Name: Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Leer een beenmergtransplantatieprotocol om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect te onderzoeken. Deze methode is aanpasbaar voor andere immuuncellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie wordt ondersteund door de Universiteit van Central Florida College of Medicine start-up subsidie (aan HN), de Universiteit van Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center start-up subsidie (hl), de Verenigde Staten NIH Grant #1P20CA210300-01 en Vietnamese Ministerie van Gezondheid Grant #4694 / QD-BYT (naar PTH). Wij danken Dr Xue-zhong Yu aan de Medische Universiteit van South Carolina voor het verstrekken van materialen voor de studie.

De experimentele procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Central Florida.
1. GVHD-inductie
OPMERKING: Allogene beenmerg (BM) celtransplantatie (stap 1.2) wordt uitgevoerd binnen 24 uur na bestraling. Alle onderstaande procedures worden uitgevoerd in een steriele omgeving. Voer de procedure uit in een weefselkweekkap en gebruik gefilterde reagentia.
<ol><li>Dag 0: Bereid de ontvangende muizen voor.<ol>
<li>Gebruik vrouwelijke wilde typemuizen (WT) op een BALB/c achtergrond (CD45.2+ H2kd+),10−12 weken oud als ontvangers.</li>
		<li>Ear-tag en weeg de ontvangers vóór TBI. Plaats vervolgens maximaal 11 muizen in de bestralingskamer en bewaar het in de bestralings. Bestraal bij een enkele dosis van 700 cGy gedurende 10−15 min.</li>
		<li>Breng bestraalde dieren terug naar de kooien en huisvest ze vóór de transplantatie in pathogene-vrije faciliteiten. OPMERKING: Het minimale lichaamsgewicht van de ontvangers moet rond de 20 g liggen. Gebruik dit gewicht als referentie om het gewichtsverlies tijdens de experimentele periode te berekenen.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 1: Bereid T-cel uitgeput beenmerg (TCD-BM) van de donormuizen.<ol>
<li>Euthanaseer CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 muizen door CO2 verstikking en wacht 2−3 min tot ze bewusteloos zijn. Voer indien nodig cervicale dislocatie uit als secundaire euthanasie.</li>
		<li>Leg elke muis op een schone werkplaat. Ontsmet de vacht en de huid met 70% isopropanol.</li>
		<li>Verzamel het scheenbeen en dijbeen van beide benen met behulp van tangen en scharen. Zet ze in ijskoude RPMI met 1% FCS en 100 U/mL penicilline/streptomycine en 2 mM L-glutamine (1% RPMI) in conische buizen van 50 mL. Reinig het dijbeen en het scheenbeen botten grondig door het verwijderen van alle spierweefsels met behulp van tangen en schaar. Breng het dijbeen en het scheenbeen van de conische buizen van 50 mL over naar een petrischaal met een diameter van 92 mm met 1% RPMI.</li>
		<li>Snijd met behulp van een schaar de uiteinden van het dijbeen of scheenbeen. Vul een 50 mL buis met 25 mL van 1% RPMI 1640 medium. Gebruik dit om een 3 mL spuit te vullen die aan een 26 G naald met 3 mL van 1% RPMI is bevestigd. Steek deze spuit in het bot en duw de zuiger om het beenmerg (BM) uit de holte in de opvangbuis te spoelen met 1% RPMI (~ 3 mL/bone).</li>
		<li>Herhaal stap 1.2.4 voor alle resterende scheenbeen- en dijbeenbotten van andere donormuizen. Houd alle inzamelbuizen op ijs.</li>
		<li>Maak de eencellige suspensie door de stukjes beenmerg door een mesh-strainer van 75 μm te spoelen. Verzamel de eencellige suspensie in een buis van 50 mL.</li>
		<li>Centrifugebuizen bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Aanzuigen en gooi de supernatant. De pellet opnieuw opschorten in PBS-buffer met 0,5% runderserumalbumine (BSA) bij 20 x 106 cellen/mL. Sla een aliquot van 2 x 106 cellen voor zuiverheid vlekken.</li>
		<li>Voeg Thy 1-antilichaam toe bij 0,05 μg/106 cellen14 en uitbroed gedurende 30 min bij 4 °C. Was één keer met 25 mL ijskoude PBS. Resuspend op 20 x 106/mL in 0,5% BSA/10% young rabbit complement/2% DNase (10.000 U/mL in steriele H2O). Incubeer gedurende 45 min bij 37 °C en was 2x als voorheen. OPMERKING: T-cellen zijn uitgeput met behulp van een mAb specifiek voor Thy1, een eiwit uitgedrukt door alle T-cellen, maar niet andere leukocyten.</li>
