Name: Elektroporation methode voor in vivo levering van plasmide DNA in de volwassen zebravis Telencephalon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Leer elektroporatie voor enkelcellabeling van ependymogliale cellen in de volwassen zebravis telencephalon. Deze methode maakt langdurige monitoring en manipulatie van signaalroutes mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Speciale dank aan James Copti voor het bewerken van het manuscript. We erkennen ook dankbaar financiering aan JN van de Duitse Research Foundation (DFG) door de SFB 870 en SPP "integratieve analyse van olfaction" en SPP 1738 "opkomende rollen van niet-coderende Rna's in de ontwikkeling van het zenuwstelsel, plasticiteit & ziekte", SPP1757 " Glial heterogeniteit "en Excellence strategie in het kader van de Munich cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Alle dieren die in dit protocol worden gebruikt, zijn onder standaardomstandigheden gehouden en experimenten zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen en voorschriften van de EU en de regering van Opper-Beieren (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. bereiding van het plasmide mengsel voor Elektroporation
<ol><li>Verdun de interesse van de plas smid in steriel water en voeg een snelle groene vlek voorraadoplossing [1 mg/mL] toe. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van het plasmide ∼ 1 μg/μL is. Voeg de vlek toe met een concentratie van niet meer dan 3%, omdat het enige doel is om de oplossing te kleuren en de ventriculaire injectie te visualiseren.</li>
	<li>Meng de plasmide oplossing eenmaal voorbereid door meerdere malen op en neer te pipetteren of door met de vingers te tikken. Bewaren bij kamertemperatuur (RT) tot gebruik. Opmerking: Voor co-elektroporation van twee plasmiden in dezelfde cel, zorg ervoor dat de concentratie van elk afzonderlijk plasmide in het mengsel ten minste 0,8 ng/μL met een molaire verhouding van 1:1 om te verkrijgen van 80% – 90% co-elektroporation efficiëntie.</li>
</ol>2. preparaten voor injectie en Elektroporation procedure
<ol><li>Bereid de glazen capillairen (buitendiameter 1 mm, binnendiameter 0,58 mm) noodzakelijk voor de injectie in de naald trekinrichting.</li>
	<li>Om de juiste hoeveelheid plasmide te injecteren (zie hierboven), trek het capillair bij een temperatuur van 68,5 ° c met twee lichte en twee zware gewichten (Zie tabel van materialen voortrekker specificaties). Opmerking: Als er een andere trekker wordt gebruikt, kalibreer dan het capillair om het juiste volume electroporatie mix te leveren.</li>
	<li>Stel het injectie apparaat handmatig in op een injectiedruk van 200 hPa (door de Pi-knop te draaien) en constante druk van 0 hPa. Stel de injectie tijd handmatig in op handmatige modus en bedien de druk met voetpedaal.</li>
	<li>Stel het elektroporation apparaat in op "LV mode" met vijf pulsen bij 54 – 57 V (25 MS elk met 1 s intervallen). Sluit de elektroden aan op het apparaat.</li>
	<li>Bereid een aquarium met schoon viswater, waar de vis zal worden gewekt van anesthesie na de elektroporation procedure. Beluate het water door de lucht steen vast te houden aan de luchtpomp voor de volledige herstelperiode totdat de vis volledig is ontwaakt.</li>
	<li>Neem een reguliere keuken spons en maak een longitudinale snede in de spons om vis in te houden tijdens de injectie en elektroporation procedure (zie vorige publicatie3). Opmerking: De keuken spons moet regelmatig worden gewassen of uitgewisseld om potentiële giftige chemicaliën te verwijderen.</li>
	<li>Plaats een kleine hoeveelheid zeer geleidende multifunctionele echografie gel naast de injectie en elektroporation Setup. Opmerking: Dit zorgt voor een adequate elektrische geleiding, en bijgevolg de distributie van elektroporated cellen in het gehele telencephalon.</li>
</ol>3. zebravis anesthesie
<ol><li>Voorafgaand aan de verdoving, bereid een stamoplossing van anesthesie met 0,2% MS222 in gedestilleerd water en pas de pH op 7 met tris-HCl-buffer. Verdun deze kolf 1:10 (d.w.z. tot 0,02% MS222) met behulp van viswater.</li>
	<li>Anesthetiseer de vis door ze in deze werkoplossing te houden totdat de beweging van het lichaam en de kieuwen verdwijnt (meestal voor een paar minuten).</li>
</ol>4. injectie met plasmide oplossing
<ol><li>Vul het voorbereide Glazen capillair met 10 μL plasmide oplossing met behulp van micro lader tips. Vermijd de vorming van luchtbellen in het capillair.</li>
	<li>Druk op menu/verander capillair op het injectie apparaat. Steek de naald in de naald houder en bevestig deze.</li>
	<li>Knip onder een stereomicroscoop met een vergroting van 3,2 x of 4x slechts de punt van het capillair met behulp van de fijne Tang. Schakel het injectie apparaat van de capillaire modus wijzigen in de Injecteer -modus, druk vervolgens op met een voetpedaal om ervoor te zorgen dat de plasmide oplossing gemakkelijk uit de naald en zonder belemmering loopt.</li>
	<li>Breng de vis van de veehouderij tank naar de container (plastic doos) met verdovings oplossing. Wacht een paar minuten totdat de beweging van de kieuwen afneemt.</li>
	<li>Plaats de vis in de voorbevoafde spons met de rugzijde naar boven gericht. Voer alle volgende injectie stappen uit onder de stereomicroscoop om de nauwkeurigheid van de procedure te garanderen.</li>
	<li>Met behulp van een ontleed micro-mes van roestvrijstaal met 40 mm snijkant en 0,5 mm dikte, maak een klein gaatje in de schedel van de vis aan de achterste kant van de telencephalon (Figuur 1b), net naast de grens met optiek Tectum. Opmerking: Deze stap moet zorgvuldig worden uitgevoerd, omdat het gat moet zeer klein en oppervlakkig, penetreren alleen de schedel, om te voorkomen dat hersenbeschadiging.</li>
	<li>Kantel de vis zo nodig en richt de punt van het Glazen capillair in de juiste hoek naar de schedel om de penetratie van de capillaire punt door het gat te vergemakkelijken.</li>
	<li>Steek de punt van het capillair voorzichtig door het gat in de schedel totdat het de telencephalic ventrikel bereikt (Zie Figuur 1b). Dit vereist penetratie via de dorsale Ependymale cellaag. Wees vooral voorzichtig om het capillair niet te diep in te steken om contact met het hersenweefsel te vermijden. Houd de capillaire precies tussen de hemisferen, blijven in de ventrikel net na het doorprikken van de dorsale Ependymale laag. Opmerking: Dit is een zeer delicate stap. Nauwkeurigheid van deze procedure is verbeterd met behulp van pigmentatie Mutant lijnen zoals Brassy24, waardoor een betere visualisatie van de glazen capillaire positie tijdens de injectie.</li>
	<li>Injecteer met de capillaire punt binnenkant van de ventrikel de plasmide oplossing door de druk met het voetpedaal ongeveer 10 sec., wat overeenkomt met ongeveer 1 μL plasmide oplossing. Opmerking: Bij het verwisselen van de naald puller, haarvaten of injector moet het systeem worden gekalibreerd om altijd 1 μL plasmide oplossing te leveren. De kalibratie kan worden uitgevoerd door de diameter van de plasmide druppel die wordt uitgezet in een minerale olie (bijv. paraffineolie) te meten en vervolgens het volume van de druppeltje te berekenen. Na 10 s van de injectie moet er ~ 1 μL plasmide vloeistof in de minerale olie worden uitgezet.</li>
	<li>Bevestig het succes van de vorige stap door de verspreiding van vloeistof in het ventrikel te observeren.</li>
</ol>5. elektroporation
<ol><li>Verwijder de vis uit de injectie opstelling terwijl u hem nog in de spons houdt.</li>
	<li>Dompel de binnenste kant van de punt van de elektroden in de ultrageluid gel.</li>
	<li>Bedek de vistelencephalon met een kleine hoeveelheid ultrasone gel.</li>
	<li>Positioneer de viskop tussen de elektroden, plaats de positieve elektrode aan de ventrale kant van het hoofd van de vis en de negatieve elektrode aan de rugzijde (figuur 1c), terwijl het lichaam van de vis nog steeds in de spons wordt gehouden. Hiermee wordt de richting van de stroom van de stroom die nodig is om te elektroporeren ependymoglia gepositioneerd in de subventriculaire zone.</li>
	<li>Druk de elektroden zachtjes en precies tegen de telencephalon (afbeelding 1c). De stroom met het voetpedaal toedienen. Houd de elektroden op zijn plaats totdat alle vijf pulsen zijn voltooid.</li>
</ol>6. herstel van de vis
<ol><li>Laat de vis in de eerder voorbereide, continu belualde tank herstellen totdat deze wakker wordt. Lidocaïne gel kan worden aangebracht op de schedel om eventueel ontwikkelde pijn te verlichten.</li>
</ol>

