Name: Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 -O-methyl Rnas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Leer een verbeterd protocol voor kleine RNA-bibliotheekvoorbereiding met minder bias en betere detectie van 2'-O-methyl RNA's. Deze methode biedt flexibiliteit met zelfgemaakte of commerciële reagentia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door het National Center for Scientific Research (CNRS), de Franse alternatieve energieën en de Atomic Energy Commission (CEA) en de Paris-Sud Universiteit. Alle bibliotheek voorbereiding, Illumina-sequencing en bio-informatica analyses voor deze studie werden uitgevoerd bij de I2BC Next-generation sequencing (NGS) faciliteit. De leden van de I2BC NGS-faciliteit worden erkend voor het kritisch lezen van het manuscript en nuttige suggesties.

1. isolatie van kleine Rna's
<ol><li>Extract totaal RNA met behulp van fenol reagentia of een andere methode. Controleer of het RNA van goede kwaliteit is.</li>
	<li>Pre-run een 15% TBE-ureum gel (Zie tabel van de materialen) voor 15 min bij 200 V.</li>
	<li>Meng, terwijl de gel voorloopt, 5-20 μg totaal RNA in een 5-15 μL-volume met een gelijk volume formamide-belastingskleurstof (Zie tabel met materialen; 95% gedeïoniseerd formamide, 0,025% broomfenolblauw, 0,025% xyleen cyanol, 5 mm EDTA pH 8) in een PCR-buis van 200 μL. Meng ook 10 μL (200 ng) van de Small-RNA-ladder (Zie tabel met materialen) met een gelijk volume formamide-belastingskleurstof. Incuberen gedurende 5 minuten bij 65 °C in een Thermocycler met een verwarmd deksel en leg de buisjes onmiddellijk op het ijs.</li>
	<li>Laad de ladder en het monster op dezelfde gel met ten minste één rijstrook tussen hen en voer op 200 V totdat de broomfenolblauw (donkerblauw) ongeveer twee derde van de gellengte heeft gemigreerd (ongeveer 40 min).</li>
	<li>Bereid een systeem voor om het RNA van de gel als volgt te elzen: Prik de bodem van een Nuclease-vrije 0,5 mL micro centrifugebuis met een 21-gauge naald. Plaats de geperforeerde 0,5 mL tube in een Nuclease-vrije rond-bodem 2 mL micro centrifugebuis.</li>
	<li>Verwijder de gel en inbroed bij kamertemperatuur met 3 μL nucleïnezuur gelvlek (10.000 x concentraat; Zie tabel van de materialen) in 30 ml water voor 10-15 min.</li>
	<li>Bekijk de gel op een ' Dark Reader'-transilluminator (het wordt sterk aanbevolen om UV te vermijden omdat dit het RNA kan beschadigen) en snijd het RNA van het monster tussen de 17 NT-en de 29 NT-ladder banden. Breng het gelstuk over naar de 0,5 mL buis uit stap 1,5.</li>
	<li>Centrifugeer de buis van 0,5 mL in de 2 mL buis in een micro centrifuge bij maximale snelheid gedurende 2 min. Verwijder de buis van 0,5 mL, die nu leeg moet zijn.</li>
	<li>Voeg 300 μL Nuclease-vrije 0,3 M NaCl toe aan de 2 mL tube met de gemalen gel en draai gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 °C 's nachts (16 uur).</li>
	<li>Breng de suspensie van geplette gelstukken over naar een spin kolom (Zie tabel met materialen) en Centrifugeer gedurende 2 minuten bij maximale snelheid in een micro centrifuge.</li>
	<li>Voeg 1 μL (20 μg/μL) glycogeen (Zie tabel van de materialen) en 950 μL kamertemperatuur 100% ethanol toe. Inincuberen gedurende ten minste 30 min bij-80 °C.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 20 minuten bij maximale snelheid in een micro centrifuge bij 4 °C. Verwijder het supernatant, was de pellet met 800 μL koude 80% ethanol. Centrifugeer nogmaals gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder voorzichtig alle supernatant. Respendeer RNA pellet in 15 μL Nuclease vrij water. Typisch, ~ 5-20 ng van kleine RNA moet worden teruggewonnen, afhankelijk van de hoeveelheid input totaal RNA (~ 1 ng van kleine RNA per 1 μg input totaal RNA).</li>
	<li>
Aanbevolen extra stap: Controleer de hoeveelheid en de kwaliteit van de herstelde sRNA (bijv. door capillaire gel elektroforese met behulp van een kleine RNA-Kit; Zie tabel met materialen).</li>
</ol>2. bereiding van preadenylated 3 ' HD-adapter
Opmerking: Preadenylering van 3 ' HD-adapter werd gedaan op een manier vergelijkbaar met het protocol beschreven door Chen et al18. Merk op dat preadenylated adapter direct kan worden besteld (/5rApp/modificatie), maar dit is vrij duur.
<ol><li>Bestel 5 ' fosforyleerd, 3 ' geblokkeerd 3 ' HD-adapter oligonucleotide. Zie tabel 1 voor volgorde en wijzigingen. Merk op dat ' 3AmMO ' een 3 ' amino modifier groep is, de meeste leveranciers kunnen met deze modificatie oligonucleotide produceren. Verdun in Nuclease vrij water tot 100 μM.</li>
	<li>Stel een reactie van 100 μL in met de volgende reagentia: 10 μl oligo (100 μM), 10 μL T4 RNA ligase buffer (10x), 10 μL ATP (10 mM), 40 μL 50% PEG8000, 5 μL T4 RNA ligase 1 (50 eenheden), 25 μL Nuclease-vrij water. Inincuberen bij 20 °C.</li>