		<li>De cellen opnieuw opschorten in 20 mL PBS-buffer met 0,5% BSA. Tel de beenmergcellen in 1% azijnzuur met behulp van een hemocytometer. Houd een aliquot van 2 x 106 cellen voor een zuiverheidscontrole door stroomcytometrie na celzuivering. LET OP: Een donormuis genereert normaal gesproken ongeveer 25 x 106 TCD-BM.</li>
		<li>Gebruik flow cytometrie om een succesvolle T-cel uitputting te bevestigen. Vlek 1 x 106 cellen, bewaard gebleven uit de stappen 1.2.7 (vóór T-celuitputting) en 1.2.9 (TCD-BM na T-celuitputting) met de volgende antilichamen: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) en α-CD8α (53-6.7).</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 1: T-cellen voorbereiden op de donormuizen<ol>
<li>Gebruik CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 wild type (WT) muizen als donor voor T-cellen.</li>
		<li>Euthanaseer C57BL/6 muizen door koolstofdioxide (CO2)verstikking zoals beschreven in punt 1.2.1.</li>
		<li>Reinig de vacht en huid van de muis grondig met 70% ethanol. Accijnzen en lymfeklieren en scheiden ze in een eencellige suspensie van splenocyten met behulp van een spuitzuiger en 40 μm mesh strainers. Was de zeef en spuitzuiger met 1% RPMI (1% FBS met RPMI media) om alle splenocyten te verzamelen.</li>
		<li>Centrifugeer de celvering op 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Voeg 5 mL ACK lysing buffer (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) toe na het weggooien van de supernatant. Incubeer de celvering gedurende 5 min bij kamertemperatuur. LET OP: ACK lysis buffer wordt gebruikt voor lysing rode bloedcellen.</li>
		<li>Voeg 5 mL van 1% RPMI toe om lysis te stoppen. Centrifugebij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Bereid een ice-cold magnetic-activated cell sorting (MACS) buffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH 7.2). Ontgassen de buffer voor gebruik. Breter de celpellets opnieuw in 5 mL MACS-buffer.</li>
		<li>Tel de splenocyten en controleer op de levende en dode cellen met behulp van een hemocytometer en 1% trypan blauw. Sla een aliquot van 2 x 106 cellen op om de zuiveringsopbrengst te evalueren met stroomcytometrieanalyse.</li>
		<li>Resuspend de splenocyten bij de concentratie van 200 x 106/mL in MACS buffer. Voeg 0,03 μL biotine anti-muis-Ter-119, 0,03 μL biotine anti-muis-CD11b, 0,03 μL biotine anti-muis-CD45R en 0,03 μL biotine anti-muis-DX5 per 106 cellen toe. Incubeer gedurende 15 min bij 4 °C. OPMERKING: Biotine anti-muis-Ter-119, biotine anti-muis-CD11b, biotine anti-muis-CD45R en biotine anti-muis-DX5 werden gebruikt om te reageren met respectievelijk erythroid, granulocyten, B-cellen en NK-cellen. Daarom zijn deze celsubsets uitgeput in volgende stap15.</li>
		<li>Voeg 10 mL ijskoude MACS-buffer toe aan de celvering. Centrifugebij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.</li>
		<li>De celpellets in de MACS-buffer opnieuw opschorten bij6een concentratie van 100 x 10 6/mL. Voeg antibiotine microbeads (0,22 μL/106 cellen) toe aan de splenocytesssus. Meng goed en incubeer voor nog eens 15 min bij 4 °C. Was de celvering eenmaal met 10 mL ijskoude MACS-buffer. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C en gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Zet een magnetische scheidingskolom in het magnetisch veld. Spoel de kolom af met een MACS-buffer van 3 mL. Laat de celvering op de kolom vallen. Verzamel de doorstroom bestaande uit ongebonden, verrijkte T-cellen, in een nieuwe conische buis van 15 mL. Was de MS-kolom met 3 mL ijskoude MACS-buffer. OPMERKING: Zorg ervoor dat de kolom leeg is voordat u de waspassen uitvoert.</li>
		<li>Centrifugeer de celvering op 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Breter de celpellet opnieuw in 5 mL MACS-buffer.</li>