<ol><li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+Series+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li>
<li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon%3A+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li>
<li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li>
<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li>
<li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li>
<li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li>
<li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li>
<li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li>
<li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li>
<li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmetal+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li>
<li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li>
<li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586(2014).</li>
<li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle%3A+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li>
<li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+%28HSV-1%29+and+electroporation%3A+methods+and+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li>
<li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells%3A+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li>
<li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li>
<li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li>
<li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015(2018).</li>
<li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarbosa%2C+JS+%22In+vivo+single+cell+analysis+reveals+distinct+behavior+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+homeostasis+and+regeneration+in+the+adult+brain%22">In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain</a>. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).</li>
<li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li>
<li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li>
<li>Chapouton, P., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChapouton%2C+P+%22Neurogenesis.+Chapter+IV+in+The+Zebrafish%3A+Cellular+and+Developmental+Biology%2C+Part+A+Developmental+Biology%22">Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology</a>. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).</li>
<li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dit electroporatie protocol is een betrouwbare in vivo methode voor het labelen van individuele ependymoglial cellen. Het protocol moet mogelijk een verdere aanpassing voor het labelen van andere celtypen zoals neuronen of oligodendrocyten. Om tot een succesvolle etikettering te komen, kunnen plasmiden met verschillende promotors worden gebruikt. De promotor van Chicken-Beta actine, eF1alpha, CMV en ubiquitine zijn eerder gebruikt om de expressie van verschillende transgenen in ependymoglia en hun nakomelingen<sup class=...