	<li>Voer een klassieke fenol-chloroform extractie uit van het voorgeadenyleerd oligonucleotide gevolgd door ethanol precipitatie. Voeg 100 μL zuur (pH 4,5) fenol toe: chloroform en Vortex. Draai gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, maximale snelheid. Breng 90 μL van de bovenste fase voorzichtig over naar een nieuwe buis; Voeg 10 μL Natriumacetaat van 3 M toe pH 5,2, 1 μL ultrazuiver glycogeen en 250 μL koude 100% ethanol.</li>
	<li>Houd bij-20 °C gedurende ten minste 30 min. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij een maximale snelheid van 4 °C. Verwijder het supernatant, was de pellet één keer met 500 μL koude 80% ethanol. Als alternatief voor fenol-chloroform extractie en ethanol precipitatie kan een nucleotide verwijderings pakket worden gebruikt (zie tabel met materialen). Respendeer in 25 μL water.</li>
	<li>Meet de concentratie van de adapter met behulp van een Kit voor specifieke detectie van enkel-streng DNA (Zie tabel met materialen). Verdun tot 80 ng/μL (10 μM).</li>
	<li>
Aanbevolen extra stap: Controleer de werkzaamheid van preadenylatie door 1 μL 10 μM-adapter te migreren op een 15% TBE-ureum gel (tabel met materialen) samen met onbehandeld oligonucleotide. De preadenylated adapter moet iets langzamer migreren dan onbehandeld oligonucleotide. Indien gewenst, de preadenylated adapter kan gel-gezuiverd; Ga verder zoals hierboven beschreven (stappen 1.2-1.12).</li>
</ol>3. voorbereiding van de bibliotheek-protocol TS5
Opmerking: we presenteren hier het gewijzigde TS-Protocol ' TS5 ' dat we eerder beschreven12 en dat kan worden uitgevoerd met reagentia uit de kit of met zelf geleverde reagentia. Opgemerkt moet worden dat we vergelijkbare of zelfs iets betere resultaten verkregen met een ander protocol, ' TS7 '. Met TS7 is het echter moeilijker om adapter dimers te elimineren. We hebben daarom de voorkeur gegeven aan TS5 in detail te beschrijven, maar TS7 kan worden gevolgd door simpelweg de adapters te vervangen. Gebruik voor TS7 de adapter sequenties ' MidRand-like (MRL) ' (tabel 1). Merk op dat hier de gerandomiseerde gebieden in het midden van de adapters. Primers voor omgekeerde transcriptie en PCR zal hybridiseren aan de sequenties stroomafwaarts van de gerandomiseerde regio in de 3 ' adapter en stroomopwaarts van de gerandomiseerde regio in de 5 ' adapter. Sequentiëren zal beginnen met de eerste gerandomiseerde nucleotide in de 5 ' adapter.
<ol><li>3 ' adapter ligatie.
	<ol>
<li>Combineer 1 μL preadenylated 3 ' HD-adapter (10 μM) met 1 μL gezuiverd klein RNA (~ 0,1-1 μM) in een micro centrifugebuis van 0,2 mL. Inbroed gedurende 2 minuten bij 72 °C in een thermo cycler, en vervolgens direct op het ijs zetten.</li>
		<li>Voeg 4 μL van 50% PEG 8000 (viskeuze oplossing; pipet langzaam), 1 μL RNA ligase buffer (10x), 1 μL H2O, 1 ΜL T4 RNA ligase2 afgekapt, en 1 μl RNase inhibitor. Inincuberen op 16 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Eliminatie van niet-ligated 3 ' adapter
	<ol>
<li>Voeg 10 μL Nuclease vrij water toe en meng goed. Voeg 6 μL 3 M NaOAc pH 5,2 of ' adapter depletie oplossing ' uit de NF-Kit (inhoudstafel) toe en meng goed. Voeg 40 μL magnetische zuiverings kralen (tabel met materialen) en 60 μL isopropanol toe en meng goed. Incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Plaats het monster in een magnetisch rek totdat de oplossing duidelijk blijkt. Verwijder het supernatant en gooi het weg.</li>
		<li>Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe. Inincuberen voor ~ 30 s, dan verwijderen. Wees voorzichtig met het gebruik van vers bereide 80% ethanol en inbroed niet met 80% ethanol gedurende langere periodes.</li>
		<li>Draai de buis kort en verwijder de restvloeistof die mogelijk op de bodem van de put is verzameld. Laat de kralen 2 minuten drogen en breng vervolgens in 22 μL van 10 mm tris pH 8 of resuspensie buffer van de NF-Kit aan. Inincuberen gedurende 2 minuten, dan magnetiseren van het monster totdat de oplossing duidelijk blijkt.</li>
		<li>Voeg 6 μL van 3 M NaOAc pH 5,2 of ' adapter depletie oplossing ' uit de NF-Kit (tafel van de materialen) toe aan een nieuwe buis. Breng 20 μL van het supernatant van de vorige stap naar deze nieuwe buis en meng door Pipetting. Voeg 40 μL magnetische kralen en 60 μL 100% isopropanol toe en meng goed door pipetten. Inincuberen gedurende 5 min.</li>
		<li>Magnetiseer het monster totdat de oplossing duidelijk blijkt, verwijder dan het supernatant en gooi het weg.</li>
		<li>Voeg 180 μL vers bereide 80% ethanol toe. Inincuberen voor ~ 30 s, dan verwijderen. Take zorg voor het gebruik van vers bereide 80% ethanol en niet inbroed voor met 80% ethanol voor langere periodes.</li>
