Name: Verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Leer hoe je de nauwkeurigheid van flowcytometrische metingen van mitochondriaal membraanpotentieel in hematopoëtische stamcellen verbetert door effluxpompen te remmen met Verapamil.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken alle leden van het ITO laboratorium, in het bijzonder K Ito en H Sato, en het Einstein stamcel instituut voor commentaren en de Einstein flow Cytometry en analytische Imaging Core facilities (gefinancierd door National Cancer Institute Grant P30 CA013330) voor helpen bij het uitvoeren van de experimenten. K.I. wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 en R01DK100689) en het New York State Department of Health als kern directeur van Einstein single-cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. ito is een onderzoeker van de leukemie en de lymfoom Society.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Albert Einstein College of Medicine.
1. voorbereiding van de oplossingen
<ol><li>Kleurings buffer (fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 2% foetaal runderserum (FBS)): Voeg 10 mL FBS toe in 500 mL van een steriele PBS-oplossing. Opmerking: Deze oplossing kan gedurende ten minste één maand in steriele toestand bij 4 °C worden bewaard. Voordat u met de volgende procedures begint, plaatst u een aliquot van deze oplossing (50 mL) op ijs.</li>
	<li>ACK (ammonium-chloride-kalium) lyseren buffer: plaats een aliquot van ACK lyseren buffer (1 ml) op ijs voordat u de procedure start. Opmerking: Om dezelfde niet-commerciële buffer voor te bereiden, Los 8,02 g van NH4cl, 1 g khco3 en 37,2 mg na2EDTA op in 1 L van H2O. Stel de pH in op 7,2-7.4. Bewaar tot 6 maanden bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Kweekmedium: Voeg 50 ng/mL stamcel factor (SCF) en 50 ng/mL trombopoëtine (TPO) toe aan serumvrij medium voor cultuur en uitbreiding van hematopoietische cellen (Zie tabel van het materiaal voor commercieel medium aanbevolen).</li>
	<li>TMRM stamoplossing: TMRM (1 μM) oplossing bereiden door 5 μg TMRM poeder op te lossen in 10 mL ethanol. Bewaar deze oplossing bij-20 °C beschermd tegen het licht.</li>
	<li>Verapamil Stock Solution: bereid verapamil (50 mM) oplossing door het verdunen van 24 mg verapamil in 1 mL ethanol. Bewaar deze oplossing bij-20 °C.</li>
	<li>FCCP Stock Solution: bereiding carbonilcyanide p-triflouromethoxyphenylhydrazone (FCCP) (1 M) oplossing door het oplossen van 254 mg in 1 mL ethanol. Bewaar deze oplossing bij-20 °C beschermd tegen het licht.</li>
</ol>2. beenmerg isolatie
<ol><li>Euthaniseer de muis door CO2 inademing na institutionele richtlijnen en spray de muizen met 70% ethanol. Opmerking: Deze stap voorkomt besmetting van de cellen van belang zonder afbreuk te doen aan experimentele resultaten.</li>
	<li>Gebruik een paar tang en een scherpe schaar, maak een kleine knipsel in de ventrale huid van de muis en strek de huid.</li>
	<li>Extract het dijbeen en de Tibia terwijl het verzorgen van de hoofden van het dijbeen niet te ontzetten als ze een grote hoeveelheid beenmergcellen bevatten. Plaats de verwijderde botten in een 6-put-plaat gevuld met 1,5 mL kleurings buffer. Opmerking: Deze procedure vereist geen steriel gebied.</li>
	<li>Verwijder de spieren uit de botten en snijd de uiteinden van de botten waardoor de uitgang van het beenmerg (Figuur 1a). Plaats de gereinigde botten in nieuwe putjes met 1,5 mL kleurings buffer. Opmerking: Spieren en andere weefsels moeten zorgvuldig worden verwijderd om te voorkomen dat de spuit verstopt in de volgende stap.</li>
	<li>Spoel het beenmerg uit met een 3 mL spuit met een 25 G naald. Opmerking: Blijf het beenmerg spoelen totdat het bot wit wordt (Figuur 1b).</li>
	<li>Verzamel alle cellen in een tube van 1,5 mL, Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 180 x g en gooi de supernatant weg (figuur 1c).</li>
	<li>Rebreng de pellet in 300 μL ijskoude ACK lyseren buffer zeer zorgvuldig, zet het ijs gedurende 1 minuut en onmiddellijk inactieve lysis door 1 ml kleurings buffer toe te voegen. Centrifugeer 5 min bij 180 x g. Opmerking: De cellen pellet verschijnt wit (figuur 1d). Het totale aantal geïsoleerde cellen is ongeveer 2-4 x 107.</li>
	<li>Respendeer de pellets in 1 mL kleurings buffer en filtreer met behulp van een celstrainer dop (12 x 75 mm2,5ml capaciteit) met een 35 μm nylon gaas dat is ingebouwd om mononucleaire cellen te verkrijgen. Houd het monster na het blokkeren op ijs.</li>
</ol>3. immunokleuring voor detectie van HSC
<ol><li>Bereid Lineage (Lin) cocktail. Voeg in 400 μL kleurings buffer 4 μL van de volgende biotinilated antilichamen toe tegen CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, GR1, Ter119, CD19, NK 1.1, IgM en Il7Ra om een uiteindelijke verdunning 1:100 te verkrijgen.</li>
	<li>Bereid fluoroforen geconjugeerd-antilichamen (ABS). Voeg in 400 μL kleurings buffer 4 μL van de volgende ABS toe om een uiteindelijke verdunning 1:100 te verkrijgen. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-Kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/CY 5.5 en CD34-FITC. Bewaren in ijs, beschermd tegen licht.</li>