		<li>Tel de cellen in 1% trypan blauw met behulp van een hemocytometer. Sla een aliquot van 2 x 106 cellen voor een zuiverheid smet per stroom cytometrie. OPMERKING: De gemiddelde opbrengst van milt-T-cellen geïsoleerd door deze methode is ~ 20−25 x 106 cellen per muis.</li>
		<li>Bevestig de opbrengst van T-celverrijking door stroomcytometrie. Vlek 1 x 106 cellen, bewaard gebleven uit de stappen 1.3.7 (vóór T-celuitputting) en 1.3.13 (TCD-BM na T-celuitputting), met de volgende antilichamen: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) en α-CD8α (53-6.7).</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 1: Injecteer bestraalde muizen met donor T-cellen en TCD-BM.<ol>
<li>Was de TCD-BM en T-cellen 2x met PBS (800 x g voor 5 min bij 4 °C). Schorsde de cellen in ijskoude PBS voor injectie. Pas de celconcentratie aan op620 x 10 6/mL voor TCD BM en 4 x 106/mLvoor T-cellen.</li>
		<li>Verwarm het dier met behulp van een verwarmingslamp om de zichtbaarheid van de bilaterale staartaderen te vergroten. Plaats de muis indien nodig in een restrainer.</li>
		<li>Reinig het oppervlak van de staart met 70% isopropanol. Injecteer TCD-BM (5 x 106 cellen/muis) met of zonder T-cellen (0,75 x 106 cellen/muis). Zorg ervoor dat er geen lucht in de spuit wordt gebracht.</li>
		<li>Verwijder de naald en breng een antiseptisch wattenstaafje rechtstreeks op de injectieplaats 5−10 s om het bloeden te stoppen.</li>
	</ol></li>
	<li>Beoordeel GVHD op dag 2−80.<ol>
<li>Blijf op de hoogte van het overleven van het dier. Controleer de klinische symptomen van GVHD aangepast van het scoresysteem dat eerder door Cook et al.16 en het lichaamsgewicht van de ontvangende muizen 2x per week is vastgesteld. Gebruik het lichaamsgewicht bepaald voorafgaand aan de TBI om het gewichtsverlies te berekenen.</li>
		<li>Weeg elke muis afzonderlijk. Scoor het gewichtsverlies als volgt: graad 0 = minder dan 10%; graad 1 = 10%−20%; graad 2 = meer dan 20%.</li>
		<li>Scoor het houdingsteken van de ontvangers: graad 0 = geen voorgevoel; graad 0,5 = lichte voorgevoel, maar rechtmaakt tijdens het lopen; graad 1 = dier blijft gebogen tijdens het lopen; graad 1.5 = het dier wordt niet rechtgetrokken; graad 2.0 = dierenstandaard op achterste tenen.</li>
		<li>Scoor het mobiliteitsteken van de ontvangers: graad 0 = zeer actief; graad 0,5 = langzamer dan naïeve muizen; graad 1.0 = beweegt alleen wanneer gepord; graad 1.5 = beweegt lichtjes wanneer gepord; graad 2.0 = beweegt niet wanneer gepord.</li>
		<li>Scoor de huid van de ontvangers: graad 0 = geen schaafwonden, laesies of schaling; graad 0,5 = roodheid in één specifiek gebied; graad 1 = slijtage in één gebied of lichte slijtage in twee gebieden; graad 1.5 = ernstige schaafwonden op twee of meer gebieden; graad 2.0 = ernstige schaafwonden, krakende huid, gedroogd bloed.</li>
		<li>Scoor de vacht van de ontvangers: graad 0 = geen abnormale tekenen; graad 0,5 = ridging aan de zijkant van buik of nek, rang 1.0 = ridging over of de zijkant van buik en nek; graad 1.5 = onverzorgd gematteerd en gegolfd bont; graad 2.0 = slecht gematteerd bont op buik en rug.</li>
		<li>Scoor de diarree van de ontvangers: graad 0 = geen diarree; graad 0,5 = lichte en zachte ontlasting; graad 1.0 = mild (gele ontlasting); graad 1,5 = matig (gele ontlasting met een beetje bloed); graad 2 = ernstig (lichtgele en bloederige ontlasting, "gedroogde cake ontlasting" verschijnen op het anale gebied).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cotransplantatie Model
<ol><li>Genereer door beenmerg afkomstige dendritische cellen (BM-DC's).<ol>
<li>Oleer beenmerg van de femurs en tibias van WT of factor B (fB)-/- muizen op de B6-achtergrond zoals beschreven in de stappen 1.2.3−1.2.4. Draai de cellen op 800 x g voor 5 min.</li>
		<li>Resuspend de pellet in 5 mL van ACK lysing buffer voor rode bloedcel lyse. Incubeer de celvering voor 5 min op ijs. Voeg 10 mL rpmi toe aan de celvering om de lyse en centrifuge op 800 x g voor 5 min bij 4 °C te stoppen. Gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Resuspend de celpellets in 10 mL kweekmedia (RPMI 1460 met 10% FBS, 100 U/mL penicilline/streptomycine, 2 mM l-glutamine en 50 mM β-mercaptoethanol) en pas het volume aan om aan de eindconcentratie van 2 x 106 cellen/mL te voldoen.</li>
