Name: Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Leer adoptieve celtherapie met iPSC-afgeleide HBV-specifieke T-lymfocyten om hepatitis B-virusreplicatie effectief te onderdrukken in muizen. Deze methode biedt een veelbelovende basis voor immunotherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Dr. Adam J Gehring van het Toronto General Hospital Research Institute voor het verstrekken van cDNA voor HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-specifieke a2-beperkte humane-Murine Hybrid TCR-genen, en Dr. Pei-Jer Chen van de nationale universiteit van Taiwan voor het verstrekken van pAAV/HBV 1,2 construct. Dit werk wordt ondersteund door het National Institute of Health Grant R01AI121180, R01CA221867 en R21AI109239 to J. S.

Alle dier experimenten zijn goedgekeurd door de Texas A & M University Animal Care Committee (IACUC; #2018-0006) en worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de vereniging voor de beoordeling en accreditatie van laboratoriumdieren zorg. Muizen worden gebruikt tijdens de leeftijd van 6 – 9 weken.
1. generatie van virale AG-specifieke CD8+ t-cellen van ipscs (IPSC-CD8+ t-cellen)
<ol><li>Creatie van de retrovirale constructies Opmerking: TCR α-en β-genen zijn gekoppeld aan een zelfcleagerende sequentie van 2A. De retrovirale vector mscv-IRES-dsred (midr) is dsred+ 23.<ol>
<li>Sub-Clone HBs183-191 (flltrilti)-specifieke a2-restricted mens-Murine Hybrid TCR (S183 TCR) genen (vα 34 en Vβ28) in de midr om de S183 midr constructie te creëren (Figuur 1A)25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retrovirale transductie NB: de Platinum-E (plat-E) cellen worden gebruikt voor het verpakken van retrovirussen (met s183 TCR-genen), die gebruikt zullen worden voor retrovirale transductie. De plat-E-cellen zijn een effectieve retrovirus-verpakkings cellen die aan de 293T-cellen ten grondslag liggen, die zijn ontwikkeld door middel van unieke verpakkings constructies via de EF1α-promotor voor het uitdrukken van eiwit met retrovirale structuur, waaronder gag, Pol en ecotropic env.<ol>
<li>Op een 100 mm kweek schotel, zaad 3 x 106 plat-E cellen in 8 ml DMEM kweekmedium met 10% foetaal kalf serum (FCS) in een incubator bij 37 ° c met 5% Co2, 1 dag voor de trans fectie.</li>
		<li>Op dag 0, transfect de s183 MiDR construct in de plat-E cellen met behulp van een DNA-transfectie reagens25.</li>
		<li>Op dag 1, zaad 1 x 106 ipscs (GFP+) in een gelatine voorgecoate kweek plaat.</li>
		<li>Op dagen 2 – 3, verzamelen retrovirussen-bevattende supernatant van plat-E celcultuur om iPSCs met de s183 TCR in de aanwezigheid van 1,6-dibromohexaan oplossing25.</li>
		<li>Op dag 4, trypsinize de s183 TCR gen-transduced iPSCs, centrifugeer bij 400 x g voor 5 min en zaad 3 × 105 ipscs in een 100 mm kweek schotel voorgecoat met 3 x 106 bestraalde SNL76/7 (irSNL76/7) feeder cellen25.</li>
		<li>Op dag 5 of 6 van samenvloeiing, trypsinize de cellen, centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten en proces voor het sorteren van cellen. Gating op levende cellen, Sorteer GFP en DsRED dubbel-positieve cellen (de s183 TCR gen-transduced iPSCs) met behulp van een hoge-snelheid cel sorteerder. Vergelijkbaar met stap 1.2.5, co-cultuur de gesorteerde cellen op irSNL76/7 feeder cellen voor toekomstig gebruik25.</li>
	</ol></li>
	<li>Differentiatie van HBV-specifieke iPSC-CD8+ T-cellen Opmerking: de OP9-DL1/DL4 stromale cellen vertonen zowel notch liganden DL1 en DL4, en co-culturing ipscs met de ipscs kunnen notch signalering-gemedieerde T-celdifferentiatie26bevorderen.<ol>
<li>Groeien s183 TCR gen-transduced ipscs (s183/ipscs) in de OP9-DL1-DL4 Cell monolaag in α-minimum Essential medium (MEM) media met 20% foetaal runderserum (FBS)27. Omvatten Murine Flt3 ligand (mFlt-3L; eindconcentratie = 5 ng/mL) in de cultuur.</li>
		<li>Op dag 0, zaad 0.5 – 1.0 x 105 S183/ipscs in een 10 cm cultuur schotel eerder GEGROEID met OP9-DL1-DL4 cellen. Valideer dat de OP9-DL1-DL4 Cells in een voorwaarde van 80% – 90% confluency zijn.</li>
		<li>Spoel op dag 5 de iPSCs af met 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), zuig de PBS uit, voeg dit toe aan 4 mL 0,25% trypsine en 37 incupeer gedurende 10 min. daarna, voeg een aanvullende 8 mL iPSC-media toe om trypsine-spijsvertering te beëindigen. Verzamel alle spijsverterings oplossingen die de cellen bevatten en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 15 – 30 °c.</li>
		<li>Aspireren de supernatant en respenderen cellen in 10 mL iPSC media. Breng de celsuspensie over naar een nieuwe 10 cm Petri plaat en inculeer 30 minuten in een incubator bij 37 °C.</li>
		<li>Verzamel na 30 minuten de iPSC-media met de zwevende cellen. Geef de celsuspensie door een 70 μm celzeef en bereken het celnummer.</li>
		<li>Zaad 5 x 105 cellen in de cultuur schotel eerder gegroeid OP9-DL1-DL4 cellen met een voorwaarde van 80% – 90% Confluent Health zoals beschreven in stap 1.3.1. Opmerking: voor T-celdifferentiatie, elke 2 – 3 dagen, moeten de iPSC-afgeleide cellen opnieuw worden nageslacht met een nieuwe laag van de OP9-DL1-DL4-cellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluatie<ol>
<li>Morfologische veranderingen van differentiërende iPSCs<ol>
<li>Observeer de cellen onder een microscoop op verschillende dagen. Let op: op dag 5 hebben kolonies mesoderm-achtige kenmerken, die een klassieke spindel vorm morfologie vertonen die lijkt op humane dermale fibroblasten en aanhoudende groei in vitro. Op dag 8 beginnen kleine ronde clusters van cellen te verschijnen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analyse van het differentiëren van iPSCs door flow cytometrie<ol>
<li>Analyseer op verschillende dagen van co-cultuur iPSC-afgeleide cellen zoals eerder beschreven25 (afbeelding 1B, C).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Functionele analyse van differentiërende iPSCs<ol>
<li>Op dag 28 van co-cultuur, verzamelen iPSC-CD8+ T cellen uit culturen door het oogsten van de zwevende cellen, trypsinize de overgebleven cellen met 0,25% trypsine, re-Suspend in 8 ml IPSC media, centrifuge gedurende 5 min bij 400 x g bij 15 – 30 ° c, verwijder de media, vervolgens de cellen in 10 mL media hervatten.</li>
			<li>Houd de hersuspendeerde cellen in een verse 10 cm schaal in een incubator van 37 °C gedurende 30 minuten en monteer de zwevende cellen. Spoel de cellen vervolgens één keer met een koude PBS.</li>
			<li>Incuberen 3 x 106 T cel-uitgeputte splenocyten (CD4-CD8-) van milt van H-2 klasse I Knockout, HLA-a 2.1-transgene (hhd) muizen met 5 ΜM S183 peptide (flltrilti) in 200 μL media bij 4 °c gedurende 30 minuten.</li>
			<li>Produceer een mengsel van iPSC-CD8+ T cellen met splenocyten gepulseerd met s183 peptide (T cellen: splenocytes = 1:4; gebruik 0,75 x 106 T cellen). Incuberen het mengsel van cellen bij 37 °C in een CO2 -incubator voor 40 uur. Voeg gedurende de laatste 7 uur 4 μL verdunde brefeldin A toe aan de kweek (uiteindelijke concentratie van 1.000 x, die in 1x kweekmedia zal worden verdund) om transportprocessen tijdens de celactivatie te blokkeren.</li>
			<li>Beits de cellen en voer een flowcytometrische analyse uit van intracellulaire IFN-γ zoals eerder beschreven (Figuur 2).</li>
		</ol>