		<li>Draai de buis kort en verwijder de restvloeistof die mogelijk op de bodem van de put is verzameld. Laat de kralen 2 minuten drogen en breng in 10 μL Nuclease vrij water door. Inincuberen gedurende 2 minuten, dan magnetiseren van het monster totdat de oplossing duidelijk blijkt.</li>
		<li>Breng 9 μL supernatant over naar een nieuwe buis. Voeg 1 μL T4 RNA ligase buffer (10x) en 1 μL water toe. U ook 2 μL ligase-buffer uit de TS-Kit toevoegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligatie van 5 ' adapter.
	<ol>
<li>Voeg 1 μL 5 ' HD-adapter (10 μM; Tabel 1) tot een PCR-buis van 200 μL in een thermo cycler met verwarmd deksel. Inbroed gedurende 2 minuten bij 70 °C en zet de buis vervolgens direct op ijs.</li>
		<li>Voeg 1 μL 10 mM ATP en 1 μL T4 RNA ligase 1 toe. Meng goed door het zachtjes pipetteren. Voeg 3 μL van deze mix toe aan het 3 ' geligeerd RNA van stap 3.2.9 en meng door pipetten. Incuberen gedurende 1 uur bij 28 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Omgekeerde transcriptie (RT)
	<ol>
<li>Breng 6 μL 3 "en 5"-adapter met geligeerd RNA over in een nieuwe PCR-buis van 200 μl (Houd de resterende ~ 8 μl bij-80 °c voor later gebruik indien nodig). Voeg 1 μL RT primer (10 μM; Tabel 1) en meng door pipetten. Inbroed gedurende 2 minuten bij 70 °C en zet de buis vervolgens direct op ijs.</li>
		<li>Voeg de volgende reagentia toe voor RT: 2 μL van 5x eerste streng buffer, 0,5 μL van 12,5 mM dNTP-mix, 1 μL van 100 mM DTT, 1 μL RNase-remmer en 1 μL reverse-transcriptase (tabel van materialen). Incuberen gedurende 1 uur bij 50 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR-versterking
	<ol>
<li>Voeg de volgende reagentia toe aan de 12,5 μL RT-reactiemengsel: 10 μL PCR-polymerase buffer, 2 μL universele P5 primer (10 μM; Tabel 1), 2 μL P7-Index Primer (10 μM; Tabel 1), 1 μl van 12,5 mm Dntp's, 0,5 ΜL van DNA-polymerase (tabel van materialen) en 22 μl water. Houd de reactie op ijs tot gebruik.</li>
		<li>Voer het volgende PCR-programma uit: 98 °C gedurende 30 sec., 11 cycli (98 °C voor 10 sec., 60 °C gedurende 30 sec. en 72 °C gedurende 15 sec.) en 72 °C gedurende 10 min. Houd de reactie bij 4 °C wanneer u klaar bent. Opmerking: wat betreft het aantal PCR-cycli: meestal voeren we 11 cycli uit, maar dit moet worden geoptimaliseerd door de gebruiker. Probeer het kleinst mogelijke aantal PCR-cycli uit te voeren.</li>
	</ol></li>
	<li>Gel zuivering
	<ol>
<li>Voer 5, 10 en 20 μL PCR-product uit op een native gel van 6% TBE (Zie tabel met materialen) samen met een geschikte ladder (Zie tabel met materialen). Voer de gel ongeveer 1 uur uit bij 145 V (totdat de broomfenolblauw de bodem bereikt; deze kleurstof migreert op de positie 65 BP).</li>
		<li>Verwijder de gel en inincuberen met nucleïnezuur gel Stain (Zie tabel van de materialen) in water voor 10-15 min.</li>
		<li>Bekijk de gel op een "Dark Reader" transilluminator (het wordt sterk aanbevolen om UV te vermijden omdat dit het RNA kan beschadigen) en knip de bibliotheek band af op 150 BP. bereid een systeem voor om het RNA van gel te elzen zoals beschreven in stap 1,5 en breng het gelstuk over naar de 0,5 mL Tube.</li>
		<li>Centrifugeer in een micro centrifuge bij maximale snelheid gedurende 2 min. Verwijder de buis van 0,5 mL, die nu leeg moet zijn.</li>
		<li>Voeg 300 μL Nuclease vrij water toe aan de 2 mL tube met de gemalen gel en draai gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 °C 's nachts.</li>
		<li>Breng de suspensie van geplette gelstukjes in water over naar een spin kolom en Centrifugeer gedurende 2 minuten bij maximale snelheid.</li>
		<li>Voeg 1 μL (20 μg/μL) glycogeen, 30 μL 3 M NaOAc en 975 μL ijskoud 100% ethanol toe. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij maximale snelheid bij 4 °C.</li>
		<li>Respendeer de pellet in 20 μL van 10 mM tris pH8. Gebruik 1 μL voor concentratiemeting en 1 μL voor kwaliteitscontrole.</li>
	</ol></li>
</ol>4. gegevensanalyse
Opmerking: de hieronder beschreven procedure voor gegevensanalyse is gebaseerd op het Linux-besturingssysteem Ubuntu 16,04 LTS.
<ol><li>Behandeling van RAW sequence-bestanden
	<ol>
<li>Download de FASTQ sequentie bestand (en) gegenereerd tijdens de sequentiëren run. Voer indien nodig demultiplexing uit met bcl2fastq2 (versie V 2.2.18.12; een handleiding kan worden gedownload via de volgende link: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html). Gebruik de volgende opdracht: nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq--runfolder-dir Pathway_of_Run --negeren-ontbrekende-BCL--output-dir Pathway_of_Output_Directory --barcode-mismatches 1--geaggregeerd-tegels automatisch-r 16-d 16-p 16-w 16
</li>
