Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer methoden voor real-time onderzoek van de Holliday Junction-resolutie door GEN1

Dit protocol stelt ons in staat om de interactiedynamiek en de resolutie van de Holliday-verbinding te monitoren door flap endonuclease 1 op het niveau van één molecuul en andere enzymatische systemen. Nou, sommigen zullen gemiddeld in de hele moleculaire bevolking of beveiligt de onderliggende individuele mechanistische stappen en er is. Single molecule methoden bieden deze details door het toezicht op de real-time gedrag van individuele moleculen.

Single molecule methoden kunnen efficiënt detecteren biomoleculaire interacties in de pico en nanomolar bereik met een hoge specificiteit. Dat is handig voor veel praktische oplossingen in diagnostiek, genoomsequencing en sensing. Optische en gedwongen meten single-molecule methoden worden op grote schaal toegepast in de natuurkunde, chemie en biologie en zijn bewezen dat nobele waarnemingen die ontoegankelijk zijn door andere methoden te bieden.

Mijn advies aan de eerste keer gebruikers is om nauw te volgen de gedetailleerde stappen die in dit protocol. Visuele illustraties van de hands-on procedure van dit protocol zullen leiden tot een succesvolle implementatie van de techniek. Om de single channel flow cell voor te bereiden, begin met het boren van twee gaten met een diameter van 1,22 millimeter in het middelste deel van een kwartsdia van 50 bij 20 millimeter met de centra 37 millimeter uit elkaar en 6,5 millimeter van de rand van de glijbaan.

Gebruik een elektronische frees om een kanaal van 41 bij 2,25 millimeter in een stuk van 50 bij 20 millimeter van een dubbele plakplaat te snijden en de kunststof kant van de beschermhoes af te pellen. Lijn de randen van het stuk uit met de randen van de kwartsschuif en gebruik een paar polytetrafluorethyleen pincet om eventuele gevangen luchtbellen voorzichtig te verwijderen. Pel de papierzijde van het lijmstuk af en monteer het stuk op het gefunctionaliseerde oppervlak van een afdeksel.

Snijd vervolgens een stuk polyethyleenbuizen met een inwendige diameter van 1,22 millimeter tot een lengte van 11 centimeter voor de inlaat en een stuk buizen tot 25 centimeter voor de uitlaat. Steek vervolgens de buizen in de eerder geboorde gaten als de inlaat- en uitlaatbuizen voor de stroomcel. En gebruik vijf minuten epoxylijm om de randen van de kwartsdekslipinterface in de inlaat- en uitlaatbuizen te verzegelen.

Wanneer de cel is gedroogd, gebruik dan een 1 millimeter spuit te spoelen 0,2 micrometer gefilterd 0,03 milligram per milliliter concentratie avidin in PBS in de cel met behulp van een tweede spuit gevuld met buffer alleen uit te wassen eventuele overtollige avidin aan het einde van de overvloed. Om een fret-experiment met één kleur uit te voeren, breng u eerst één druppel onderdompelingsolie aan op een 100 keer totale interne reflectiefluorescentiedoelstelling en stelt u de vermenigvuldiging van foto-elektronezen op een geschikte versterking in om het signaal naar de achtergrond te optimaliseren en verzadiging te voorkomen. Plaats de stroomcel voorzichtig op de monsterhouder en gebruik koersaanpassing om het doel geleidelijk te verhogen totdat de olie de afdeksel raakt.

Schakel de laser van 532 nanometer in en schakel over op de fijne afstelmodus van de doelstelling. Richt de emissie naar de camerapoort om het beeld op de monitor te observeren en pas de hoogte van de doelstelling aan totdat het gefunctionaliseerde oppervlak van de afdeksel in beeld wordt gebracht en kan worden waargenomen op de monitor. Controleer of de achtergrond van het gefunctionaliseerde oppervlak van de afdekslips niet meer dan enkele plekken overschrijdt voordat u in het fluorescerende gelabelde HJ stroomt. Wanneer het systeem klaar is op 0,2 tot 0,5 microliter van het verdunde substraat van belang in 120 microliters van imaging buffer met zuurstof scavenging systeem in een 0,5 milliliter buis en sluit de uitlaat van de langzame cel op een spuitpomp.

Steek de inlaatbuis in de buis van 1,5 milliliter en start de spuitpomp met een 30 tot 50 microliter per minuut om de oplossing uit de buis te halen. Vaak beeld het oppervlak kort met de groene laser om een goede dekking van de cel te bevestigen met 100 tot 300 deeltjes van homogeen verdeeld, goed gesprede substraat. Als het oppervlak van de stroomcel voldoende is afgedekt, spoel dan nog eens 120 microliter beeldbuffers met 30 tot 50 microliters per minuut om ongebonden HJ weg te spoelen en laat de stroomcel 5 minuten zitten zodat het zuurstofverschuifsysteem de opgeloste zuurstof kan uitputten.

Stel de belichtingstijd in op ongeveer 60 milliseconden. De cyclustijd wordt automatisch ingesteld door de software op basis van de snelheid van gegevensoverdracht. Geef het gewenste aantal cycli of frames op tot ongeveer 400.

De emissie van de donor en acceptorfluorofoforen worden opgesplitst in kleurkanalen door een beeldsplitterapparaat. Selecteer een geschikt gebied op het oppervlak, pas de hoogte van het doel aan om de afbeelding scherp te stellen en op te nemen en sla de film op in het tiff-formaat van 16 bits. Ga dan naar een nieuw gebied.