	<li>Centrifugeer het monster 5 min bij 180 x gen gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 400 μL Lin cocktail oplossing toe aan de cellen pellet. Voeg 4 μL CD135-biotinilated AB. Vortex snel toe om 30 minuten in ijs te mengen en te inbroed.</li>
	<li>Was het monster met 3 mL kleurings buffer, draai gedurende 5 minuten op 180 x g en gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Voeg 400 μL ABS-oplossing toe. Vortex snel te mengen en inbroed voor 30 min op ijs.</li>
	<li>Was de monsters met 3 mL kleurings buffer, draai gedurende 5 minuten op 180 x g en gooi het supernatant weg.</li>
</ol>4. TMRM-kleuring
<ol><li>Bereid TMRM-kleurings oplossing voor. Voeg 2,2 μL TMRM-stamoplossing en 1,1 μL verapamil (respectievelijk 2 nM en 50 μM als eindconcentratie) toe in 1,1 mL serumvrij medium voor cultuur en uitbreiding van hematopoietische cellen (Zie tabel van het materiaal voor commercieel medium aanbevolen) met TPO en SCF. Opmerking: Dit is de belangrijkste stap van het protocol. Verapamil toevoeging is noodzakelijk voor het blokkeren van de Efflux pompen die sterk worden uitgedrukt in de HSCs en kan extruderen tmrm.</li>
	<li>Hervat het beenmerg in 1 mL TMRM-kleurings oplossing, Vortex snel en inincuberen voor 1 uur bij 37 °C. Opmerking: TMRM-kleuring mag niet worden weggespoeld. PE-specifieke compensatie controle wordt ook gehersuspendeerd in 100 μL TMRM-kleurings oplossing en wordt gedurende 1 uur bij 37 °C na een snelle Vortex geincubatie.</li>
	<li>Filtreer het monster met behulp van een celstrainer dop (12 x 75 mm2,5ml capaciteit) met een 35 μm nylon gaas ingebouwd om verstopping van de flow cytometer te voorkomen. Opmerking: TMRM-kleuring verhoogt de mogelijkheid van verstoppen van de vorming in het monster. Filtratie van het monster vlak voor stroming testen wordt aanbevolen.</li>
	<li>Voeg 1 μL 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) toe om dode cellen uit te sluiten doorstroming cytometrie.</li>
</ol>5. overname door flow cytometer
<ol><li>Voer beenmerg monster uit en verkrijg ten minste 1 x 106 gebeurtenissen.</li>
	<li>
Stel de gating-strategie in om de verschillende hematopoietische populaties te identificeren (Figuur 2).
	<ol>
<li>Laat levend beenmerg mono-nucleaire cellen (BM-MNCs), DAPI− Fractie, in plot voor Pacific Blue zien om CD135−Lin− (Lin−) en Lin+ fracties te identificeren.</li>
		<li>Plot Lin− fractie voor APC/Cy7 (c-Kit) versus PE/Cy7 (SCA-1) voor het identificeren van multipotente voorlopercellen (MPP) Fractie, als c-Kit+ en SCA-1+.</li>
		<li>Plot MPP-fractie voor APC (CD48) versus PerCP/CY 5.5 (CD150) om HSC-breuk te identificeren, zoals CD150+ en CD48−.</li>
		<li>Display HSC-fractie voor FITC (CD34) om CD34−-HSC en CD34+-HSC te verdelen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verkrijg de TMRM-intensiteit (PE-kanaal) in elke populatie.</li>
	<li>Voeg na de overname toe aan het monster 1 μL FCCP om de uiteindelijke concentratie van 1 mM te verkrijgen en inbroed bij 37 °C gedurende 5 minuten en verkrijg vervolgens 1 x 106 gebeurtenissen. Opmerking: FCCP is een mitochondriale ontkoppelaar die wordt gebruikt om de ΔΨm te verdrijven. Het wordt gebruikt als experimentele controle om te bevestigen dat TMRM kleuring correct werkt. Na de toediening van FCCP moet de intensiteit van de TMRM drastisch worden verlaagd (Figuur 3a).</li>
	<li>Gegevens analyseren normaliseren van de gemiddelde intensiteit van de PE van elke populatie door de intensiteit van de PE van alle BM-Mnc's.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells%3A+origins%2C+phenotypes%2C+lineage+commitments%2C+and+transdifferentiations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li>
<li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell%3A+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li>
<li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+a+purified+Tie2%2B+hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+synthesis+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li>
<li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li>
<li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li>
<li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125(2016).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+and+cyclosporin+A-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Mitochondriale membraan potentiële meting is een hoeksteen van de analyse en de beoordeling van de mitochondriën, die essentieel zijn voor de metabole toestand van de cel. Hier beschrijven we een protocol voor de analyse van ΔΨm door TMRM-kleuring. TMRM is een cel-perbetekende fluorescerende kleurstof die accuiteert in actieve mitochondriën als gevolg van ΔΨm, en de respectieve niveaus blijven in evenwicht tussen de extracellulaire, cytoplasmische en mitochondriale compartimenten10. Dit protocol k...