		<li>Verwijder adapter sequenties met behulp van Cutadapt19 versie 1,15. Een handleiding kan hier worden gedownload: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html. Gebruik de volgende opdracht: Pathway_to_cutadapt/ cutadapt-een TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-n 5-O 4-m 10-j 0--nextseq-trim 10-O Output_File_Read1_cutadapt. Fastq. gz Input_File_Read1. fastq. gz Merk op dat de sequentie in de opdracht overeenkomt met de 3 ' HD-adapter zonder de 4 willekeurige nucleotiden; Deze zullen dus niet worden verwijderd tijdens deze stap.</li>
		<li>Gebruik seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) voor het verwijderen van de terminale willekeurige nucleotiden in de sequentiëren leesbewerkingen. Gebruik de volgende opdracht (variabele namen in vet): seqtk trimfq-b 4-e 4 Output_File_Read1_cutadapt . fastq > Output_File_Read1 _bijgesneden . fastq
</li>
		<li>Gebruik de volgende awk-opdracht om de sequenties van minder dan 10 NT te verwijderen: awk ' begin {FS = "\t"; OFS = "\n"} {header = $0; getline SEQ; getline qheader; getline qseq; if (length (SEQ) > = 10) {Print header, seq, qheader, qseq}} ' Output_File_Read1_bijgesneden. fastq > Length_Filtered. fastq
</li>
	</ol></li>
	<li>Toewijzing van de bijgesneden sequenties
	<ol>
<li>Download de database die overeenkomt met het organisme van de studie van miRBase als volgt. Ga naar http://www.mirbase.org/ftp.shtml en Download het bestand ' Mature. fa '. Merk op dat de sequenties worden aangegeven in RNA notatie. Vervang de U-residuen door T met de volgende opdracht: sed-i '/^ >/! s/U/T/g ' volwassen. FA Opmerking: dit zal een volledige lijst opleveren van alle Mirna's in miRBase, afkomstig van verschillende organismen.</li>
		<li>Selecteer de miRNA-sequenties van uw organisme met de volgende opdracht: awk 'name_of_the_organism{print; NR [nr + 1]; volgende}; NR in nr ' volwassen. FA > mature_name_of_the_organism_MIRS. FA
</li>
		<li>De leesbewerkingen toewijzen aan de hierboven gemaakte bestand met behulp van Bowtie220 (versie 2.3.0) waardoor er geen mismatches. Maak eerst een index voor uw bestand met de volgende opdracht: bowtie2-build mature_name_of_the_organism_Dapengbaai. FA mature_name_of_the_organism_Dapengbaai
</li>
		<li>De sequentiëren leesbewerkingen uitlijnen op de database, vereisen dat een lezen wordt volledig toegewezen aan een miRNA van de database, zonder enige mismatches. Gebruik hiervoor het volgende hulpprogramma: bowtie2-N 0-L 10--Score-min C, 0, 0--end-to-end-x mature_name_of_the_organism_Dapengbaai-U Length_Filtered. fastq-S Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam Opmerking: de optie:--Score-min C, 0, 0 zorgt ervoor dat de uitlijning zonder enige mismatches is. Voor een uitleg van de verschillende parameters in de tool, u terecht op de volgende website: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml</li>
		<li>Als u de leesbewerkingen wilt negeren die niet zijn uitgelijnd, gebruikt u de volgende opdracht: samtools View-F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT. Sam > Reads_aligned_to_Mirs. Sam Opmerking: als gevolg van deze stappen moet u nu de uitgelijnde leesbewerkingen hebben verkregen, overeenkomend met miRNAs.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing%3A+implications+of+enzymatic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358(2012).</li>
<li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li>
<li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li>
<li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Silence%22%5BJournal%5D)">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4(2012).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141(2011).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3%27-adapter+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54(2012).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049(2015).</li>
<li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118(2018).</li>
<li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969(2011).</li>
<li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stimulated+ligation%3A+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li>
<li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619(2014).</li>
<li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109(2013).</li>
<li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105(2018).</li>
<li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41(2012).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kleine RNA-bibliotheek voorbereiding blijft uitdagend vanwege bias, voornamelijk geïntroduceerd tijdens de ligatie stappen van de adapter. Rna's met een 2 '-OMe modificatie op hun 3 ' einde zoals plant miRNAs, piRNA in insecten, nematoden en zoogdieren, en kleine interfererende Rna's (siRNA) in insecten en planten zijn bijzonder moeilijk te bestuderen omdat de 2 '-OMe modificatie remt 3 ' adapter ligatie. In de literatuur zijn een aantal oplossingen voorgesteld om de protocollen voor het opstellen van sRNA Library te ver...