</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. inductie van HBV-replicatie via hydrodynamische levering van HBV plasmide
Opmerking: pAAV/HBV 1.2 construct is gegenereerd zoals eerder beschreven9. Het HBV 1,2 complete DNA is opgenomen in de vector pAAV.
<ol><li>Hydrodynamische leveringen van HBV plasmide via de staart ader<ol>
<li>Verwarm HHD-muizen met een warmte lamp gedurende 5 minuten in de kooi om de staart ader te verwijden.</li>
		<li>Houdt het dier aan door middel van een fixator en reinig de muis staarten met 70% ethanol spray.</li>
		<li>Levering van plasmide in de lever.</li>
		<li>Meet het lichaamsgewicht van de muis met behulp van een meetschaal.</li>
		<li>Verdun 10 μg HBV plasmide in het 8% equivalent van de lichaamsmassa PBS (bijv. 1,6 mL voor een muis van 20 g). Plaats verdunde plasmide in een injectiespuit van 3 mL met een hypodermische naald van 26 G × 1⁄2"(0,45 × 12 mm).</li>
		<li>Zoek een van de twee laterale staart aders in het middelste derde deel van de staart en plaats de naald in een laterale ader. Dien de injectie met HBV-plasmide toe via de staart ader binnen 3-5 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kwantificering van hersenen uit bloed serum van geïnfecteerde muizen Opmerking: HBV-replicatie vindt plaats vanaf dag 3 – 35 in het muis serum. De DNA-replicatie pieken op dag 7 en vermindert geleidelijk. Het HBV-DNA wordt tot dag 35 niet uit het serum gewist.<ol>
<li>Verzameling van bloed serum van geïnfecteerde muizen<ol>
<li>Verzamel ongeveer 0,1 mL bloed in een microcentrifuge buis van elke muis op 3, 5, 7 en 10 dagen na de infectie door een retroorbitale bloeding in een micro centrifugebuis van 1,5 mL, en inincuberen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 20 minuten.</li>
			<li>Centrifugeer het monster bij 6.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c en verzamel het serum supernatant na centrifugeren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reinig het DNA uit het bloed serum met behulp van een in de handel verkrijgbare DNA-extractie Kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Kort, Lyse de cellen in een kolom op basis van silica, voert de wassing uit en extraheer DNA door 100% ethanol toe te voegen aan de elutie kolom en centrifugeren bij 6000 x g gedurende 1 minuut. ELUEER het dna in 50 ΜL RNase-vrij water.</li>
		<li>Gebruik 100 ng van HBV DNA uit de elutie voor real-time PCR-analyse. Gebruik de volgende primers en sondes: Forward 5 ' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3 '; omgekeerde 5 ' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3 '; Probe 5 ' TCACCTCTGCCTAATC 3 '.<ol>
<li>Gebruik HBV genoom met plasmide (pAAV/HBV 1.2) voor standaard curve en voer real-time PCR uit in een totaal volume van 10 μL (Figuur 3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Stel de PCR-reactie op in een totaal volume van 10 μL, zoals weergegeven in tabel 1.</li>
		<li>Stel het PCR-programma in de Thermocycler in zoals weergegeven in tabel 2. De geprogrammeerde temperatuur-overgangssnelheid is 20 °C/s voor denaturatie/gloeien en 5 °C/s voor verlenging. Meet de fluorescentie aan het einde van de gloeien fase voor elke cyclus voor real-time PCR-bewaking.</li>
	</ol>