Zebravis zijn uitstekende diermodellen om hersen regeneratie na een steekwond letsel te onderzoeken. In vergelijking met zoogdieren, op de evolutionaire ladder, minder geëvolueerde soorten zoals zebravis in het algemeen vertonen hogere tarieven van constitutieve neurogenese en bredere gebieden van volwassen neurale stamcellen residentie, wat leidt tot constante generatie van nieuwe neuronen in de hele de meeste hersengebieden in het volwassen leven. Deze functie lijkt te correleren met significant hogere regeneratieve capaciteit van zebravis in vergelijking met zoogdieren1, als zebravis hebben opmerkelijk potentieel om efficiënt te genereren nieuwe neuronen in de meeste hersenen letsel modellen bestudeerd2, 3,4,5,6,7,8. Hier wordt de zebravis telencephalon bestudeerd, omdat het een hersengebied is met prominente neurogenese in volwassenheid. Deze zones van volwassen neurogenese zijn homologe aan neurogene zones in de volwassen zoogdieren hersenen9,10,11.
Overvloedige neurogene gebieden in de zebravis telencephalon zijn aanwezig vanwege het bestaan van radiale glia zoals cellen of ependymoglia-cellen. Ependymoglial cellen fungeren als Resident volwassen neurale stamcellen en zijn verantwoordelijk voor het genereren van nieuwe neuronen in zowel de intact en regenereert hersenen3,5. Lineage tracing experimenten hebben aangetoond dat ventriculaire ependymoglia reageren op letsel, dan prolifereren en genereren van nieuwe neuroblasten die migreren naar de laesie site5. Door de gemuteerde aard van zebravis telencephalon lijnen de ependymogliale cellen het ventriculaire oppervlak en bouwen de ventrale ventriculaire wand. De dorsale ventriculaire wand wordt gevormd door een dorsale Ependymale cellaag (Figuur 1a). Belangrijker is dat zebravis ependymoglia de kenmerken van zowel de zoogdier radiaal glia als de Ependymale cellen belichaam. Lange radiale processen zijn een typisch kenmerk van radiale glia-cellen, terwijl cellulaire extensies en nauwe kruisingen (evenals hun ventriculaire posities) typische kenmerken zijn van Ependymale cellen12,13,14. Daarom worden deze cellen ependymoglial cellen genoemd.
Om in vivo gedrag van enkelvoudige ependymoglial cellen tijdens regeneratie te volgen, moeten ze op betrouwbare wijze worden gelabeld. Verschillende methoden van in vivo cellabeling voor fluorescerende microscopie zijn eerder beschreven, zoals endogene verslaggevers of lipofiele kleurstoffen15. Deze methoden, in tegenstelling tot elektroporation, kan vereisen langere tijd en vaak bieden niet de mogelijkheid van één cel labeling of permanente lange termijn tracering. Elektroporation, echter (naast het labelen van één cel), biedt de mogelijkheid om nieuw DNA in de host-cel te introduceren. Bovendien, in vergelijking met andere methoden van DNA-overdracht in de cellen, is elektroporation aangetoond dat het een van de meest efficiënte methoden16,17,18,19is.
Hier gepresenteerd is een electroporatie protocol dat is verfijnd met het oog op het labelen van enkele ependymoglial cellen in de volwassen zebravis telencephalon. Dit protocol voorziet in de etikettering van enkelvoudige ependymoglial cellen om ze gedurende een lange periode van20 te kunnen volgen of om specifieke trajecten op autonome wijze te manipuleren21,22.