Kleine Rna's (Srna's) zijn betrokken bij de beheersing van een diversiteit aan biologische processen1. De eukaryotische regelgevende Srna's zijn meestal tussen de 20 en 30 NT groot; de drie belangrijkste types zijn microRNAs (miRNA), piwi-interageren Rna's (piRNA) en kleine storende Rna's (siRNA). Afwijkende miRNA-uitdrukkings niveaus zijn betrokken bij een verscheidenheid aan ziekten2. Dit onderstreept het belang van miRNAs in gezondheid en ziekte en de eis voor nauwkeurige, kwantitatieve onderzoeksinstrumenten om Srna's in het algemeen te detecteren.
Next-generation sequencing (NGS) is een veelgebruikte methode om Srna's te bestuderen. De belangrijkste voordelen van NGS in vergelijking met andere benaderingen, zoals kwantitatieve PCR-of Microarray technieken (qPCR), zijn dat het geen a priori kennis van de sRNA-sequenties nodig heeft en daarom kan worden gebruikt om nieuwe Rna's te ontdekken, en bovendien lijdt het minder achtergrond signaal en verzadiging effecten. Verder kan het enkele nucleotide-verschillen detecteren en heeft het een hogere doorvoer dan micro arrays. Echter, NGS heeft ook een aantal nadelen; de kosten van een reeks sequentiëren blijven relatief hoog en het proces voor meerdere stappen dat nodig is om een steekproef in een bibliotheek voor sequentiëren te converteren, kan biases introduceren. In een typisch sRNA Library voorbereidingsproces, een 3 ' adapter wordt eerst geligeerd aan de sRNA (vaak gel-gezuiverd van totaal RNA) met behulp van een afgeknotte versie van RNA ligase 2 (RNL2) en een voorgeadenyleerd 3 ' adapter (Figuur 1) bij afwezigheid van ATP. Dit verhoogt de efficiëntie van sRNA-adapter ligatie en vermindert de vorming van nevenreacties zoals sRNA circularisatie of concatemerization. Vervolgens wordt een 5 '-adapter geligeerd door RNA ligase 1 (RNL1), gevolgd door omgekeerde transcriptie (RT) en PCR-versterking. Al deze stappen kunnen vooroordelen3,4introduceren. Daarom lezen getallen mogelijk niet werkelijke sRNA expressieniveaus leidt tot kunstmatige, methode afhankelijke expressie patronen. Specifieke Srna's kunnen ofwel over-of ondervertegenwoordigd zijn in een bibliotheek, en sterk ondervertegenwoordigd Srna's kunnen ontsnappen aan detectie. De situatie is bijzonder gecompliceerd met plantaardige Mirna's, Sirna's in insecten en planten, en Pirna's in insecten, nematoden en zoogdieren, waarbij de 3 ' terminale nucleotide een 2 '-O-methyl (2 '-OMe) modificatie1heeft. Deze modificatie remt sterk 3 ' adapter ligatie5, waardoor bibliotheek voorbereiding voor dit soort RNA een moeilijke taak.
Vorige werk toonde aan dat de ligatie van de adapter ernstige bias introduceert, als gevolg van RNA-sequentie/structuur-effecten6,7,8,9,10,11. Stappen stroomafwaarts van de ligatie van de adapter, zoals omgekeerde transcriptie en PCR, dragen niet significant bij aan bias6,11,12. Ligatie bias is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat adapter moleculen met een bepaalde sequentie zullen interageren met sRNA moleculen in het reactiemengsel om co-plooien te vormen, die ofwel kunnen leiden tot gunstige of ongunstige configuraties voor ligatie (Figuur 2). Gegevens van Sorefan et al7 SUGGEREREN dat RNL1 de voorkeur geeft aan een enkele gestrande context, terwijl RNL2 een dubbele streng prefereert voor ligatie. Het feit dat de adapter/sRNA co-fold structuren worden bepaald door de specifieke adapter en sRNA sequenties verklaart waarom specifieke sRNA zijn over-of ondervertegenwoordigd met een bepaalde Adapterset. Het is ook belangrijk op te merken dat binnen een reeks sRNA-bibliotheken die moeten worden vergeleken, dezelfde adapter sequenties moeten worden gebruikt. Sterker nog, het is eerder waargenomen dat het veranderen van adapters door de invoering van verschillende barcode sequenties verandert Mirna profielen in sequencing bibliotheken9,13.
Randomisatie van adapter sequenties in de buurt van het ligatie knooppunt vermindert waarschijnlijk deze biases. Sorefan en collega's7 gebruikte adapters met 4 willekeurige nucleotiden aan hun extremiteiten, aangewezen "High Definition" (HD) adapters, en toonde aan dat het gebruik van deze adapters leiden tot bibliotheken die beter weerspiegelen echte Srna expressieniveaus. Meer recent werk bevestigde deze waarnemingen en bleek dat de gerandomiseerde regio niet hoeft te worden grenzend aan de ligatie junctie11. Dit nieuwe type adapters kreeg de naam "MidRand" adapters. Samen tonen deze resultaten aan dat een verbeterd adapter ontwerp de bias kan verminderen.
In plaats van de adapters te wijzigen, kan bias worden onderdrukt door het optimaliseren van reactieomstandigheden. Polyethyleenglycol (PEG), een macromoleculaire verdringings middel waarvan bekend is dat het de ligatie-efficiëntie14verhoogt, is aangetoond dat het de bias15,16significant vermindert. Op basis van deze resultaten verschenen er verschillende "low bias" kits op de markt. Deze omvatten kits die gebruik maken van PEG in de ligatie reacties, hetzij in combinatie met klassieke adapters of HD-adapters. Andere kits Vermijd ligatie helemaal, en gebruik 3 ' polyadenylering en sjabloon switching voor 3 ' en 5 ' adapter optellen, respectievelijk12. In nog een andere strategie, 3 ' adapter ligatie wordt gevolgd door een circularisatie stap, dus weglaten 5 ' adapter ligatie17.
In een eerdere studie zochten we naar een sRNA Library Preparation protocol met de laagst mogelijke niveaus van bias en de beste detectie van 2 '-OMe RNAs12. We testten enkele van de bovengenoemde ' low bias ' kits, die een betere detectie hadden van 2 '-OMe Rna's dan het standaardprotocol (TS). Verrassend echter, bij modificatie (het gebruik van gerandomiseerde adapters, PEG in de ligatie reacties en verwijdering van overtollige 3 ' adapter door zuivering) de laatste presteerde beter dan de andere protocollen voor de detectie van 2 '-OMe Rna's. Hier beschrijven we in detail een protocol op basis van het TS-protocol, ' TS5 ', dat de beste algemene detectie van 2 '-OMe Rna's had. Het protocol kan worden gevolgd met behulp van reagentia uit de TS-Kit en één reagens uit de ' NF ' Kit of, om geld te besparen, met behulp van zelfgemaakte reagentia, met gelijke prestaties. We bieden ook een gedetailleerd protocol voor de zuivering van sRNA van totaal RNA en de bereiding van preadenylated 3 '-adapter.