</li>
</ol>3. reductie van HBV-replicatie door daad van virale AG-specifieke iPSC-CD8+ T-cellen
<ol><li>Adoptieve celoverdracht (ACT)<ol>
<li>Differentiëren s183/iPSCs (1.3.7) op de OP9-DL1-DL4 stromale cellen in aanwezigheid van mFlt-3L en mIL-7 gedurende 8 dagen, zoals beschreven in paragraaf 1,3.</li>
		<li>Verzamel op dag 22 iPSC-CD8+ T-cellen van de 10 cm plaat met trypsine, was en revoer elke 10 cm plaat in 10 ml verse media. Voeg de cellen toe aan een verse 10 cm plaat en keer 30 minuten terug naar de incubator zoals gedaan in paragraaf 1,3. Verzamel na 30 minuten zwevende cellen.</li>
		<li>Gebruik een 70 μm nylon zeef om cellen te passeren om celclusters te elimineren en het celnummer te tellen. Pas de cellen aan een concentratie van 1,5 x 107 cellen/ml in koude PBS oplossing en gebruik een 70 μm nylon zeef om cellen te passeren om celclusters opnieuw te elimineren indien nodig. Houd cellen op ijs totdat de ACT.</li>
		<li>Injecteer 200 μL celsuspensie (3 x 106 cellen) in 4 – 6 week oude hhd-muizen via de staart ader.</li>
	</ol></li>
	<li>Inductie van HBV-replicatie<ol>
<li>Voer op dag 14 na celoverdracht de hydrodynamische afgifte van HBV plasmide uit via de staart ader zoals beschreven in punt 2,1.</li>
	</ol></li>
	<li>Virus eiwit detectie van geïnfecteerde lever<ol>
<li>Offer muizen op dag 3, 5, 7, 14 en 21 na infectie. Gebruik voor euthanasie in elke kooi 1 – 2 L koolstofdioxide (CO2) in de eerste fase. Wanneer het dier het bewustzijnsverlies ontwikkelt, krijgt de CO2 -stroomsnelheid rond 4 – 5 L/min. euthanasie van de muis uitvoeren met co2 inademing.</li>
		<li>Scheid de lever door het snijden van de oppervlakte huid van het peritoneum met behulp van een schaar en een tang en sleep de lever lichtjes terug om de inwendige huid te onthullen die de peritoneale holte binnendoet. Verzamel en snijd lever monsters (lengte x breedte x hoogte = 0,5 cm x 0,5 cm X 0,3 cm) van de geïnfecteerde muizen om gemakkelijk in de insluitings cassette te passen en Blokkeer in 10% neutrale buffer formaline voor 4 – 24 h.</li>
		<li>Decalcify de lever samplesusing 2,5 M mierenzuur; Spoel in xyleen gedurende 3 minuten, spoel 2x in 100% ethanol, spoel 2x in 95% ethanol, spoel 2x in gedeïoniseerd (DI) water gedurende 2 minuten en onthaf vervolgens de lever monsters in 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) dienovereenkomstig. Handgreep bij een sub-kooktemperatuur (90 °C) gedurende 20 min.</li>
		<li>Koel de vaste lever weefsels gedurende 30 min. Spoel de weefsels met 1x PBS gedurende 4 minuten en sluit de weefsels in paraffine in. Dehydraat de weefsels in een reeks toenemende concentraties ethanol om het water te vervangen en dompel vervolgens onder in de onderdompeling in xyleen. Embed de geïnfiltreerde weefsels in Wax blokken. Maak gelijkmatig verticaal en horizontaal snijden voor vlekken. Maak 4 μm profielen met een schuivende microtoom.</li>
		<li>Geef de secties door de deparaffinisatie en rehydratie met behulp van xyleen en ethanol en voer vervolgens immunofluorescentie kleuring van de secties uit.</li>
		<li>Beits de delen met 200 μL HBV oppervlak AG-specifiek antilichaam (1:100 verdunning in de blokkerende oplossing). Inbroed de delen met het antilichaam voor 2 uur bij RT in een 75% – 100% bevoficeerde kamer, en was 5x in 1x PBS gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Gebruik een anti-fade-reagens met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) voor nucleaire kleuring om de dia's tegen te gaan. Voeg de afdek toe met ongeveer 300 μL van de verdunde DAPI-kleurings oplossing (300 nm in 1x PBS) en valideer de gehele afdek cover. Houd de glaasjes in het donker bij 4 °C tot de inspectie onder een fluorescerende Microscoop.</li>
	</ol></li>
	<li>Inflammatoire celinfiltratie in geïnfecteerde muizen<ol>
<li>Offerande muizen zoals beschreven in stap 3.3.1. Verzamel de lever en maak secties zoals beschreven in stap 3.3.4.</li>
		<li>Vlek de sectie met hematoxyline en eosine (H & E) om infiltratie van ontstekingscellen in de lever te evalueren.</li>
		<li>Bewaar dia's in het donker bij 4 °C tot verdere analyse onder een fluorescerende Microscoop.</li>
		<li>Visualiseer dia's onder een fluorescentiemicroscoop om de infiltratie van ontstekingscellen in de lever te detecteren (Figuur 4).</li>
	</ol></li>
	<li>HBV DNA detectie van geïnfecteerde lever<ol>
<li>Isolatie van virale DNA.</li>
		<li>Euthaniseer muizen en verzamel de lever monsters volgens paragraaf 3,3.</li>
		<li>Lyse de lever weefsels in Nonindet P-40 (NP-40) lysisbuffer (50 mM tris-HCL, 1 mM EDTA, 1% NP-40) bevattende een cocktail van de proteaseremmer.</li>
		<li>Centrifugeer kort op 16.000 x g om de kernen en celresten te verwijderen.</li>
		<li>Incuberen het cytoplasminezuur lysaat met micrococcal Nuclease (Nuclease S7; 150 eenheden/mL) en CaCl2 (5 mm) bij 37 °c gedurende 90 min om het nucleïnezuur buiten de nucleocapsiden (nc's) te degraderen.</li>
		<li>Inactiveren van de Nuclease S7 door toevoeging van 10 mM EDTA.</li>
		<li>Neerslaan van de nucleocapsiden met polyethyleenglycol (PEG), verstoren door 0,5% natriumdodecylsulfaat (SDS), en Digest met 0,6 mg/ml proteïnase K (PK) bij 37 °c gedurende 1 uur.</li>
		<li>Herstel de virale nucleïnezuren door fenol chloroform extractie en ethanol precipitatie.</li>
		<li>Los het geëxtraheerde virale DNA op een 1,2% agarose-gel op en Detecteer door de standaard Southern blot-analyse met behulp van een32 P-GELABELDE HBV-DNA-sonde.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Scaglione, S. J., Lok, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+hepatitis+B+treatment+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice.</a> Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).</li>
<li>Osiowy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+infancy+and+beyond...+ensuring+a+lifetime+of+hepatitis+B+virus+%28HBV%29+vaccine-induced+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).</li>
<li>Gish, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+HBsAg+antigen+during+treatment+with+entecavir+or+lamivudine+in+nucleoside-naive+HBeAg-positive+patients+with+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B.</a> Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).</li>
<li>Kurktschiev, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+CD8%2B+T+cells+in+hepatitis+B+and+C+are+characterized+by+a+lack+of+antigen-specific+T-bet+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).</li>
<li>Fisicaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+intrahepatic+T-cell+responses+can+be+restored+by+blocking+programmed+death-1+pathway+in+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B.</a> Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).</li>
<li>Schurich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+signal+cytokine+IL-12+rescues+the+anti-viral+function+of+exhausted+HBV-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208(2013).</li>
<li>Gehring, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+virus-specific+T+cells+that+target+HBV+infected+hepatocytes+and+hepatocellular+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+Tumor+Necrosis+Factor-alpha+Produced+by+T+Cells+Reduce+the+HBV+Persistence+Form%2C+cccDNA%2C+Without+Cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis.</a> Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).</li>
<li>Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocompetent+mouse+model+for+the+tolerance+of+human+chronic+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).</li>
<li>Wong, P., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+T+cell+responses+to+infectious+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD8 T cell responses to infectious pathogens.</a> Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).</li>
<li>Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+hepatitis+B+virus+clearance+in+chimpanzees%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8%2B+T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117 (3), 808-814 (2011).</li>
<li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+murine+CD8%2B+and+CD4%2B+T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).</li>
<li>Kuball, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+matched+pairing+and+expression+of+TCR+chains+introduced+into+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells.</a> Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).</li>
<li>Cameron, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Titin-derived+HLA-A1-presented+peptide+as+a+cross-reactive+target+for+engineered+MAGE+A3-directed+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells.</a> Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).</li>
<li>Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1-+and+CTLA-4-based+inhibitory+chimeric+antigen+receptors+%28iCARs%29+divert+off-target+immunotherapy+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses.</a> Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).</li>
<li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+expressing+chimeric+antigen+receptors+can+cause+anaphylaxis+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunolology+Research%22%5BJournal%5D)">T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans.</a> Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).</li>
<li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li>
<li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4-induced+pluripotency+in+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells.</a> Cell. 136 (3), 411-419 (2009).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3986(2012).</li>
<li>Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+naive+single-type+tumor+antigen-specific+CD8%2B+T+lymphocytes+from+murine+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells.</a> OncoImmunology. 6, (2017).</li>
<li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+Immunotherapy+in+Mice+Using+Genetically+Engineered+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).</li>
<li>Tan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Expression+Profiles+of+HBV+DNA+Integrated+Into+Genomes+of+Hepatocellular+Carcinoma+Cells+to+Select+T+Cells+for+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy.</a> Gastroenterology. , (2019).</li>
<li>Wu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6C%28%2B%29+Monocytes+and+Kupffer+Cells+Orchestrate+Liver+Immune+Responses+Against+Hepatitis+B+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice.</a> Hepatology. , (2019).</li>
<li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+tissue-associated+regulatory+T+cells+suppress+the+activity+of+pathogenic+cells+in+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insights%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).</li>
<li>Chisari, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+pathological+effects+of+synthesis+of+hepatitis+B+virus+large+envelope+polypeptide+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).</li>
<li>Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+tolerance+leads+to+autoantibody+production+but+not+autoimmune+liver+disease+in+hepatitis+B+virus+envelope+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol presenteert een methode voor het genereren van de virale AG-specifieke iPSC-CTLs voor gebruik als ACT te onderdrukken HBV replicatie in een model van de Murine. Bij chronische HBV-infectie vormt het virale genoom een stabiel mini-chromosoom, het covalent gesloten cirkelvormige DNA (cccDNA) dat gedurende de levensduur van de hepatocyte kan aanhouden. Gericht op de klaring van het virale mini-chromosoom kan resulteren in een genezing van chronische HBV-infectie. De huidige antivirale therapie richt zich op het...

