Verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen
30 juli 2019
Xenobiotic Efflux pompen zijn zeer actief in hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) en veroorzaken extrusie van TMRM, een mitochondriale membraan potentiële fluorescerende kleurstof. Hier presenteren we een protocol om het mitochondriale membraan potentieel in Hspc's met TMRM nauwkeurig te meten in aanwezigheid van verapamil, een effluxpomp remmer.
Mitochondriale functie is van cruciaal belang voor hematopoietische stamcel zelfvernieuwing. Mitochondriale activiteit is een reflector van het binnenste mitochondriale membraanpotentieel, dat kan worden gemeten door TMRM, een cel fluorescerende, cel-permeant kationische kleurstof. Xenobiotische efflux pompen zijn zeer actief in HSC, en veroorzaken TMRM extrusie.
Het belangrijkste voordeel van dit protocol, is de correctie van dit effect, met behulp van Verapamil, een remmer van de efflux pompen. Begin met het isoleren van beenmerg van muisvrouwjes. Gebruik een tang en een scherpe schaar om de twee achterste poten te snijden.
Maak vervolgens een kleine knip in de ventrale huid van de muis, en strek het uit. Haal het dijbeen en het scheenbeen eruit, terwijl je ervoor zorgt dat je de hoofden van het dijbeen niet los maakt en plaats de botten in een zes-put plaat, gevuld met 1,5 milliliter kleuringsbuffer. Verwijder de spieren van de botten, en snijd de uiteinden van de botten, waardoor beenmerg te verlaten.
Plaats de gereinigde botten in nieuwe putten, met 1,5 milliliter kleuring buffer. Spoel vervolgens het beenmerg weg met een spuit van drie milliliter en een naald van 25 meter, totdat het bot wit wordt. Verzamel alle cellen in een buis van 1,5 milliliter en vercentrifugeer ze gedurende vijf minuten op 180 keer G en gooi de supernatant weg.
Voorzichtig resuspend de pellet in 300 microliters van ijskoude ACK lysing buffer, en zet de cellen op ijs voor een minuut. Schakel vervolgens onmiddellijk lyse uit door een milliliter kleuringsbuffer toe te voegen. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 180 keer G.Resuspend de celpellet, die wit zou moeten lijken, in een milliliter kleuringsbuffer.
Filter de cellen met behulp van een cel zeef dop, met een 35 micrometer nylon mesh, om mononucleaire cellen te verkrijgen. Begin met het bereiden van de stamcocktail, en fluorofofre geconjugeerde antilichamen, volgens manuscriptrichtingen. Houd de antilichamen op ijs en beschermd tegen licht.
Vervolgens centrifuge het monster gedurende vijf minuten op 180 keer G en gooi het supernatant weg. Voeg 400 microliter van de lijncocktail en vier microliter cd135 biotinylhoudende antilichamen toe aan de celpellet en draaikolk het mengsel. Dan uitbroeden op ijs voor 30 minuten.
Na de incubatie, was het monster door het toevoegen van drie milliliter vlekken buffer, spinnen het naar beneden voor vijf minuten op 180 keer G, en het weggooien van de supernatant. Voeg vervolgens 400 microliter antilichaamoplossing toe en draaikolk het mengsel. Broed het nog 30 minuten op ijs en herhaal de was met de kleurbuffer.
Om de TMRM-kleuroplossing voor te bereiden, voegt u 2,2 microliter TMRM-voorraadoplossing en 1,1 microliter Verapamil toe aan 1,1 milliliter serumvrije hematopoietische kweekmedium, met trombopoietine en stamcelfactor. Resuspend het beenmerg in een milliliter van de TMRM kleuroplossing, vortex snel, en incubeer voor een uur op 37 graden Celsius. Filter het monster met behulp van een cel zeef dop, met een 35 micrometer nylon mesh, om te voorkomen dat verstopping van de stroom cytometer.
Voeg vervolgens een microliter van DAPI toe en ga verder met stroomcytometrie. Voer het beenmergmonster uit en verwerf minstens een miljoen evenementen. Geef vervolgens de levende beenmergmonnucleaire cellen weer in een plot voor pacific blue, om CD135 Lin-negatieve en Lin-positieve breuken te identificeren.
Plot de Lin-negatieve fractie voor APC/Cy7 versus PE/Cy7 om de multipotente voorloper of MPP-fractie te identificeren. Zet vervolgens de MPP-fractie voor APC versus PerCP/Cy5.5 in kaart om de hematopoietische stamcel of HSC-fractie te identificeren. Geef de HSC-fractie voor FITC of CD34 weer om deze te verdelen in cd34-negatieve HSC- en CD34-positieve HSC-fracties.
Ten slotte verwerven van de TMRM intensiteit in elke populatie. Om ervoor te zorgen dat TMRM-vlekken correct werkten, voegt u een microliter FCCP toe aan het monster, voor een laatste concentratie van één millimolar en ontcuut het gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Dan verwerven een miljoen evenementen.
Na fccp toevoeging, TMRM intensiteit moet drastisch worden verhoogd. Dit protocol is met succes gebruikt om mitochondriaal membraan potentieel te kwantificeren in verschillende celpopulaties, met TMRM kleurstof. Aangetoond is dat de aanwezigheid van PBS en FBS in het kweekmedium de signaalintensiteit van TMRM beïnvloedt.
Het is dus belangrijk om TMRM-kleuring uit te voeren in serumvrij expansiemedium. Hematopoietische stamcellen drukken hoge activiteitsniveaus uit van xenobiotische effluxpompen die TMRM-kleurstof extruderen. TMRM-profielen variëren dus ook in de aanwezigheid van Verapamil of Cyclosporin H, die de pompen blokkeren.