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (met IAA, 125:24:1)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5'-Trifosfaat (ATP)</td><td>Nex England Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP kralen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer Small RNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1548</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X centrifugebuisfilters</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8162-96EA</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader transilluminator</td><td>diverse leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotStart PCR Kit, met dNTP's</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex small RNA-seq V3 kit</td><td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-5132-05</td><td>optioneel</td></tr><tr><td>Novex TBE gels 6%</td><td>ThermoFisher</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex TBE Urea gels 15%</td><td>ThermoFisher</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Quantitation Starter Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33227</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q10212</td><td></td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Dye (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor, Muur&nbsp;</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td><td>ThermoFisher</td><td>18090200</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2, ingekort</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0242S</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 50 bp DNA ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>10488043</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012/24/36/48</td><td>optioneel</td></tr><tr><td>UltraPure Glycogen</td><td>ThermoFisher</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>ZR small RNA ladder</td><td>Zymo Research</td><td>R1090</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">de laatste twee getallen komen overeen met de set indexen</td></tr></tbody></table>

verbetering van kleine rna-seq: minder bias en betere detectie van 2 '-o-methyl rna's

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

De studie van kleine Rna's (Srna's) door Next-generation sequencing (NGS) wordt uitgedaagd door bias issues tijdens de voorbereiding van de bibliotheek. Verschillende types sRNA zoals plant microRNAs (miRNAs) dragen een 2 '-O-methyl (2 '-OMe) modificatie op hun 3 ' terminale nucleotide. Deze wijziging voegt een andere moeilijkheid toe omdat het 3 ' adapterligatie remt. We hebben eerder aangetoond dat gewijzigde versies van het Protocol ' TruSeq (TS) ' minder bias en een verbeterde detectie van 2 '-OMe Rna's hebben. Hier beschrijven we in detail Protocol ' TS5 ', die de beste algehele prestaties toonde. TS5 kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia of reagentia uit de TS-Kit, met gelijke prestaties.

Kritische stappen zijn de isolatie van de kleine RNA-Fractie van het start totaal RNA-materiaal (Figuur 3) en het gewenste uiteindelijke bibliotheek product (Figuur 4). Beide stappen betreffen de zuivering van polyacrylamidegel; klein RNA is geïsoleerd van 15% TBE ureum gels, terwijl de uiteindelijke bibliotheken geïsoleerd zijn van 6% inheemse TBE gels. Klein RNA geïsoleerd van gel kan worden geanalyseerd op een kleine RNA capillaire elektroforese chip (<strong...

We presenteren een gedetailleerd klein RNA Library Reparatie protocol met minder bias dan standaardmethodes en een verhoogde gevoeligheid voor 2 '-O-methyl rna's. Dit protocol kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia om kosten te besparen of kits te gebruiken voor het gemak.

Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Klein RNA reguleert veel biologische processen. Het is daarom belangrijk om gevoelige en onbevooroordeelde methoden te ontwikkelen om ze te detecteren. Ons protocol protocol biedt stappen voorwaarts in de richting van dit doel.Ons protocol lijdt aan minder bias kwesties, dan klassieke kleine RNA bibliotheek krediet methoden, en belangrijker nog het maakt een meer gevoelige detecties van twee prong of meso-RNAs. Zoals plantaardige micro-RNAs. Na het extraheren van het totale RNA volgens standaardprotocollen.Pre run een 15%TBE urea gel gedurende vijftien minuten op 200 volt. En meng vijf tot twintig microgram van het totale RNA, in een vijf tot vijftien microliter volume, met een gelijk volume van formamide laden kleurstof in een 200 microliter buis. Na vijf minuten bij 65 graden Celsius, in een thermocycler met een verwarmd deksel, onmiddellijk plaats de buizen op ijs en laad de laatste en monster op de gel met ten minste een rijstrook tussen hen.Voer vervolgens de gel op 200 volt totdat de bromofol ongeveer twee derde van de lengte van de gel heeft gemigreerd. Om het RNA te laden, eerst doorboren de onderkant van een nuclease gratis 0,5 milliliter micro centrifuge buis, met een 21 meter naald, en plaats de doorboorde buis in een nuclease vrije ronde onderste twee milliliter micro centrifuge buis. Vervolgens, incubeer de gel op kamertemperatuur met nucleïnezuur gel vlek in water gedurende tien tot vijftien minuten, alvorens de gel op een transilluminator.Knip het monster RNA tussen 17 en 29 nucleotide ladderbanden, en breng de gel stuk in de doorboorde buis. Spin de gel in een microcentrifuge op maximale snelheid gedurende twee minuten, en verwijder de 0,5 milliliter buis die nu leeg zou moeten zijn. Voeg 300 microliter nucleasevrij 0,3 kiezen natriumchloride toe aan de geplette gel en plaats de buis minstens twee uur op een rotator bij kamertemperatuur.Breng aan het einde van de incubatie de gemalen gelstukken over in een spinkolom en centrifuge gedurende twee minuten bij maximale snelheid in de microcentrifuge. Voor ongegeregeerde drie prime adapter eliminatie, grondig meng tien microliters nuclease vrij water met de geëxtraheerde RNA monster, en voeg zes microliter van drie kiezen natriumacetaat met mengen. Voeg 40 microliter magnetische zuiveringskralen en 60 microliter isopropanol toe aan het monster met grondig mengen.En de vering vijf minuten bij kamertemperatuur uitbroeden. Plaats het monster aan het einde van de incubatie op een magnetisch rek, totdat de oplossing duidelijk wordt. Verwijder de heldere supernatant, en voeg 180 microliter vers bereide 80%-ethanol toe aan de kralen.Na 30 seconden, verwijder de ethanol en kort draai de buis. Verwijder de restvloeistof die aan de onderkant van de buis kan zijn verzameld en laat de kralen twee minuten drogen voordat het monster opnieuw wordt opgehangen in 22 microliter van 10 millimolar Tris. Na twee minuten magnetiseren van het monster totdat de oplossing duidelijk lijkt.Meng vervolgens 20 microliter heldere supernatant met zes microliter van drie molaire natriumacetaat in een nieuwe buis en voeg 40 microliter magnetische kralen en 60 microliter van 100% isopropanol toe. Na vijf minuten bij kamertemperatuur magnetiseert u het monster totdat de oplossing duidelijk lijkt, voordat u de supernatant verwijdert. Behandel het monster met 180 microliter vers bereide 80%-ethanol gedurende 30 seconden voordat u de ethanol verwijdert die door het monster draait en verwijder alle restvloeistof die zich aan de onderkant van de buis heeft opgehoopt.Nadat de kralen twee minuten hebben laten drogen, moet u ze gedurende twee minuten opnieuw ophangen in 10 microliters nucleasevrij water, voordat het monster wordt gemagnetiseerd totdat de oplossing duidelijk wordt. Breng vervolgens negen microliter supernatant over naar een nieuwe buis en voeg een microliter T4 RNA-ligasebuffer en één micrcoliter van water toe aan het monster. Voor gelzuivering, draaien vijf, tien en twintig microliters van PCR product op een native 6%TBE gel voor ongeveer een uur.Incubeer de voltooide gel met nucleïnezuurgelvlek in water gedurende tien tot vijftien minuten en bekijk de gel op een transilluminator om extractie van de 150 base pair bibliotheekband mogelijk te maken. Omdat het moeilijk is om de 150 base pair band die hen vertegenwoordigt te isoleren, zijn dit onze bibliotheek, vanwege de aanwezigheid van nauw migrerende zijproducten moet u de gel zeer zorgvuldig snijden. Isoleer dan het RNA zoals net aangetoond.Voor wijziging van raw-sequentiebestanden download je de fastq-sequentiebestanden die tijdens de sequencing-run zijn gegenereerd en preformeren demultiplexing met bcl2fastq2 indien nodig. Verwijder adaptersequenties met cutodapt en gebruik de opdracht zoals aangetoond. Gebruik seqtk zoals aangegeven om de terminal willekeurige nucleotiden in de sequenties leest te verwijderen.Gebruik vervolgens de opdracht awk zoals aangegeven, om de sequenties korter dan 10 nucleotiden te verwijderen. Als u de bijgesneden sequenties in kaart wilt brengen, opent u miRBase en downloadt u het volwassen fa-bestand. Gebruik de opdracht zoals aangegeven om U-residuen te vervangen door T-residuen, om een volledige lijst op te leveren van alle micro-RNAs in de database, afkomstig van een verscheidenheid aan organismen.Selecteer de micro-RNA-sequenties van het organisme van belang, met de opdracht zoals aangegeven, en breng de leest in kaart met het bestand met behulp van bowtie2, waardoor er geen mismatches mogelijk zijn. Gebruik het gereedschap om de reeksen leest uit te lijnen op de database, die vereist dat een lezen volledig kaarten naar een micro-RNA van de database, met uit eventuele mismatches zoals aangegeven. Gebruik vervolgens de opdracht om de reads die niet zijn uitgelijnd, te verwijderen.Na het laden van steeds grotere hoeveelheden van een PCR versterkte bibliotheek op een gel zoals aangetoond, kunnen de producten die overeenkomen met de verwachte grootte worden geëxtraheerd. Na elutie kan de gezuiverde bibliotheek worden gecontroleerd op een capillaire gel elektroforese chip. Naast de verwachte 150 base pair product, en een toenemend deel van een 130 base pair soorten die overeenkomen met adapter dimers, worden meestal waargenomen als toenemende hoeveelheid PCR-product worden geladen.Vergelijkbare resultaten worden verkregen wanneer bibliotheken uit een mix van synthetische kleine RNAs worden bereid met behulp van reagentia uit kits, of andere benodigdheden. Ter vergelijking, eerder gepubliceerde resultaten voor dezelfde kleine RNA mix worden weergegeven. Hier wordt een vergelijking weergegeven voor de prestaties van protocol TS5 met het standaard TS-protocol voor de detectie van menselijke ongewijzigde en twee eerste O-methal gemodificeerde plantmicro RNAs.De detectie van twee prime O-methal gemodificeerde piRNAs in menselijke monsters werd ook getest. Zoals waargenomen TS5 voorgevormd aanzienlijk beter dan TS voor de detectie van twee prime O-methal RNAs, maar niet voor ongewijzigde RNAs. Voorbereiden repliceren bibliotheken voor elk voorbeeld op verschillende datums.Meestal is er weinig variatie tussen replica's gelijktijdig gemaakt, of er kan aanzienlijke variatie tussen bibliotheken bereid op verschillende data.