Na acute infectie regelt het adaptieve immuunsysteem (d.w.z. de humorale en cellulaire immuniteit) het grootste deel van de acute HBV-gerelateerde hepatitis. Toch kunnen een aantal mensen in de HBV-endemische regio's de virussen niet elimineren en vervolgens converteren als chronische individuen. Meer dan 25% van de chronische patiënten (> 250 miljoen mensen) wereldwijd ontwikkelen progressieve leverziekte, resulterend in levercirrose en/of hepatocellulaire carcinoom (HCC)1. Als gevolg daarvan blijft het uitroeien van de met de ziekte besmette cellen een algemeen gezondheidsprobleem, ook al is er een beschikbaar vaccin2 en zijn er talrijke antivirale geneesmiddelen in ontwikkeling. Standaardbehandeling voor HBV-infectie omvat IFN-α, nucleoside en nucleotide-analogen. Deze agenten hebben directe antivirale activiteit en immuun modulatoire capaciteiten. Niettemin verschijnen seroconversie van HBe-antigenen (AG)+ -dragers met anti-HBe antilichaam (AB) en verlies van serum HBV-deoxyribonucleïnezuur (DNA) afzonderlijk in ongeveer 20% van de behandelde patiënten en volledige immunologische controle van het virus geverifieerd door de ontbering van de HBsAg is niet meer dan 5%3. Bovendien is de respons op de behandeling vaak niet duurzaam. Profylactische vaccinatie met recombinant HBs AG is zeer effectief in het voorkomen van infecties, maar therapeutische HBs AG vaccinatie is niet effectief. Duidelijk, T cel-gemedieerde immuunresponsen spelen een cruciale rol bij het beheersen van HBV infectie en leverinsufficiëntie; echter, bij chronische hepatitis patiënten, HBV-reactieve T cellen worden vaak verwijderd, disfunctioneel, of omzetten uitgeput4,5,6. Dientengevolge, bij personen met aanhoudende HBV-infectie, geen pogingen om HBV-specifieke immuniteit (d.w.z., T cel-gebaseerde immuniteit) te herstellen door middel van anti-virale remedie, immuno-modulerende cytokines, of curatieve immunisatie hebben succes bereikt.
Adoptieve celoverdracht (Act) van HBV AG-specifieke T-cellen is een efficiënte behandeling gericht op het uiteindelijk uitroeien van resterende hepatocyten wih HBV7,8. ACT van HBV-specifieke Ctl's in HBV geïnfecteerde muizen is aangetoond dat voorbijgaande, milde hepatitis veroorzaken, en een dramatische daling in HBV ribonucleïnezuur (RNA) transcripties in hepatocyten. In deze studies, Ctl's niet remmen transcriptie van HBV genen maar verbeterde de afbraak van HBV transcripten9. HBV-specifieke Ctl's zijn belangrijk om virale infectie te voorkomen en bemiddel de klaring van HBV10,11. Voor Act-based remedies is voorgesteld om in-vitro expansie van HBV-specifieke T-cellen met een hoge reactiviteit voor in vivo hervestiging een ideale methode te zijn12,13,14; Niettemin zijn de huidige benaderingen beperkt met betrekking tot hun capaciteiten om de juiste hoeveelheden en kwaliteiten van HBV-specifieke T-cellen van patiënten voor de mogelijke therapieën te genereren, te scheiden en te laten groeien.
Hoewel klinische proeven aanwezige veiligheid, uitvoerbaarheid, en potentiële therapeutische activiteit van cel-gebaseerde behandelingen door middel van engineered T cellen die specifiek zijn voor HBV virus geïnfecteerde hepatocyten, er zijn zorgen over de ongunstige effecten die zich voordoen bij auto-immuunresponsen vanwege cross-reactiviteit van de verkeerde T Cell receptor (TCR)15,16, off-target AG herkenning door niet-specifieke TCR17 en on-target off-toxiciteit door een chimeer AG receptor (auto) 18 , 19 met gezonde weefsels. Op dit moment zijn de genetisch gemodificeerde T-cellen, die alleen kortstondige persistentie in vivo hebben, meestal tussenliggende of latere Effector T-cellen. Tot op heden zijn pluripotente stamcellen (pscs) de enige bron die beschikbaar is voor het genereren van hoge aantallen naïeve single-type AG-specifieke T-cellen20,21,22,23. Geïnduceerde PSCs (iPSCs) worden eenvoudig omgezet van somatische cellen van een patiënt door het gebruik van gentransductie van verschillende transcriptiefactoren. Als gevolg hiervan hebben de iPSCs vergelijkbare kenmerken als die van embryonale stamcellen (ESCs)24. Vanwege de flexibiliteit en de mogelijkheid voor het oneindige vermogen om zichzelf te verlengen, kunnen, naast weefsel vervanging, iPSC-behandelingen op grote schaal worden toegepast in regeneratieve geneeskunde. Bovendien kunnen de onderliggende regimenten van iPSCs de huidige op cellen gebaseerde therapieën aanzienlijk verbeteren.
Het algemene doel van deze methode is om een grote hoeveelheid HBV-specifieke Ctl's te genereren van iPSCs (d.w.z. iPSC-CTLs) voor op ACT gebaseerde immunotherapie. De voordelen ten opzichte van alternatieve technieken zijn dat HBV-specifieke iPSC-Ctl's een single-type TCR en naïef fenotype hebben, wat resulteert in meer geheugen T celontwikkeling na de ACT. Het is aangetoond dat de wet van HBV-specifieke iPSC-CTLs verhoogt de migratie van functionele CD8+ T cellen in de lever en vermindert HBV replicatie in zowel de levers en bloed van de toegediende muizen. Deze methode onthult een potentieel gebruik van virale AG-specifieke iPSC-CTLs voor HBV-immunotherapie en kan worden aangepast om andere virale AG-specifieke iPSC-T-cellen voor virale immunotherapie te genereren.