<table><tbody><tr><td>Reagens/Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>Voor het kleuren van plasmide oplossing</td></tr><tr><td>MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>MS222 moet worden bewaard bij RT (maximaal twee weken) en beschermd worden tegen licht</td></tr><tr><td>Ultrasound gel</td><td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td><td>15-60</td><td>Elektrode Gel</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luchtpomp</td><td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td><td></td><td>Kan worden gekocht in de dierenwinkels</td></tr><tr><td>BTX Tweezertrodes Electrodes</td><td>Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0486</td><td>1 mm diameter</td></tr><tr><td>Electroporatie apparaat</td><td>BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0662</td><td></td></tr><tr><td>Injectieapparaat</td><td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td><td>5252000013</td><td></td></tr><tr><td>Standaard Wand Borosilicaat Glas Capillaire</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0766</td><td>Model Nr: G100-4</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micro-mes</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Joystick micromanipulator</td><td>Narishige Japan</td><td>MN - 151</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhouder</td><td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Naaldhouder wordt geleverd samen met het injectieapparaat</td></tr><tr><td>Naaldtrekhaalapparaat</td><td>Narishige Japan</td><td>Model Nr: PC-10</td><td>De PC-10 is stopgezet door Narishige in 2017 en vervangen door de PC-100</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>633161</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroporation methode voor in vivo levering van plasmide dna in de volwassen zebravis telencephalon

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Elektroporation is een transfectie methode waarbij een elektrisch veld wordt toegepast op cellen om tijdelijke poriën in een celmembraan te creëren en de permeabiliteit ervan te vergroten, waardoor verschillende moleculen in de cel kunnen worden geïntroduceerd. In dit document wordt elektroporation gebruikt voor het introduceren van plasmiden aan ependymoglial cellen, die de ventriculaire zone van de volwassen zebravis telencephalon lijn. Een fractie van deze cellen toont stamcel eigenschappen en genereert nieuwe neuronen in de hersenen van de zebravis; Daarom is het bestuderen van hun gedrag essentieel om hun rol in neurogenese en regeneratie te bepalen. De introductie van plasmiden via electroporatie maakt lange termijn labeling en tracking van een enkele ependymoglial cel mogelijk. Bovendien kunnen plasmiden zoals CRE of of Cas9 worden geleverd aan enkelvoudige ependymoglial cellen, die genrecombinatie of genbewerking mogelijk maken en een unieke kans bieden om de autonome genfunctie van de cel te beoordelen in een gecontroleerde, natuurlijke Milieu. Ten slotte wordt dit gedetailleerde, stapsgewijze electroporatie protocol gebruikt om een succesvolle introductie van plasmiden tot een groot aantal enkelvoudige ependymoglial cellen te verkrijgen.

De beschreven elektroporation methode maakt de levering van plasmide DNA in ependymoglial cellen, die zich oppervlakkig bevinden in de zebravis telencephalon en net onder de dorsale Ependymale cellaag (Figuur 1a).
Als het resultaat van de elektroporation positief is, kan het label enkelvoudige ependymoglial cellen (rode cellen in Figuur 2a, b) worden waargenomen onder andere ependym...

Hier is een elektroporation methode voor plasmide DNA levering en ependymoglial cellabeling in de volwassen zebravis telencephalon. Dit protocol is een snelle en efficiënte methode om individuele ependymoglial cellen te visualiseren en te traceren en opent nieuwe mogelijkheden om elektroporation toe te passen op een breed scala aan genetische manipulaties.