improving-small-rna-seq-less-bias-better-detection-2-o-methyl

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Het doel van deze publicatie is om te visualiseren en te discussiëren over de operatieve stappen van een Enhanced Northern Blot protocol op RNA geëxtraheerd uit Drosophila melanogaster embryo's, cellen en weefsels. Dit protocol is bijzonder bruikbaar voor de efficiënte detectie van kleine RNA species.

Verbeterde Northern Blot detectie van kleine RNA Species in Drosophila melanogaster

MicroRNA's (miRNA's) zijn een wijdverspreid geconserveerde klasse van regulerende moleculen. Hier beschrijven we een miRNA-kloonmethode die afhankelijk is van twee krachtige ligatiefasen gevolgd door high-throughput sequencing. Onze methode maakt nauwkeurige genoom-wide kwantificering van miRNA's mogelijk.

Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

We beschrijven een op getarget RNA-sequencing gebaseerde methode die de voorbereiding van geïndiceerde cDNA-bibliotheken, hybridisatie en captuur met aangepaste sondes en data-analyse om geselecteerde transcripten te onderzoeken op genexpressie, mutaties en genfusies omvat. Getarget RNAseq maakt een kosteneffectieve, snelle evaluatie van geselecteerde transcripten mogelijk op een desktop sequencer.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

Volgende-generatie rangschikken (NGS) is een krachtig hulpmiddel voor genomische karakterisering die wordt beperkt door het hoge foutenpercentage van het platform (~0.5–2.0%). Wij beschrijven onze methoden van fout-gecorrigeerde sequentie die ons toelaten te ondervangen van het NGS foutenpercentage en mutaties op variant allel breuken zo zeldzaam als 0,0001 detecteren.

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Dit protocol biedt onderzoekers met een nieuw instrument voor het controleren van de betrouwbaarheid van transcriptie in meerdere modelorganismen.

Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

Hier presenteren we een protocol voor DNAzyme-afhankelijke splijting van RNA. Dit maakt een snelle en site-afhankelijke analyse van RNA 2 '-O-Methylation mogelijk. Deze aanpak kan worden gebruikt voor de voorlopige of belangrijke beoordeling van de activiteit van snoRNA.

DNAzyme-afhankelijke analyse van rRNA 2 '-O-methylatie

Hier beschrijven we een stapsgewijze strategie voor het isoleren van kleine Rna's, verrijkend voor Microrna's en het voorbereiden van samples voor sequentiëren met hoge doorvoer. Vervolgens beschrijven we hoe u de volgorde leest en lijnt u deze uit op microRNAs met behulp van open source tools.

Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een LC-MS-gebaseerde sequencingmethode die kan worden gebruikt als een directe methode om kort RNA (&lt;35 nt per run) te sequencen zonder een cDNA-tussenproduct, en als een algemene methode om verschillende nucleotidemodificaties te sequencen in een enkele studie met precisie op één base.

2D-HELS MS Seq: Een algemene LC-MS-gebaseerde methode voor directe en de novo sequencing van RNA-mengsels met verschillende nucleotidemodificaties

Snelle detectie en betrouwbare kwantificering van RNA-bewerkingsgebeurtenissen op genomische schaal blijven een uitdaging en vertrouwen momenteel op directe RNA-sequencingmethoden. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van microtemperature gradient gel elektroforese (μTGGE) als een eenvoudige, snelle en draagbare methode om RNA-bewerking te detecteren.

Een nonsequencing-benadering voor de snelle detectie van RNA-bewerking

Absolute kwantificering RNA-sequencing (AQRNA-seq) is een technologie die is ontwikkeld om het landschap van alle kleine RNA's in biologische mengsels te kwantificeren. Hier worden zowel de bibliotheekvoorbereidings- als de gegevensverwerkingsstappen van AQRNA-seq gedemonstreerd, waarbij veranderingen in de transfer-RNA (tRNA)-pool in Mycobacterium bovis BCG worden gekwantificeerd tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode.

AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNA's

Dit protocol maakt een eerste kwaliteitscontrole mogelijk voor RNA-seq-experimenten voor wet-lab biologen met beperkte bio-informatica-ervaring.

Rup (RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - Kwaliteitscontrole voor bulk RNA-seq-experimenten in eukaryoten

Leer een verbeterd protocol voor kleine RNA-bibliotheekvoorbereiding met minder bias en betere detectie van 2'-O-methyl RNA's. Deze methode biedt flexibiliteit met zelfgemaakte of commerciële reagentia.

Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

Meer video's verkennen