Hematopoietische stamcellen (hscs) zijn zelfvernieuwend, multi-potent, en kunnen aanleiding geven tot alle cellen van het bloed1,2. Cellulaire metabolisme is een belangrijke regulator van HSC-onderhoud, samen met transcriptionele factoren, intrinsieke signalen en de micro-omgeving3,4,5. De juiste controle van de mitochondriale functie en kwaliteit is daarom van cruciaal belang voor HSC-onderhoud6,7.
Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) is een belangrijke parameter in de beoordeling van mitochondriën als het direct weerspiegelt hun functionaliteit, die voortvloeit uit het evenwicht van proton pomp activiteit in de elektronentransport keten en de Proton stroom door F 1/FO ATP-synthase. Deze zijn beide nodig (afhankelijk van de genexpressie en beschikbaarheid van het substraat) voor de zuurstof afhankelijke fosforylering van ADP naar ATP8,9. Door gebruik te maken van de electronegativiteit van het mitochondriale compartiment zijn verschillende potentiometrische kleurstoffen ontwikkeld om ΔΨm te meten. Een van hen is tetramethylrhodamine methyl ester perchloraat (TMRM), die uitgebreid is gebruikt voor het meten van ΔΨm doorstroming cytometrie in een verscheidenheid van cellen10, met inbegrip van hematopoietische stam en voorlopercellen11.
Mitochondriale kleurstoffen moeten worden gebruikt met enige voorzichtigheid in HSCs, echter, omdat de hoge activiteit van de xenobiotische Efflux pompen van deze cellen kan resulteren in kleurstof extrusie12. Inderdaad, de extrusie van mitochondriale kleurstoffen zoals Rhodamine 123 heeft onderzoekers toegestaan HSCs13 te isoleren of te identificeren HSC "side populaties" door het benutten van de differentiële extrusie van de kleurstoffen Hoechst blauw en Hoechst rood14, 15. ook is aangetoond dat Fumitremorgin C, een specifieke blokkade van de ATP-bindende cassette subgroep G member 2 (ABCG2), geen invloed heeft op het kleurings patroon van MitoTracker in HSPCs16. Na de publicatie van deze resultaten, meerdere studies werden uitgevoerd met behulp van mitochondriale kleurstoffen in de afwezigheid van xenobiotische Efflux pomp remmers, wat leidt tot de wijdverbreide indruk dat HSCs slechts een klein aantal mitochondriën met lage ΔΨm hebben16 , 17 , 18.
Onlangs werd echter aangetoond dat verapamil, een breed spectrum remmer van effluxpompen, het kleurings patroon van de mitochondriale kleurstof MitoTracker Green19aanzienlijk wijzigt. Dit verschil is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat Fumitremorgin C zeer selectief is voor Abcg2, terwijl HSCs ook andere transporters uitdrukken, zoals Abcb1a (die slechts zwak gevoelig is voor Fumitremorgin C)19. We hebben ook gemeld dat andere mitochondriale kleurstoffen, zoals TMRM, nonyl acridine Orange en Mitotracker Orange (MTO) dezelfde patronen vertonen als Mitotracker Green. Wat nog belangrijker is, we hebben geconstateerd dat de Flow cytometrische patronen van HSPCs weerspiegelen hun ΔΨm in aanvulling op mitochondriale massa11.
De inname van TMRM kleurstof is strikt afhankelijk van de negatieve lading van de mitochondriën, maar de resulterende accumulatie van kleurstof is in constante balans tussen de inname en de klaring door Efflux pompen20. Het verschil in xenobiotische effluxpomp expressie tussen HSCs en volwassen celpopulaties beïnvloedt dit evenwicht en kan leiden tot bevooroordeelde resultaten. Het gebruik van speciale remmers zoals verapamil moet worden overwogen bij de analyse van ΔΨm door potentiometrische kleurstoffen. Hier beschrijven we een gewijzigd protocol voor nauwkeurige ΔΨm meting door TMRM gebaseerde flow cytometrie die corrigeert voor xenobiotische Transporter activiteit door het gebruik van speciale remmers.

