uur na de behandeling met chalcone werden vergeleken. Cel-geïnduceerde kraal verplaatsingen werden waargenomen te verminderen in zowel lage dosis chalcone en hoge dosis chalcone voorwaarden in vergelijking met controle HUVEC monolagen.Voorafgaand aan chalcone behandeling, RMS tracties waren ongeveer 51 Pascals voor alle voorwaarden. Na een chalcone behandeling was er een kleine toename van RMS-tracties tot 59 Pascals in met lage dosis chalcone behandelde monolagen en een bijna tweevoudige afname van RMS-tracties tot 18 Pascals in met hoge dosis behandelde monolagen in vergelijking met de controle. Chalcone behandeling verhoogde de gemiddelde normale intercellulaire stress omvang met lage dosis, maar aanzienlijk verminderde de gemiddelde normale intercellulaire stress omvang met een hoge dosis in vergelijking met controle.De chalcone behandeling verminderde ook de maximale pure intercellulaire spanningen bij zowel lage als hoge chalcone concentratie in vergelijking met de controle. Het effect van chalcone behandeling is statistisch significant op basis van zowel T-tests en single factor ANOVA-test. Terwijl u PDMS-stencil bovenop de gel plaatst, moet u ervoor zorgen dat de gel droog genoeg is om een waterdichte afdichting tussen het PDMS-stencil en de gel te garanderen.Dit protocol kan ook worden toegepast om de biomechanische bijdrage van een verscheidenheid van cel-celverbindingen, cytoskeletale proteïnen, celmatrix adhesiemoleculen, of extracellulaire molecules met levende beeldvorming te onderzoeken. Met dit in vitro protocol kunnen onderzoekers nu met succes een groot aantal biomechanische, evenals biochemische eigenschappen onderzoeken tijdens weefselherstel, wondgenezing of kankermetastasen zonder diermodel. We raden onze kijkers aan om heel voorzichtig te zijn tijdens de behandeling van chalcone en DMSO, omdat het inademen van deze geneesmiddelen schadelijk wordt gemeld.

perturbing-endothelial-biomechanics-via-connexin-43-structural

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Microscopische beeldvorming van levende endotheliale cellen die GFP-actine maakt karakterisering van dynamische veranderingen in het cytoskelet structuren. In tegenstelling tot technieken die vaste exemplaren te gebruiken, deze methode geeft een gedetailleerde evaluatie van de tijdelijke veranderingen in het actine cytoskelet in dezelfde cellen voor, tijdens en na de diverse fysieke, farmacologische of inflammatoire stimuli.

Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine

Microfluïdische stromingskamers geëtst door fotolithografie en vervaardigd uit PDMS worden toegepast op functionele resultaten in verband met EG-dysfunctie en ontsteking te onderzoeken. In een representatief experiment het vermogen van differentiële schuifspanning moduleren monocyte celhechting aan cytokine geactiveerd EC monolagen wordt aangetoond.

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

Verschillende niveaus en patronen van vloeistofschuifspanning zijn bekend om hun modulatie van endothèle genexpressie, fenotype en gevoeligheid voor ziekten. We bespreken de samenstelling en het gebruik van'schuifringen': een model dat unidirectionele, periodieke schuurspanningspatronen produceert. Schuifringen zijn eenvoudig te assembleren, economisch en kunnen hoge celopbrengsten produceren.

De Algemene Vergadering en de toepassing van &#39;Shear Rings&#39;: A Novel endotheliale Model voor Orbital, Unidirectionele en Periodieke Fluid Flow en Shear Stress

Een cel cultuur model van weerstand slagaders wordt beschreven, waardoor de dissectie van signalering van trajecten in endotheel, gladde spieren, of tussen endotheel en gladde spieren (de kruising van de myoendothelial). De selectieve toepassing van agonisten of eiwit isolatie, elektronenmicroscopie of immunofluorescentie kan worden gebruikt met behulp van deze cel cultuur model.

Een cel cultuur Model van weerstand slagaders

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC's) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

We beschrijven een protocol om menselijke venaeuze veneuze endotheelcellen (hSVECs) te isoleren en te kweken. We bieden ook gedetailleerde methoden om schuifspanning en rek te produceren om mechanische spanning in hSVECs te bestuderen.

Isolatie van menselijke sapheneuze ader-endotheelcellen en blootstelling aan gecontroleerde niveaus van schuifspanning en rek

Hier presenteren we een assembloid-modelsysteem om peescellulaire overspraak na te bootsen tussen het dragende peeskernweefsel en een extrinsiek compartiment met celpopulaties die worden geactiveerd door ziekte en letsel. Als belangrijke use case laten we zien hoe het systeem kan worden ingezet om ziekterelevante activering van extrinsieke endotheelcellen te onderzoeken.

Engineering Tendon Assembloids om cellulaire overspraak bij ziekte en reparatie te onderzoeken

Leer een mechanische aanpak om connexin 43 te verstoren en de impact op endotheliale biomechanica te meten via tractions en intercellulaire spanningen. Deze methode integreert biochemische en biomechanische analyses.

Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring

Meer video's verkennen