Elektroporation methode voor in vivo levering van plasmide DNA in de volwassen zebravis Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Dit protocol maakt het mogelijk om individuele ependymoglialcellen in de zebravistelencephalon te labelen om hun langdurige monitoring mogelijk te maken, evenals de manipulatie van specifieke paden op een cel-autonome manier. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het één cellabeling op een snelle en efficiënte manier mogelijk maakt, evenals genbewerkings- en signaleringstrajectmanipulatie op cel-autonome wijze. Deze methode maakt het mogelijk het onderzoeken van fundamentele celbiologie vragen, bijvoorbeeld over celdelaminatie, het behoud van epitheel homeostase, en de symmetrie van celdeling.Begin met het gebruik van een naald-pulling apparaat om glazen haarvaten te bereiden. Gebruik microloadertips om een voorbereide glazen capillair te vullen met tien microliter plasmideoplossing. Druk vervolgens op het menu verander capillaire "op de injectie-apparaat om de naald te worden geladen in de naaldhouder.Schakel vervolgens het injectieapparaat van verandering capillair naar inject-modus. Vervolgens, met behulp van een stereomicroscoop met een vier keer vergroting, en Finden tangen, snijd alleen het puntje van de capillaire. Druk vervolgens op het voetpedaal om te bevestigen dat de plasmideoplossingen zonder belemmering gemakkelijk uit de naald lopen.Wanneer de naald klaar is, breng een zebravis van de veehouder tank naar een container met verdovingsoplossing. En wacht een paar minuten tot de beweging van de kieuwen afneemt. Druk de verdoofde vis rugzijde omhoog op een voorbestempelde spons onder de stereomicroscoop, en gebruik een roestvrij stalen ontleedmicromes met een 40 millimeter snijkant en een 0,5 millimeter dikte om voorzichtig een klein gat in de visschedel aan de achterzijde van de telencephalon, net naast de rand van het optische tectum.Kantel de vis indien nodig en oriënteer de punt van de glazen capillaire naar de schedel in de juiste hoek om de penetratie van de capillaire tip door het gat te vergemakkelijken. Steek vervolgens heel voorzichtig de punt van het capillair in het gat door de rug ependymale cellaag, totdat het de telencephalische ventrikel bereikt en druk uitoefent op het voetpedaal gedurende ongeveer 10 seconden om ongeveer 1 microliter van de plasmide oplossing te leveren. Het succes van de levering kan worden bevestigd door het observeren van de verspreiding van de groene vloeistof in de ventrikel.Bedek de vistelencephalon met een kleine hoeveelheid ultrasone gel. Voor elektroporatie van het plasmide geïnjecteerde dier, verwijder de spons uit de injectie set-up en dompel de binnenkant van de elektrotips in ultrasone gel. Plaats de viskop tussen de elektroden, met de positieve elektrode aan de ventrale kant van het hoofd en de negatieve elektrode aan de rugzijde.Druk vervolgens, terwijl u nog steeds het lichaam van de vis in de spons houdt, de elektroden voorzichtig en precies tegen de telencephalon en beheer de stroom met het voetpedaal, waarbij de elektroden op hun plaats blijven totdat alle vijf de pulsen klaar zijn. Als de elektroporatie succesvol is, kan plasmid gelabeld enkele ependymoglial cellen worden waargenomen onder de niet-plasmide gelabeld ependymoglial cellen. Afhankelijk van de efficiëntie van het elektroporatieproces kan een hoger of lager aantal ependymoglial cellen worden gelabeld.Niettemin levert het aangetoonde protocol een hoger aantal gelabelde cellen op dan eerder gepubliceerde protocollen. Merk op dat de hoogste dichtheid van gelabelde cellen de neiging om meestal te voorschijn komen aan de binnenste ventriculaire kant van beide hemisferen als gevolg van de manier waarop de geïnjecteerde plasmide vloeistof zich verdeelt tussen de hemisferen. In deze video wordt een halfrond van de zebravis telencephalon gepresenteerd in 3D, waar de ependymoglial cellen met radio-processen, zijn in magenta wanneer waargenomen vanaf de zijkant.Door co-elektroporatie met een ander plasmid dat kernen labelt, kan celdeling van ependymoglial cellen worden waargenomen. Mislukte elektroporatie resulteert in een zeer laag aantal of geen gelabelde ependymoglial cellen. Dorsale ependymale cellen, echter, zijn het meest waarschijnlijk worden gelabeld.Hun soma is groter in cuboid en zij bezitten geen radio-langwerpige processen zoals duidelijk van een zijaanzicht van de ependymoglial cellaag. tdTomato-mem gelabelde cellen zijn waarschijnlijk ependymale cellen, die zich boven de laag van ependymoglia bevinden. De introductie van een tdTomato-mem die plasmid uitdrukt op individuele ependmyoglial cellen resulteert daarentegen in tdTomato-mem-expressie naast de initiële celetikettering.De belangrijkste dingen om te onthouden zijn om alleen de punt van de capillaire snijden en om de ependymale laag te penetreren tijdens het injecteren, zodat de vloeistof verspreidt zich door de ventrikel. Deze techniek maakt het mogelijk om op lange termijn enkele ependymoglial cellen te monitoren door middel van in vivo beeldvorming, en dus hun rol in de regeneratie van de hersenen en hun enorme in vivo genetische link vast te stellen.