<table><tbody><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>B220-biotin</td><td>BD Bioscience</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD3e-biotin</td><td>Life Technologies</td><td>13-0031-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4-biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-biotin</td><td>Life Technologies</td><td>13-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-biotin</td><td>BD Bioscience</td><td>553309</td><td></td></tr><tr><td>CD19-biotin</td><td>BD Bioscience</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>CD48-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0481-82</td><td></td></tr><tr><td>CD135-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1351-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-PerCP/Cy5.5&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>115922</td><td></td></tr><tr><td>c-kit-APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>Cyclosporin H</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1575-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI solution (1 mg/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Gr1-biotin</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>IgM-biotin</td><td>Life Technologies</td><td>13-5790-85</td><td></td></tr><tr><td>Il7R&alpha;-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td></td></tr><tr><td>Nk1.1-biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553163</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sca-1-PE/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-81</td><td></td></tr><tr><td>SCF murine</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03-10UG</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM medium</td><td>STEMCELL technologies</td><td>9605</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Pacific Blue</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>Ter119-biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553672</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5428-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>315-14-10UG</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>V4629-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Als cellulaire metabolisme is een belangrijke regulator van hematopoietische stamcel (HSC) zelf vernieuwing, de verschillende rollen gespeeld door de mitochondriën in hematopoietische homeostase zijn uitgebreid bestudeerd door HSC onderzoekers. Mitochondriale activiteit niveaus worden weerspiegeld in hun membraan mogelijkheden (ΔΨm), die kan worden gemeten door cel-perbetekende kationische kleurstoffen zoals tmrm (tetramethylrhodamine, methyl ester). Het vermogen van effluxpompen om deze kleurstoffen uit cellen te extrumaken, kan echter hun bruikbaarheid beperken. De resulterende meet bias is met name van cruciaal belang bij de beoordeling van HSCs, omdat xenobiotische transporters hogere niveaus van expressie en activiteit vertonen in HSCs dan in gedifferentieerde cellen. Hier beschrijven we een protocol met behulp van verapamil, een effluxpomp remmer, om nauwkeurig ΔΨm te meten over meerdere beenmerg populaties. De resulterende remming van de activiteit van de pomp is aangetoond dat de intensiteit van de TMRM in hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) te verhogen, terwijl het verlaten van het relatief onveranderd in rijpe fracties. Dit benadrukt de nauwe aandacht voor kleurstof-Efflux activiteit die nodig is wanneer ΔΨm-afhankelijke kleurstoffen worden gebruikt, en zoals geschreven en gevisualiseerd, dit protocol kan worden gebruikt om nauwkeurig te vergelijken ofwel verschillende populaties binnen het beenmerg, of dezelfde populatie over verschillende experimentele modellen.

