Gerichte antilichamen blokkering door een Dual-functioneel conjugaat van antigene peptide en FC-III mimetics (DCAF)

Dit kan dienen om belangrijke vragen te beantwoorden over het synthetiseren van DCAF-moleculen met de beoogde antilichaamneutralisatie. Deze techniek biedt de eenvoudigste manier om de DCAF moleculen te synthetiseren met een hoge productiviteit. De wereld beslist DCAF moleculen hebben de potentiële interventies om het antilichaam in gaat over ziekten zoals de Knokkelkoorts en de myasthenie gravis.

Deze methode kan worden toegepast op andere DCAF moleculen met verschillende epitopen om de cognate antilichamen te richten. Het aantonen van de procedure zal Xue Bai zijn, een senior technicus van mijn laboratorium. Om 2-chloor hars om te zetten in hydrazine afgeleid 2-Chloor hars, vanaf de bovenkant van het peptide synthesevat, voeg vijf milliliter DMF aan de 0,25 millimol van 2-Chloor hars.

Zet de dop weer op, schud het vat voorzichtig gedurende 15 seconden, en vervolgens afvoer op een ijzeren standaard. Herhaal de DMF wassen nog twee keer. Voeg vervolgens vijf milliliter DCM toe aan het vat, zet de dop weer op, schud het vat voorzichtig gedurende 15 seconden en laat het vervolgens op een ijzeren standaard aftappen.

Herhaal de DCM wassen nog twee keer, en herhaal dan de DMF wassen nog drie keer. Voeg vervolgens zes milliliter van 50% volumeconcentratie van DMF toe over DCM om de hars 30 minuten op te zwellen en vervolgens af te voeren. Breng nu zes milliliter van 5% volumeconcentratie hydrazine en DMF over op het reactievat.

Plaats het op de shaker op 120 RPM en 30 graden Celsius gedurende 30 minuten, en vervolgens afvoer van de oplossing door vacuümpomp. Om de hydrazinerivaat van een Fc-III peptide te zuiveren, gebruikt u het HPLC-systeem om het peptide te zuiveren met een 30 minuten durende gradiëntingseution met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Na eiwitzuivering volgens het manuscript, voeg in een nieuwe buis twee milliliter van een milligram per milliliter SUMO gelabeld eiwit, een milliliter sumo protease, een milliliter van 10X SUMO protease buffer, en zes milliliter dubbel gedestilleerd water om de reactie oplossing voor te bereiden.

Incubeer het mengsel gedurende 12 tot 16 uur bij vier graden Celsius. Dan aliquot het mengsel in acht 1,5 milliliter Eppendorf buizen, en centrifugeren het mengsel op 15.000 keer G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Gebruik een pipet om de aggregaten te ontdoen aan de onderkant, dan in de 10 milliliter gewist supernatants, voeg 0,5 milliliter van de 50%nikkel NTA kraal drijfmest in 50 millimolar PBS.

Plaats de buis bij een roterende shaker op 200 RPM en vier graden Celsius om zachtjes te mengen gedurende 60 minuten. Laad vervolgens de lisade en het nikkel NTA mengsel in een kolom met de onderste uitlaat dop. Verwijder de onderste dop en sla de stroom door in een 15 milliliter centrifuge buis.

Het ZIJN TAG SUMO eiwit is bindend op de kolom. Het linkerantigeendeel, dat met CIS voor inheemse chemische ligatiereactie begint, is in de stroom door. Nu gewicht 1,8 milligram hydrazine derivaat van een Fc-III peptide in een twee milliliter Eppendorf buis en voeg 0,8 milliliter van zes molaire guanidiniumchloride in 0,2 molaire mononatrium fosfaat oplossing op pH 3.

Vortex om het poeder op te lossen. Na het centrifugeren van de buis op 7, 200 keer G gedurende een minuut bij kamertemperatuur breng de supernatant in een nieuwe buis. Voeg een roerstaaf in de buis en zet de buis in een ijszout bad op een magnetische roerder om zacht roeren de oplossing voor 15 minuten.

Voeg vervolgens 40 microliter natriumnitriet van 0,5 mol aan de oplossing toe om de hydrazinegroep te oxideren. Roer de oplossing voorzichtig nog 15 minuten in het ijszoutbad. Weeg 11 milligram hplc gezuiverd en gevriesdroogd linker antigeen deel, en 13,6 milligram MPAA in de reactiebuis in het ijszout bad.

Roer gedurende vijf minuten en pas vervolgens de pH-waarde aan op 6,8 tot 7,0 in de kamer gematigd met zes molaire natriumhydroxide. De meest kritieke stap voor inheemse chemische ligatie is om de pH-waarde zorgvuldig aan te passen om de ligatiereactie te initiëren. Voeg na 12 uur in het ijszoutbad 0,4 milliliter 0,1 molaire TCEP-neutrale oplossing toe aan het reactiesysteem en roer gedurende 20 minuten om de reactie te beëindigen.

Na centrifugatie en HPLC-zuivering, verkrijg de conjugaatpiek III voor desulfurisatie. Los het op in 50 microliter van zes molaire guanidiniumchloride in 0,2 molaire mononatriumfosfaatoplossing. Voeg vervolgens 50 microliter van één molaire TCEP, 10 microliter tert-Butylthiol en vijf microliter van 0,1 molaire VAO toe voor vier oplossingen.

Pas de uiteindelijke pH van de oplossing aan op 6,9 en houd de oplossing ongeveer vijf uur op 37 graden celsius op een shaker. Centrifugeren en weer zuiveren. Los het bereide peptide op in 200 microliter van 32 millimolar zilveracetaat en roer het reactiemengsel vervolgens vier uur op kamertemperatuur.

Om de zilvertholalaten op peptide om te zetten in vrije thiolen, voegt u drie microliters van één molaire DTT toe in zes molaire guanidiniumchloride en 0,2 molair mononatriumfosfaat bij pH 7. Bedien de massaspectrometer in de volledige scanmodus en stel het m/z-bereik in op 300 tot 2.000 en resolutie op 60.000. Open de massaspectragegevens en vind de pieken van het product in elke stap om te bevestigen dat de chemische reactie met succes wordt uitgevoerd.

Om elisa-test van de interactie tussen DCAF1 en 4G2-antilichaam uit te voeren, bedekt u elke put van een 96-bron microtiterplaat met één picomole anti-GST-antilichaam in 100 microliter coatingbuffer. Verzegel de plaat met afdichtingsbanden en broed het 's nachts op 4 graden celsius op een shaker. In het ochtendblok elk goed met 200 microliters van 1%BSA en PBS.

Verzegel de plaat en uitbroed het ruimte gematigd voor een uur op een shaker. Gebruik vervolgens PBS met 0,05%Tween 20 om elk goed vier keer te wassen. In dit protocol werd de inheemse chemische ligatiemethode gebruikt voor de semisynthese van het DCAF1 molecuul.

Het massaspectrum toont aan dat het uiteindelijke DCAF1 molecuul een deconvolutional moleculaire weging heeft van 11.053. Tijdens de ELISA-test remmen antigenpepte Fc-III en DCAF1 4G2-antilichaambinding concurrerend. Zowel antigenpepte als DCAF1 blokkeerden 4G2-binding aanzienlijk, terwijl het Fc-III peptiet geen invloed had op de antigenererende antilichaaminteractie.

Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor een interventie van schadelijke antilichaamgerelateerde ziekten. Lot's van de regio's die worden gebruikt voor peptide synthese en inheemse chemische ligatie zijn zeer giftig. Zorg ervoor dat deze experimenten te nemen in uw chemische kap.