<table><tbody><tr><td>HHD muizen</td><td>Institut Pasteur, Paris, Frankrijk</td><td></td><td>H-2 klasse I knockout, HLA-A2.1-transgene (HHD) muizen</td></tr><tr><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td><td>RIKEN Cell Bank</td><td>APS0001</td><td></td></tr><tr><td>SNL76/7</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1049</td><td></td></tr><tr><td>OP9</td><td>ATCC</td><td>CRL-2749</td><td></td></tr><tr><td>pAAV/HBV1.2 plasmide</td><td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan)</td><td></td><td>HBV DNA-construct</td></tr><tr><td>HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specifieke TCR-genen</td><td>Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada)</td><td></td><td>FLLTRILTI-specifieke A2-beperkte mens-muis hybride TCR-genen (V&alpha;34 en V&beta;28)</td></tr><tr><td>OVA257&ndash;264-specifieke TCR-genen</td><td>Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA)</td><td></td><td>SIINFEKL-specifieke H-2Kb-beperkte TCR-genen</td></tr><tr><td>Anti-CD3 (17A2) antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>100236</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44 (IM7) antilichaam</td><td>BD Pharmingen</td><td>103012</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (GK1.5) antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 (53-6.7) antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>100732</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&gamma; (XMG1.2) antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TNF-a (MP6-XT22) antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>506306</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HBs antilichaam</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA5-13059</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion cell sorter</td><td>BD</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>MilliporeSigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>GeneJammer</td><td>Agilent</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentameer</td><td>Proimmune</td><td>F027-4A - 27</td><td></td></tr><tr><td>HRP Anti-Mouse Secundair Antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A27025</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>Peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease S7</td><td>Roche</td><td>10107921001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6148-500G</td><td>Let op: Allergeen, Carcinogeen, Toxisch</td></tr><tr><td>Permeabilisatie buffer</td><td>Biolegend</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&trade; Gold Antifade Mountant met DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td></td></tr></tbody></table>