Om de nauwkeurigheid van TMRM-kleuring te verifiëren, kan FCCP de mitochondriën depolariseren en de TMRM-intensiteit verminderen. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast voor het bestuderen van HSC met een andere mitochondriale membraan potentiële kleurstof, met inbegrip van TMRE of JC-1. Evenals andere mitochondriale kleurstoffen zoals MitoTracker of MitoSOX.
De kritische kwesties die zijn geërfd door de verschillende activiteit van effluxpompen onder de beenmergpopulatie, werden pas onlangs opgemerkt. Dus dit protocol is bedoeld om de discrepantie tussen eerdere bevindingen te verminderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt het mitochondriale membraanpotentiaal in hematopoëtische stam- en progenitorcellen (HSPCs) met behulp van TMRM, een fluorescerende kleurstof, en de impact van xenobiotische effluxpompen. Er wordt een protocol gepresenteerd waarin Verapamil is opgenomen om de TMRM-niveaus nauwkeurig te meten door deze pompen te remmen, wat een betrouwbare beoordeling van de mitochondriale functie mogelijk maakt.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Mitochondriële dynamiek in stamcellen
- Cellulaire effluxmechanismen
- Meting van membraanpotentiaal
Achtergrond
- Belang van mitochondriale functie bij de vernieuwing van stamcellen
- Uitdagingen bij kleuringmetingen veroorzaakt door effluxpompen
- Gebruik van TMRM als indicator voor het mitochondriale potentiaal
Gebruikte methoden
- Isolatie van beenmerg uit muizen
- Flowcytometrie voor analyse van celpopulaties
- Remming van effluxpompen met behulp van Verapamil
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van het mitochondriële membraanpotentieel in HSPCs
- Aangetoonde effecten van Verapamil op de retentie van TMRM
- Aanpasbaarheid van het protocol voor alternatieve mitochondriële kleurstoffen
Conclusies
- De studie biedt een betrouwbare methode voor het beoordelen van de mitochondriale activiteit in stamcellen.
- De resultaten verbeteren het begrip van de biologie van stamcellen en de effecten van farmacologische middelen op de mitochondriale functie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Een nauwkeurige beoordeling van het mitochondriale membraanpotentiaal in hematopoëtische stam- en progenitorcellen is essentieel voor het begrijpen van de zelfvernieuwing van stamcellen en de metabole regulatie. De activiteit van effluxpompen in deze cellen kan fluorescentiekleuringen verstoren, wat leidt tot vertekende gegevens die de validatie van targets en de betrouwbaarheid van preklinische modellen beïnvloeden. Dit protocol pakt een belangrijke technische beperking aan bij flowcytometrie-assays, waardoor de consistentie van gegevens voor downstream discovery en translationele toepassingen wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar mitochondriële functie als therapeutisch doelwit in hematopoëtische stamcellen mogelijk door meetartefacten door kleurstofefflux te verminderen.
- Operationele waarde: Ondersteunt een consistente vergelijking van stamcel- en progenitorcelpopulaties over verschillende experimentele modellen door te corrigeren voor variabiliteit in xenobiotische transporters.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde hematopoëtische systemen voor op compound-screening door te garanderen dat read-outs van het mitochondriële potentieel de werkelijke biologische staat weerspiegelen in plaats van effluxactiviteit.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays door het gebruik van effluxpompremmers zoals Verapamil in kleuringsprotocollen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert mechanistische risicoreductie door betrouwbare gegevens over de mitochondriale activiteit te leveren die gekoppeld zijn aan zelfvernieuwingspaden van stamcellen.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie door een belangrijke functionele readout te standaardiseren over verschillende modelsystemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm door hypothesetoetsing in de stamcelbiologie te ondersteunen en betrouwbare functionele profilering mogelijk te maken voorafgaand aan inspanningen voor de identificatie van lead-verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt de validatie van mitochondriale targets en de verduidelijking van signaalpaden in hematopoëtische systemen door vals-lage signalen door kleurextrusie te minimaliseren.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare metingen van het mitochondriale potentieel wanneer efflux wordt geremd, waardoor de detectie van compound-effecten wordt verbeterd.
- Analytics: Genereert flowcytometrie-gebaseerde read-outs (TMRM-intensiteit) die vergelijking van metabole toestanden tussen verschillende celfracties en behandelcondities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door een vertaalbare maatstaf voor de conditie van stamcellen te bieden die correleert met functionele uitkomsten.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare flowcytometrie-workflow voor het beoordelen van de mitochondriale gezondheid in stamcelmodellen over meerdere projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in studies naar stamcelmechanismen door een belangrijke bron van assayvariabiliteit te elimineren.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van mitochondriale assays in hematopoëtische onderzoeksettings.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen bij targetvalidatie door het aantal fout-negatieven in verband met kleurefflux te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van stamceltargets mogelijk op basis van nauwkeurigere functionele gegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie, stamcelisolatie en het omgaan met fluorescente kleurstoffen.
- Afhankelijkheid van toegang tot Verapamil of alternatieve effluxpompremmers en compatibele kleuringsbuffers.
- Standaardisatie tussen teams is noodzakelijk om consistente timing en concentratie van de remmer te waarborgen.
- Er moet rekening worden gehouden met mogelijke off-target effecten van Verapamil op de cellevensvatbaarheid of het metabolisme in langetermijnculturen.
- Beperkt tot toepassingen waarbij het mitochondriale membraanpotentiaal een relevante functionele readout is en waarbij bekend is dat effluxactiviteit interfereert.