electroporation-method-for-vivo-delivery-plasmid-dna-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

De temporele en ruimtelijke resolutie van de genetische manipulaties bepaalt het spectrum van biologische fenomenen die ze kunnen verstoren. Hier gebruiken we tijdelijk en ruimtelijk...

Targeting bulbus olfactorius Neuronen gebruik van Gecombineerd In Vivo Elektroporatie en Gal4-Based Enhancer Trap zebravis Lines

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

We beschrijven een methode om de expressie van een doeleiwit voorwaardelijk knockdown op volwassen zebravissen fin regeneratie. Deze techniek micro-injectie en electroporating antisense oligonucleotide morpholinos in fin weefsel, zodat het testen van het eiwit rol in verschillende stadia van fin regeneratie onder wondgenezing blastema vorming en regeneratieve uitgroei.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in het regenereren van Adult Zebravissen Tail Fin

Deze video beschrijft in vivo elektroporatie, een techniek voor DNA-afgifte in ependymogliale cellen bij volwassen zebravissen.

In Vivo Elektroporatie: een sitespecifieke methode om zebravissen te transfecteren

Deze video beschrijft de techniek van intramusculaire injectie voor het leveren van verbindingen in de rugspieren van een volwassen zebravis.

Intramusculaire (IM) injectie: samengestelde toediening in de dorsale spier van een volwassen zebravis

In dit artikel tonen we een werkwijze voor het manipuleren van genexpressie in het ventriculaire cellen van het volwassen zebravissen telencephalon met morfolino antisense oligonucleotiden. Wij stellen deze werkwijze efficiënt en snel protocol dat kan worden gebruikt voor functionele studies in de volwassen gewervelde hersenen.

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Om licht te werpen op de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurogenese en regeneratie bij volwassen zebravissen, ontwikkelden we een protocol voor invasieve chirurgie dat mechanische verwondingen veroorzaakt in het volwassen telencephalon van de zebravis en daaropvolgend bewaken van veranderingen in de 'gestoken' hemisfeer door middel van immunohistochemie of in situ hybridisatie.

Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration

Presenteren we een efficiënt en gemakkelijk te gebruiken protocol voor het voorbereiden van primaire celculturen van zebravis embryo's voor transfectie en levende cel imaging, evenals een protocol bij het bereiden van primaire cellen van volwassen zebrafish hersenen.

Cultuur en de transfectie van zebravis primaire cellen

Hier beschrijven we een protocol voor de immunisatie van de volwassen zebravissen (Danio rerio) met een op basis van DNA vaccin en de validatie van een succesvolle vaccinatie evenement aan te tonen. Deze methode is geschikt voor de preklinische screening van vaccin kandidaten in verschillende modellen van de infectie.

Immunisatie van volwassen Zebrafish voor de preklinische Screening van DNA-gebaseerde vaccins

Een nieuwe intraperitoneale (IP) injectiemethode bij volwassen zebravissen wordt beschreven. Bij het hanteren van giftige stoffen zoals doxorubicine is deze procedure effectiever dan de twee eerder gerapporteerde IP-methoden. De techniek is zo ontworpen dat het gemakkelijk kan worden toegepast door onderzoekers met beperkte ervaring in het zebravismodel.

Een intraperitoneale injectietechniek bij volwassen zebravissen die lichaamsschade en bijbehorende sterfte minimaliseert

Leer elektroporatie voor enkelcellabeling van ependymogliale cellen in de volwassen zebravis telencephalon. Deze methode maakt langdurige monitoring en manipulatie van signaalroutes mogelijk.

Elektroporation methode voor in vivo levering van plasmide DNA in de volwassen zebravis Telencephalon

Meer video's verkennen