Spoel de cel met 120 microliter imaging buffer aangevuld met de aangegeven concentraties gen1 op een 30 microliter per minuut stroomsnelheid, een concentratie per keer. In de resolutie van het HJ-decolleté-experiment past u de stroomsnelheid aan op 110 microliter per minuut en start u de opname 5 tot 10 seconden voor de ingang van het enzym in de stroomcel. de beeldvorming om te beginnen 5 tot 10 seconden voor de ingang van het enzym in de stroomcel zal het aantal gebeurtenissen te maximaliseren.

Wanneer alle concentraties zijn getest, gebruik dan een vaste fluorescerende kraal dia om de donor en acceptor deeltjes in kaart te brengen aan elkaar in de afbeelding-splitsen apparaat. Na het installeren van het juiste softwarepakket om een transformatiematrix te genereren, opent u de opgenomen kraaldiafilm en selecteert u de posities van de afzonderlijke kralen in de donor- en acceptorkanalen. Wanneer de matrix is gegenereerd uit de vaste pareldia klikt u op TFORM laden en selecteert u het transformatiematrixbestand.

Klik in het vervolgkeuzemenu kanaalfilter op de optie D&A om te selecteren op deeltjes met een label met zowel de donor als de acceptor. Voer vervolgens plotTimetraceCW in zoals geïnstrueerd in de handleiding om de tijdsporen voor elk molecuul te genereren. Om een ALEX FRET-experiment uit te voeren, neemt u een film op die bestaat uit opeenvolgende frames van donor- en acceptor-emissies door directe excitaties met de groene en rode lasers.

Open de verworven ALEX-films en stel de geschikte detectiedrempel in op ongeveer 300 voor elk van de donoremissie als gevolg van donorexcitatie, acceptatie of emissie als gevolg van donorexcitatie en acceptor-emissie als gevolg van de directe excitatiekanalen. Pas de juiste kanaalfilters toe om te selecteren voor de deeltjes die zowel donor als acceptor zijn geweest en koppel 200 tot 300 deeltjes in elk van de drie kanalen. Gebruik de plotHistALEX MATLAB-code om ALEX histogrammen te genereren die verschillende pieken in de functies van het histogram passen en gebruik een geschikt grafiek- en analyseprogramma om het percentage van het gebied onder de curve voor elke populatie te bepalen.

Gebruik vervolgens de plotTimetraceALEX MATLAB-code om een tijdstracering te genereren voor elk molecuul dat de donoremissie laat zien door de directe excitatie in de acceptor-emissies als gevolg van de FRET en de directe opwinding. Deze representatieve afwisselende excitatie FRET histogram van aangrenzend label X-0 toont twee pieken die overeenkomen met het uitwisselen van de meer overvloedige en minder overvloedige isomeren. De isomerisatie tarieven verkregen uit de Dwell tijd histogrammen van de isomeren is in overeenstemming met die eerder gemeld.

Single molecule FRET histogrammen van het aangrenzende label X-0 knooppunt op verschillende GEN1 concentraties verworven door ALEX, onthullen een piek die overeenkomt met de vrije hoge FRET isomer en een piek die overeenkomt met de gebonden HJ-populatie na aftrek van de bijdrage van de minder overvloedige isomer van de lage FRET piek. Bij een verzadigende GEN1-concentratie heeft het FRET-histogram van X-0 slechts één enkele lage FRET-piek die overeenkomt met GEN1, gebonden aan een van beide isomer van de HJ, zoals voorspeld door het model. De binding van GEN1 monomeer aan de HJ gevolgd door dimervorming is een uniek kenmerk van de eukaryotische HJ resolvase GEN1 in vergelijking met prokaryotische resolvasen die in dimeric vorm in oplossing bestaan.

Verder bewijs dat GEN1 monomeer bindt en vervormt de HJ is de observatie van een aanzienlijk aantal sporen van oomverwekte deeltjes met een stabiele lage FRET-toestand in aanwezigheid van magnesium bij lage GEN1-concentraties. Het gelijktijdige vertrek van de donor en acceptor na een stabiele lage FRET-toestand in sporen van opgeloste X-0 die optreedt zonder het ontstaan van een tussenpersoon geeft aan dat een volledige oplossing optreedt binnen de levensduur van het GEN1 HJ-complex. Merk op dat de achtergrond van het gefunctionaliseerde glasoppervlak niet meer dan een paar plekken mag zijn en dat gelijkmatig verdeelde deeltjes essentieel zijn voor het verkrijgen van goede resultaten.

Gebruik altijd persoonlijke beschermingsmiddelen en een rookkap tijdens het voorbereiden van de serialisatiefoto. Zorg ervoor dat u een beschermende bril te dragen die specifiek is voor de golflengten bij het werken met lasers. Andere methoden zoals cryo ap, nucleaire magnetische resonantie, kan atomair niveau structurele details.

Deze informatie is integraal onderdeel van het ontwerp en de interpretatie van de enkelmolecuul FRET experimenten. Single molecule FRET opent nieuwe opvattingen op het gebied van DNA-replicatie wat resulteert in een dieper begrip van de mechanismen van acties helicases en nucleases.