stamcel afkomstige virale ag-specifieke t-lymfocyten onderdrukken hbv-replicatie bij muizen

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Infectie met het hepatitis B-virus (HBV) is een wereldwijde gezondheidskwestie. Met meer dan 350.000.000 mensenwereld wijd getroffen, de HBV infectie blijft de belangrijkste oorzaak van leverkanker. Dit is een grote zorg, vooral in ontwikkelingslanden. Falen van het immuunsysteem om een effectieve reactie tegen HBV te monteren leidt tot chronische infectie. Hoewel HBV-vaccin aanwezig is en nieuwe antivirale geneesmiddelen worden aangemaakt, blijft de uitroeiing van virus reservoir cellen een belangrijk gezondheids onderwerp. Hier beschreven is een methode voor het genereren van virale antigeen (AG)-specifieke CD8+ cytotoxische T lymfocyten (ctl's) afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (ipscs) (dat wil zeggen, IPSC-CTLS), die de mogelijkheid hebben om HBV-replicatie te onderdrukken. HBV-replicatie wordt efficiënt geïnduceerd bij muizen via hydrodynamische injectie van een HBV-expressie plasmide, pAAV/HBV 1.2, in de lever. Vervolgens, HBV oppervlak AG-specifieke muis iPSC-Ctl's zijn adoptively overgebracht, die sterk onderdrukt HBV replicatie in de lever en bloed, alsmede voorkomt dat HBV oppervlakte AG expressie in hepatocyten. Deze methode demonstreert HBV-replicatie in muizen na hydrodynamische injectie en die door stamcel afkomstige virale AG-specifieke Ctl's kunnen de HBV-replicatie onderdrukken. Dit protocol biedt een nuttige methode voor HBV-immunotherapie.