Het hierboven beschreven protocol maakt het eenvoudig isoleren van BM-Mnc's van een muismodel mogelijk. Figuur 1 vat de belangrijkste stappen van het protocol samen: botisolatie, blozen uit het beenmerg, rode bloedcel lysis, en antilichaam kleuring gevolgd door tmrm kleuring om Mitochondriale membraanpotentiaal in een specifieke hematopoietische populatie te meten .
BM-Mnc's bevatten verschillende celpopulaties, waaronder HSCs. De cocktails van antilichamen die in...

Xenobiotic Efflux pompen zijn zeer actief in hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) en veroorzaken extrusie van TMRM, een mitochondriale membraan potentiële fluorescerende kleurstof. Hier presenteren we een protocol om het mitochondriale membraan potentieel in Hspc's met TMRM nauwkeurig te meten in aanwezigheid van verapamil, een effluxpomp remmer.

Verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Mitochondriale functie is van cruciaal belang voor hematopoietische stamcel zelfvernieuwing. Mitochondriale activiteit is een reflector van het binnenste mitochondriale membraanpotentieel, dat kan worden gemeten door TMRM, een cel fluorescerende, cel-permeant kationische kleurstof. Xenobiotische efflux pompen zijn zeer actief in HSC, en veroorzaken TMRM extrusie.Het belangrijkste voordeel van dit protocol, is de correctie van dit effect, met behulp van Verapamil, een remmer van de efflux pompen. Begin met het isoleren van beenmerg van muisvrouwjes. Gebruik een tang en een scherpe schaar om de twee achterste poten te snijden.Maak vervolgens een kleine knip in de ventrale huid van de muis, en strek het uit. Haal het dijbeen en het scheenbeen eruit, terwijl je ervoor zorgt dat je de hoofden van het dijbeen niet los maakt en plaats de botten in een zes-put plaat, gevuld met 1,5 milliliter kleuringsbuffer. Verwijder de spieren van de botten, en snijd de uiteinden van de botten, waardoor beenmerg te verlaten.Plaats de gereinigde botten in nieuwe putten, met 1,5 milliliter kleuring buffer. Spoel vervolgens het beenmerg weg met een spuit van drie milliliter en een naald van 25 meter, totdat het bot wit wordt. Verzamel alle cellen in een buis van 1,5 milliliter en vercentrifugeer ze gedurende vijf minuten op 180 keer G en gooi de supernatant weg.Voorzichtig resuspend de pellet in 300 microliters van ijskoude ACK lysing buffer, en zet de cellen op ijs voor een minuut. Schakel vervolgens onmiddellijk lyse uit door een milliliter kleuringsbuffer toe te voegen. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 180 keer G.Resuspend de celpellet, die wit zou moeten lijken, in een milliliter kleuringsbuffer.Filter de cellen met behulp van een cel zeef dop, met een 35 micrometer nylon mesh, om mononucleaire cellen te verkrijgen. Begin met het bereiden van de stamcocktail, en fluorofofre geconjugeerde antilichamen, volgens manuscriptrichtingen. Houd de antilichamen op ijs en beschermd tegen licht.Vervolgens centrifuge het monster gedurende vijf minuten op 180 keer G en gooi het supernatant weg. Voeg 400 microliter van de lijncocktail en vier microliter cd135 biotinylhoudende antilichamen toe aan de celpellet en draaikolk het mengsel. Dan uitbroeden op ijs voor 30 minuten.Na de incubatie, was het monster door het toevoegen van drie milliliter vlekken buffer, spinnen het naar beneden voor vijf minuten op 180 keer G, en het weggooien van de supernatant. Voeg vervolgens 400 microliter antilichaamoplossing toe en draaikolk het mengsel. Broed het nog 30 minuten op ijs en herhaal de was met de kleurbuffer.Om de TMRM-kleuroplossing voor te bereiden, voegt u 2,2 microliter TMRM-voorraadoplossing en 1,1 microliter Verapamil toe aan 1,1 milliliter serumvrije hematopoietische kweekmedium, met trombopoietine en stamcelfactor. Resuspend het beenmerg in een milliliter van de TMRM kleuroplossing, vortex snel, en incubeer voor een uur op 37 graden Celsius. Filter het monster met behulp van een cel zeef dop, met een 35 micrometer nylon mesh, om te voorkomen dat verstopping van de stroom cytometer.Voeg vervolgens een microliter van DAPI toe en ga verder met stroomcytometrie. Voer het beenmergmonster uit en verwerf minstens een miljoen evenementen. Geef vervolgens de levende beenmergmonnucleaire cellen weer in een plot voor pacific blue, om CD135 Lin-negatieve en Lin-positieve breuken te identificeren.Plot de Lin-negatieve fractie voor APC/Cy7 versus PE/Cy7 om de multipotente voorloper of MPP-fractie te identificeren. Zet vervolgens de MPP-fractie voor APC versus PerCP/Cy5.5 in kaart om de hematopoietische stamcel of HSC-fractie te identificeren. Geef de HSC-fractie voor FITC of CD34 weer om deze te verdelen in cd34-negatieve HSC- en CD34-positieve HSC-fracties.Ten slotte verwerven van de TMRM intensiteit in elke populatie. Om ervoor te zorgen dat TMRM-vlekken correct werkten, voegt u een microliter FCCP toe aan het monster, voor een laatste concentratie van één millimolar en ontcuut het gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Dan verwerven een miljoen evenementen.Na fccp toevoeging, TMRM intensiteit moet drastisch worden verhoogd. Dit protocol is met succes gebruikt om mitochondriaal membraan potentieel te kwantificeren in verschillende celpopulaties, met TMRM kleurstof. Aangetoond is dat de aanwezigheid van PBS en FBS in het kweekmedium de signaalintensiteit van TMRM beïnvloedt.Het is dus belangrijk om TMRM-kleuring uit te voeren in serumvrij expansiemedium. Hematopoietische stamcellen drukken hoge activiteitsniveaus uit van xenobiotische effluxpompen die TMRM-kleurstof extruderen. TMRM-profielen variëren dus ook in de aanwezigheid van Verapamil of Cyclosporin H, die de pompen blokkeren.Om de nauwkeurigheid van TMRM-kleuring te verifiëren, kan FCCP de mitochondriën depolariseren en de TMRM-intensiteit verminderen. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast voor het bestuderen van HSC met een andere mitochondriale membraan potentiële kleurstof, met inbegrip van TMRE of JC-1. Evenals andere mitochondriale kleurstoffen zoals MitoTracker of MitoSOX.De kritische kwesties die zijn geërfd door de verschillende activiteit van effluxpompen onder de beenmergpopulatie, werden pas onlangs opgemerkt. Dus dit protocol is bedoeld om de discrepantie tussen eerdere bevindingen te verminderen.

