Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

Klein RNA reguleert veel biologische processen. Het is daarom belangrijk om gevoelige en onbevooroordeelde methoden te ontwikkelen om ze te detecteren. Ons protocol protocol biedt stappen voorwaarts in de richting van dit doel.

Ons protocol lijdt aan minder bias kwesties, dan klassieke kleine RNA bibliotheek krediet methoden, en belangrijker nog het maakt een meer gevoelige detecties van twee prong of meso-RNAs. Zoals plantaardige micro-RNAs. Na het extraheren van het totale RNA volgens standaardprotocollen.

Pre run een 15%TBE urea gel gedurende vijftien minuten op 200 volt. En meng vijf tot twintig microgram van het totale RNA, in een vijf tot vijftien microliter volume, met een gelijk volume van formamide laden kleurstof in een 200 microliter buis. Na vijf minuten bij 65 graden Celsius, in een thermocycler met een verwarmd deksel, onmiddellijk plaats de buizen op ijs en laad de laatste en monster op de gel met ten minste een rijstrook tussen hen.

Voer vervolgens de gel op 200 volt totdat de bromofol ongeveer twee derde van de lengte van de gel heeft gemigreerd. Om het RNA te laden, eerst doorboren de onderkant van een nuclease gratis 0,5 milliliter micro centrifuge buis, met een 21 meter naald, en plaats de doorboorde buis in een nuclease vrije ronde onderste twee milliliter micro centrifuge buis. Vervolgens, incubeer de gel op kamertemperatuur met nucleïnezuur gel vlek in water gedurende tien tot vijftien minuten, alvorens de gel op een transilluminator.

Knip het monster RNA tussen 17 en 29 nucleotide ladderbanden, en breng de gel stuk in de doorboorde buis. Spin de gel in een microcentrifuge op maximale snelheid gedurende twee minuten, en verwijder de 0,5 milliliter buis die nu leeg zou moeten zijn. Voeg 300 microliter nucleasevrij 0,3 kiezen natriumchloride toe aan de geplette gel en plaats de buis minstens twee uur op een rotator bij kamertemperatuur.

Breng aan het einde van de incubatie de gemalen gelstukken over in een spinkolom en centrifuge gedurende twee minuten bij maximale snelheid in de microcentrifuge. Voor ongegeregeerde drie prime adapter eliminatie, grondig meng tien microliters nuclease vrij water met de geëxtraheerde RNA monster, en voeg zes microliter van drie kiezen natriumacetaat met mengen. Voeg 40 microliter magnetische zuiveringskralen en 60 microliter isopropanol toe aan het monster met grondig mengen.

En de vering vijf minuten bij kamertemperatuur uitbroeden. Plaats het monster aan het einde van de incubatie op een magnetisch rek, totdat de oplossing duidelijk wordt. Verwijder de heldere supernatant, en voeg 180 microliter vers bereide 80%-ethanol toe aan de kralen.

Na 30 seconden, verwijder de ethanol en kort draai de buis. Verwijder de restvloeistof die aan de onderkant van de buis kan zijn verzameld en laat de kralen twee minuten drogen voordat het monster opnieuw wordt opgehangen in 22 microliter van 10 millimolar Tris. Na twee minuten magnetiseren van het monster totdat de oplossing duidelijk lijkt.

Meng vervolgens 20 microliter heldere supernatant met zes microliter van drie molaire natriumacetaat in een nieuwe buis en voeg 40 microliter magnetische kralen en 60 microliter van 100% isopropanol toe. Na vijf minuten bij kamertemperatuur magnetiseert u het monster totdat de oplossing duidelijk lijkt, voordat u de supernatant verwijdert. Behandel het monster met 180 microliter vers bereide 80%-ethanol gedurende 30 seconden voordat u de ethanol verwijdert die door het monster draait en verwijder alle restvloeistof die zich aan de onderkant van de buis heeft opgehoopt.

