Menselijke Eier looptijd beoordeling en de klinische toepassing ervan

In de klinische praktijk, het is gebruikelijk om aan te nemen dat elke eicel weergegeven van een polair lichaam is klaar voor bevruchting. Life imaging van menselijke oocyten rijping blijkt dat een polair lichaam zichtbaar wordt goed voordat de bipolaire metafase II spindel is gemonteerd, het creëren van het risico van een vroegtijdige sperma-injectie. Gepolariseerde lichtmicroscopie maakt een niet-invasieve visualisatie van de meiotische spindel in menselijke eicellen mogelijk en kan veilig worden gebruikt in IFV om de rijpheid van het ei te beoordelen voordat intracytoplasmatische spermainjectie.

Het optimaliseren van de timing van het ICSI is vooral belangrijk bij een slechte prognose van IVF-cycli, met een laag aantal eicellen beschikbaar voor bevruchting. Deze klinische procedure is een add-on techniek om standaard IVF-behandeling, en moet worden voorgevormd door ervaren personeel, in overeenstemming met goede laboratoriumpraktijken. 35 tot 36 uur na de menselijke chorionic gonadotropin injectie, verzamel de opgehaalde cumulus-eicellen complexen in kooldioxide-onafhankelijke behandeling medium.

Equilibrate de eicellen gedurende 10 tot 15 minuten in een koolstofdioxide-onafhankelijke incubator op 37 graden Celsius. Stel de eicellen bloot aan een hoge hyaluronidase-oplossing, verdund in handling medium. Gebruik na 30 seconden een pipet van 200 microliter om cumulus-coronacellen mechanisch te verwijderen.

Beoordeel het aantal en de ontwikkelingsstatus van de ontudeerde eicellen op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van de kern en het eerste polaire lichaam. Plaats kiminale blaasvlees stadium, en metafase I en metafase II fase eicellen in individuele druppels van kooldioxide-onafhankelijke cultuur medium, bedekt met minerale olie. Plaats vervolgens de eicellen op 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 6% zuurstof met vochtigheid gedurende 3 tot 4 uur.

Om teeltplaten voor te bereiden op de embryocultuur, voegt u het juiste volume van het vooraf geëquilibreerde kweekmedium toe tot individuele putten van een geschikte kweekplaat. Bedek de druppels met geëquilibreerde minerale olie, label de plaat met een unieke identificatie en plaats deze gedurende ten minste 20 minuten in een koolstofdioxide-afhankelijke uncubator. Om de ICSI schotel te bereiden, voeg 5 microliter druppeltjes van voorverwarmd behandelingsmedium voor elke polaire lichaam-tonende eicellen, en één extra druppel voor naald-was aan een schoon plastic schotel toe.

Voeg een extra druppel PVP-oplossing toe voor spermaimmobilisatie voorafgaand aan de intracytoplasmatische spermainjectie en overlay de druppels met voorverwarmde minerale olie. Zorg ervoor dat u de schotel label. Plaats vervolgens de spermainjectieschaal gedurende ten minste 20 minuten in een koolstofdioxide-onafhankelijke couveuse.

Terwijl de plaat is evenwicht, voeg 5 microliter druppels van voorverwarmde handling medium voor elke polaire body-displaying oocyte aan een glazen bodem cultuur schotel. Overlay alle druppels met voorverwarmde minerale olie. Zorg ervoor dat u de schotel label.

Plaats de plaat vervolgens gedurende ten minste 20 minuten in een koolstofdioxide-onafhankelijke couveuse. Terwijl de platen in evenwicht zijn, schakel u het verwarmde podium op de omgekeerde microscoop in en past u de steriele houd- en spermainjectienaald in micro-injectiehouders. Breng de naalden in beeld en selecteer het juiste doel, waarbij u ervoor zorgt dat de condensor zich in de lichte veldpositie bevindt.

Plaats het groene interferentiefilter en stel de schuifregelaar voor vloeibare kristallen in op werkpositie. Stel de sluiter in op ongeveer 50% en pas de cirkelvormige polarisator aan om achtergrondgeluid te verminderen. Als u de computer wilt instellen voor gepolariseerd lichtmicroscopieonderzoek, start u de beeldsoftware en selecteert u Video, VideoBron en polarAIDE in het videomenu.

Schakel vervolgens over naar live video door naar de pagina Video te gaan en selecteer het pictogram om de as- en zona-analyse te activeren. Om de rijpheid van elke eicel te bepalen, breng je alle eicellen over in individuele druppels op de bereide glazen bodemschaal en plaats je de schotel onbedekt onder de bereide omgekeerde microscoop. Breng de eerste oocyte in beeld en observeer de gedetecteerde oocyte birefringence-afbeelding, omdat deze computer-verwerkt en in realtime op het computerscherm wordt weergegeven.

Gebruik de holding en sperma injectie naalden om de eicel te draaien, zodat het polaire lichaam is in de 12 uur positie en focus op het polaire lichaam. Als de spindelbiverweering op het eerste gezicht niet duidelijk zichtbaar is in de buurt van PB, raak dan de zona pellucida lichtjes aan en draai de eicel voorzichtig om elke as om de uitlijning van het gepolariseerde licht met de array spindelvezels te garanderen. Na het identificeren van alle spindel positieve eicellen, breng de eicellen in individuele druppels binnen de voorbereide ICSI schotel, en onderwerp de eicellen aan intracytoplasmatische sperma injectie volgens standaard protocollen.

Als de eicellen geen detecteerbaar metafase II spindelsignaal vertonen, plaatst u de gepolariseerde lichtmicroscoopschotel gedurende 2 tot 3 uur in de koolstofdioxide-onafhankelijke couveuse. Voordat het gepolariseerde lichtmicroscopieonderzoek opnieuw wordt gevormd, zoals aangetoond, na de injectie, breng je de eicellen over naar de bereide embryoteeltplaten voor hun cultuur totdat het blastocyststadium is bereikt. Zorg ervoor dat alle micromanipulatie van de menselijke oocyte wordt uitgevoerd in een controleomgeving, op 37 graden, in een optimale kweekmedium pH.

Spindle imaging maakt het mogelijk de discriminatie van volledig volwassen eicellen gearresteerd in de metafase II fase, van degenen die een belangrijke rijpingstransitie ondergaan. In ontwikkelings-vertraagde eicellen extruderende polaire lichamen in vitro, de afwezigheid van de metafase II spindel signaal kan niet noodzakelijkerwijs een cellulaire verstoring weerspiegelen, maar kan wijzen op de progressie van de eicel van de metafase I naar de metafase II stadium. De aanwezigheid van de meiotische as is een positieve marker van eieren ontwikkelingscompetentie.

Het uitstellen van ICSI biedt ontwikkelingsvertragende eicellen extra tijd om het rijpingsproces te voltooien en de metafase II-as te monteren vóór hun injectie. Met behulp van deze aanpak, zelfs onvolwassen eicellen die routinematig worden weggegooid kan klinisch worden gebruikt, en aanleiding geven tot succesvolle zwangerschappen.