Zoals hier wordt weergegeven, worden HBV virale AG-specifieke iPSC-CD8+ T-cellen gegenereerd door een in vitro cultuur systeem. Na handeling van deze virale AG-specifieke iPSC-CD8+ T cellen onderdrukken HBV replicatie in een Murine model (aanvullend bestand 1) aanzienlijk. Muis IPSC zijn getransduceerde met de midr retrovirale construct coderen van een mens-muis hybride HBV TCR gen (HBS183-191-specifieke, s183), dan zijn de gen-getransduceerde ipscs co-gekweekte met OP9-D...

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in adoptieceloverdracht van iPSC-afgeleide virale antigeenspecifieke T-cel voor effectieve onderdrukking van HBV-replicatie bij muizen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de iPSC-afgeleide virale antigeen-specifieke T-cellen een enkel type T-celreceptor en naïef fenotype hebben. Voor differentiatie van HBV-specifieke iPSC CD8-positieve T-cellen, plaat s183 T-celreceptor gen-getransduceerde iPSCs op een OP9-DL1/DL4 monolayer in alfa-minimum medium aangevuld met 20%foetaal runderserum en murine Flt3 ligand voor hun co-cultuur in een celcultuur incubator.Monitor de co-cultuur regelmatig om de celmorfologie te beoordelen. Verwijder op dag 28 de supernatant en drijvende cellen en maak de aanhangende cellen los met 0,25% trypsine. Wanneer de cellen zijn opgeheven van de bodem van de kweekcontainer, stop de enzymatische reactie met acht milliliter iPSC-medium en verzamel de cellen door centrifugatie.Resuspend de pellet in 10 milliliter vers medium. Verdun de cellen tot een iPSC-afgeleide CD8-positieve T-cel tot vier s183 peptide-gepulseerde splenocyte ratio voor een 40-uurs incubatie in de celcultuur incubator. Voeg in de afgelopen zeven uur vier microliters van verdunde brefeldin A toe aan de cultuur, om de transportprocessen tijdens celactivering te blokkeren.Bevlek de cellen voor flow cytometrische analyse van de intracellulaire cytokinen van belang volgens standaard protocollen. Voor hydrodynamische HBV plasmide levering via de staartader, verdun 10 microgram HBV plasmid in een 8%-equivalent van de lichaamsmassa van PBS. Laad de plasmid in een spuit van drie milliliter uitgerust met een 26-gauge, 1/2-inch naald per muis.Verwarm HHD-muizen gedurende vijf minuten onder een warmtelamp om de staartaderen te verwijden en trek voorzichtig een muis in een plastic beteugeling. Zoek een verwijde laterale staartader in het middelste derde deel van de staart en steek de naald parallel aan de ader in om het volledige volume plasmide door de staartader te leveren gedurende een periode van drie tot vijf seconden. Voor virale antigeen-specifieke iPSC-afgeleide CD8-positieve T cel adoptieve cel overdracht, het verzamelen van de iPSC CD8-positieve T-cellen op dag 22 van de cultuur zoals aangetoond, en zaad de cellen op een nieuwe 10-centimeter cel kweekschotel.Na 30 minuten in de celcultuur incubator, filter de drijvende cellen door een 70-micrometer nylon zeef, en tel de levensvatbare cellen. Verdun de cellen tot een 1,5 keer 10 tot de zeven cellen per milliliter pbs-concentratie. Injecteer 200 microliter cellen in individuele vier-tot zes weken oude HHD-muizen, in de staartader zoals net aangetoond.Voer op dag 14 na celoverdracht een hydrodynamische HBV plasmidelevering uit zoals aangetoond. Op de juiste experimentele eindpunten na infectie, oogst de lever van elk besmet dier, en snijd de levers in 0,5-bij-0,5-bij-0,3-centimeter weefselmonsters. Plaats de monsters in 10% neutrale buffer formaline voor vier tot 24 uur, gevolgd door ontkalking in 2,5-molaire mierenzuur gedurende zes tot 24 uur.Spoel vervolgens de monsters drie minuten in xyleen, gevolgd door twee spoelingen van twee minuten in 100% ethanol, 95% ethanol en gedeïsized water. Na de laatste waterwassing ontkalken de weefsels in één millimolar EDTA bij 90 graden Celsius, gevolgd door een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur. Wanneer het weefsel is afgekoeld, spoel de monsters in PBS gedurende vier minuten, en gebruik xyleen en ethanol te deparaffinize en rehydrateren van de monsters.Voor immunofluorescente etikettering bevlekt u de secties met 200 microliter HBV-oppervlakteantigeen-specifieke antilichamen gedurende twee uur bij kamertemperatuur in een 75 tot 100%bevochtigde kamer. Aan het einde van de incubatie was je de monsters met vijf vijf minuten wasbeurten in verse PBS voor elke wasbeurt. Label de cellen met DAPI volgens standaardprotocollen voordat u de dia's monteert met coverslips voor beeldvorming door fluorescentiemicroscopie.Voor immunohistochemische analyse, vlek de secties met hematoxylin en eosine volgens standaardprotocollen, en evalueer de infiltratie van ontstekingscellen in de lever door lichte microscopie. Flow cytometrische analyse van de iPSC-afgeleide CD3-positieve CD8-positieve populatie blijkt dat HBV T-cel receptor transductie drastisch verhoogt de generatie van virale s183-specifieke CD8-positieve T-cellen. Na stimulatie met T-uitgeputte splenocyten gepulseerd met s183 peptide, CD4-negatieve CD8 single-positieve iPSC-afgeleide T-cellen produceren grote hoeveelheden interferon gamma, zoals gedetecteerd door intracellulaire stroom cytometrische analyse en ELISA.Na HBV-infectie door hydrodynamische injectie piekt de DNA-replicatie op dag zes en vermindert geleidelijk, zoals waargenomen door real-time PCR-analyse. Verder, virale replicatie is aanzienlijk verminderd op alle tijdstippen in muizen die HBV virale antigeen-specifieke T-cellen ontvangen in vergelijking met muizen die controlecellen ontvangen. HBV oppervlakte-eiwit is ook aanzienlijk verminderd bij muizen die HBV virale antigeen-specifieke pre-iPSC cytotoxische lymfocyten in vergelijking met muizen behandeld met controlecellen ontvangen, duidelijk waaruit blijkt dat virale antigeen-specifieke iPSC CD8-positieve T-cellen hebben de mogelijkheid om HBV replicatie te verminderen in een murine model.Je moet nu een goed begrip van hoe virale antigeen-specifieke T-cellen te genereren uit iPSC voor adoptie-immunotherapie.