Nadat de kralen twee minuten hebben laten drogen, moet u ze gedurende twee minuten opnieuw ophangen in 10 microliters nucleasevrij water, voordat het monster wordt gemagnetiseerd totdat de oplossing duidelijk wordt. Breng vervolgens negen microliter supernatant over naar een nieuwe buis en voeg een microliter T4 RNA-ligasebuffer en één micrcoliter van water toe aan het monster. Voor gelzuivering, draaien vijf, tien en twintig microliters van PCR product op een native 6%TBE gel voor ongeveer een uur.

Incubeer de voltooide gel met nucleïnezuurgelvlek in water gedurende tien tot vijftien minuten en bekijk de gel op een transilluminator om extractie van de 150 base pair bibliotheekband mogelijk te maken. Omdat het moeilijk is om de 150 base pair band die hen vertegenwoordigt te isoleren, zijn dit onze bibliotheek, vanwege de aanwezigheid van nauw migrerende zijproducten moet u de gel zeer zorgvuldig snijden. Isoleer dan het RNA zoals net aangetoond.

Voor wijziging van raw-sequentiebestanden download je de fastq-sequentiebestanden die tijdens de sequencing-run zijn gegenereerd en preformeren demultiplexing met bcl2fastq2 indien nodig. Verwijder adaptersequenties met cutodapt en gebruik de opdracht zoals aangetoond. Gebruik seqtk zoals aangegeven om de terminal willekeurige nucleotiden in de sequenties leest te verwijderen.

Gebruik vervolgens de opdracht awk zoals aangegeven, om de sequenties korter dan 10 nucleotiden te verwijderen. Als u de bijgesneden sequenties in kaart wilt brengen, opent u miRBase en downloadt u het volwassen fa-bestand. Gebruik de opdracht zoals aangegeven om U-residuen te vervangen door T-residuen, om een volledige lijst op te leveren van alle micro-RNAs in de database, afkomstig van een verscheidenheid aan organismen.

Selecteer de micro-RNA-sequenties van het organisme van belang, met de opdracht zoals aangegeven, en breng de leest in kaart met het bestand met behulp van bowtie2, waardoor er geen mismatches mogelijk zijn. Gebruik het gereedschap om de reeksen leest uit te lijnen op de database, die vereist dat een lezen volledig kaarten naar een micro-RNA van de database, met uit eventuele mismatches zoals aangegeven. Gebruik vervolgens de opdracht om de reads die niet zijn uitgelijnd, te verwijderen.

Na het laden van steeds grotere hoeveelheden van een PCR versterkte bibliotheek op een gel zoals aangetoond, kunnen de producten die overeenkomen met de verwachte grootte worden geëxtraheerd. Na elutie kan de gezuiverde bibliotheek worden gecontroleerd op een capillaire gel elektroforese chip. Naast de verwachte 150 base pair product, en een toenemend deel van een 130 base pair soorten die overeenkomen met adapter dimers, worden meestal waargenomen als toenemende hoeveelheid PCR-product worden geladen.

Vergelijkbare resultaten worden verkregen wanneer bibliotheken uit een mix van synthetische kleine RNAs worden bereid met behulp van reagentia uit kits, of andere benodigdheden. Ter vergelijking, eerder gepubliceerde resultaten voor dezelfde kleine RNA mix worden weergegeven. Hier wordt een vergelijking weergegeven voor de prestaties van protocol TS5 met het standaard TS-protocol voor de detectie van menselijke ongewijzigde en twee eerste O-methal gemodificeerde plantmicro RNAs.

De detectie van twee prime O-methal gemodificeerde piRNAs in menselijke monsters werd ook getest. Zoals waargenomen TS5 voorgevormd aanzienlijk beter dan TS voor de detectie van twee prime O-methal RNAs, maar niet voor ongewijzigde RNAs. Voorbereiden repliceren bibliotheken voor elk voorbeeld op verschillende datums.

Meestal is er weinig variatie tussen replica's gelijktijdig gemaakt, of er kan aanzienlijke variatie tussen bibliotheken bereid op verschillende data.