improving-accuracy-flow-cytometric-assessment-mitochondrial-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de Mitochondriale membraanpotentiaal van cellen na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie

We beschrijven een methode voor het gebruik van Multi parameter flow cytometrie te detecteren mitochondriale reactieve zuurstof soorten (ROS) in Murine gezonde hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) en leukemie cellen van een muismodel van acute myeloïde leukemie (AML) gedreven door MLL-AF9.

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) overgang van een rusttoestand naar een differentiatie toestand als gevolg van hun metabole plasticiteit tijdens de bloedvorming. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van Hspc's.

Analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme

Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het meten van de mitochondriale massa en membraan potentieel in ex vivo gekweekte hematopoietische stamcellen en T-cellen.

Meting van het mitochondriale massa-en membraanpotentiaal in hematopoietische stamcellen en T-cellen doorstroming Cytometrie

Metabole aanpassing is fundamenteel voor T-cellen omdat het differentiatie, persistentie en cytotoxiciteit dicteert. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het monitoren van mitochondriale ademhaling in ex vivo cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen.

Real-time monitoring van mitochondriale ademhaling in cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de isolatie en kleuring van muriene beenmergcellen tot fenotype hemopoietische stam- en voorlopercellen, samen met de ondersteunende niche endotheel- en mesenchymale stamcellen. Een methode om cellen in endosteale en centrale beenmerggebieden te verrijken, is ook inbegrepen.

Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

Deze techniek beschrijft een effectieve workflow om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus in HeLa-cellen te visualiseren en kwantitatief te meten met behulp van op fluorescentie gebaseerde live beeldvorming.

Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen

Methoden voor het bestuderen van mitochondriale bio-energetica onder fysiologisch relevante substraatconcentraties in immuuncellen zijn beperkt. We bieden een gedetailleerd protocol dat gebruik maakt van fluorespirometrie met hoge resolutie om veranderingen in de reactie van het mitochondriale membraanpotentieel op de energievraag in menselijke T-cellen, monocyten en perifere mononucleaire cellen te beoordelen.

Fluorespirometrie met hoge resolutie om dynamische veranderingen in het mitochondriale membraanpotentiaal in menselijke immuuncellen te beoordelen

Leer hoe je de nauwkeurigheid van flowcytometrische metingen van mitochondriaal membraanpotentieel in hematopoëtische stamcellen verbetert door effluxpompen te remmen met Verapamil.

Verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen (Video) | JoVE Journal

Verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen

Meer video's verkennen