stem-cell-derived-viral-ag-specific-t-lymphocytes-suppress-hbv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Hier beschrijven we de eerste Good Manufacturing Practice (GMP)-compatibele werkwijze voor het produceren van virus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) uit navelstrengbloed een bron voornamelijk naïeve T-cellen.

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

The video demonstrates an assay using human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived CD8+ T cells to inhibit hepatitis B virus (HBV) replication in mice. These T cells, engineered with HBV-specific receptors, are transferred into transgenic mice. Replication-competent HBV genome plasmids are then injected directly into the liver, enabling viral DNA uptake. Once viral antigens are expressed and presented by hybrid MHC-I molecules, the engineered T cells recognize and bind to these complexes.

Suppressing Hepatitis B Virus Replication Using Viral Antigen-Specific T Cells

Dit protocol beschrijft de methoden voor het construeren van een gehumaniseerd muismodel voor beenmerg/lever/thymus met stamcelgebaseerde geëngineerde immuniteit tegen HIV-infectie.

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

Hier beschrijven we een protocol om het fenotype van regulatorische T-cellen (Treg) te analyseren die zijn geïsoleerd uit naïeve en chronisch lymphocytaire choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen. Daarnaast bieden we een proces om de onderdrukkende activiteit van de Treg-cellen te evalueren.

Fenotypische en functionele analyse van geactiveerde regulatoire T-cellen Geïsoleerd van Chronische Lymfatische choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde hepatitis B-virus (HBV) reportersysteem de vroege stadia van de levenscyclus HBV controleren. Deze vereenvoudigde in vitro systeem zal helpen bij het screenen van anti-HBV middelen met een high-throughput strategie.

Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor

Dit protocol beschrijft het gebruik van één keten MHC klasse I complexen te onderzoeken van de moleculaire interacties in menselijke CD8 + T cel activatie: generatie van gemanipuleerde antigeen presentatie van cellen uiten van één keten bouwt, cultuur van menselijke CD8 + T cel kloon en T-cel activatie experimenten.

Gebruik van één keten MHC technologie te onderzoeken van Co-agonisme in menselijke CD8 + T cel activatie

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor hepatitis B-virus (HBV) infectie in nieuwe 293T cellen (293T-NE-3NRs, uitdrukken van menselijke NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα) en traditionele levercellen (HepG2-NE, uitdrukken van menselijke NTCP).

Modellering hepatitis B-virusinfectie in niet-leverloze 293T-NE-3NRs-cellen

Op basis van een van hepatitis B-virus (HBV) afgeleide peptidematrix konden HBV-specifieke CD4 T-celresponsen parallel aan de identificatie van HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen worden geëvalueerd.

Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix

We presenteren een protocol om anti-hepatitis B-virus (HBV) verbindingen te screenen gericht op pre- en post-virale entry lifecycle stadia, met behulp van isothermische titratie calorimetrie om bindingsaffiniteit (KD) te meten met gastheer natrium taurocholaat cotransporting polypeptide. Antivirale werkzaamheid werd bepaald door de onderdrukking van virale levenscyclusmarkers (cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage).

Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit

De huidige studie toont protocollen voor het beoordelen van de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen en het manipuleren van genexpressie in deze cellen.

Toegang tot vroege differentiatie van virusspecifieke folliculaire helper CD4+ T-cel in acute LCMV-geïnfecteerde muizen

Leer adoptieve celtherapie met iPSC-afgeleide HBV-specifieke T-lymfocyten om hepatitis B-virusreplicatie effectief te onderdrukken in muizen. Deze methode biedt een veelbelovende basis voor immunotherapie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Meer video's verkennen