		<li>Voeg 20 ng/mL granulocyte-macrofaagkoloniestimulerende factor (GM-CSF) toe aan de celvering. Kweek de beenmergcellen in 100 x 15 mm Petrischalen bij 37 °C in 5% CO2 gedurende 6 dagen.</li>
		<li>Vervang de helft van de lopende cultuurmedia (ongeveer 5 mL) door verse media die 40 ng/mL GM-CSF bevatten op dag 3.</li>
		<li>Verwarm de kweekmedia voor in een waterbad bij 37 °C. Verzamel ongeveer 5 mL van de media uit de beenmergkweekgerechten. Centrifugebij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg. Resuspend de cel pellet in 5 mL cultuur media met 40 ng / mL GM-CSF.</li>
		<li>Voeg 25 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) toe aan de media op dag 6 van de cultuur om de BM-DC's te rijpen. Sla een aliquot van 2 x 106 cellen op om de dc-differentiatiewerkzaamheid per flow cytometrie te bepalen.</li>
		<li>Verzamel gerijpte BM-DC's: Gebruik cellifters om dc's zacht uit de petrischaaltjes te schrapen. Verzamel alle celveringen in conische buizen van 50 mL. Centrifuge bij 800 x g, gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg. Was de celpellets 3x met 50 mL ijskoude PBS. Bespaar ongeveer 2 x 106 BM-DC's voor immunologische fenotypeanalyse door stroomcytometrie.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer dendritische celcotransplantatie uit van BMT (DC-cotransplanting BMT). OPMERKING: Gebruik FVB (H2kq)muizen als donoren voor T-cellen en BM-cellen. Bestraal B6 Ly5.1 ontvanger muizen bij een dosis van 1.100 cGy (2 doses, 3 h interval). Zie details in stap 1.1.<ol>
<li>Isoleer BM van femurs en tibias van de FVB donormuizen. Zie details in de stappen 1.2.3−1.2.10. OPMERKING: Gebruik totaal geïsoleerd beenmerg in plaats van TCD-BM in dit model.</li>
		<li>Zuiver T-cellen uit de milt en lymfeklieren van de FVB donormuizen. Zie details in de stappen 1.3.1-1.3.13.</li>
		<li>Injecteer BM (5 x 106/mouse), T-cellen (0,5 x 106/muis) met BM-DC's (2 x 106/muis) op dag 0 van de experimentele cursus.</li>
		<li>Op dag 3 na de transplantatie, onderzoeken van de donor DC reconstitutie door flow cytometrie.<ol>
<li>Verzamel bloed uit de ogen van de ontvangers.</li>
			<li>Verdoven de CD45.1/Ly5.1 B6 muizen met 3% isoflurane inademing. Controleer op de diepte van anesthesie door het gebrek aan reactie op een teen knijpen.</li>
			<li>Plaats een steriele glazen pipetbuis in de mediale canthus van het oog dat caudally gericht is in een hoek van 30−45° vanuit het vlak van de neus. Druk uitoefenen terwijl u de buis zachtjes draait.</li>
			<li>Laat het bloed in een 10 μL heparine-bevattende steriele 1,5 mL microcentrifuge buizen. Breng 50 μL bloed over in 5 mL glazen stroombuizen.</li>
			<li>Voeg 2 mL ACK lysing buffer toe. Incubeer bij 37 °C in het waterbad gedurende 45 min. Voeg 2 mL FACS kleuringsbuffer toe. Centrifugebij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.</li>
			<li>Schorsde de celpellets met 200 μL FACS-buffer met de juiste stroomvlekkende antilichamen (levend/doodgeel, α-H-2Kb, α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c en α-MHCII). Incubeer gedurende 15 min bij 4 °C in het donker. Was 2x met 1 mL FACS buffer. De celpellets opnieuw opschorten in 200 μL FACS-buffer en de analyse uitvoeren door stroomcytometrie.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. GVHD/GVL Modellen van BMT
<ol><li>Voer GVHD/GVL inductie uit.<ol>
<li>Cultuur de luciferase transduced A20 B cel lymfoom in RPMI cultuur media.</li>
		<li>Bestraal BALB/c achtergrond WT of Ly5.1 ontvanger bij 700 cGy (enkele dosis). Zie details in stap 1.1.</li>
		<li>Isoleer TCD-BM van de femurs en tibias van B6. Ly5.1 donormuizen. Zie details in de stappen 1.2.1−1.2.10.</li>
		<li>Zuiver T-cellen uit milten en lymfeklieren van de C57BL/6 donormuizen. Zie details in de stappen 1.3.1−1.3.15.</li>
		<li>Was de A20 lymfoom 2x met 25 mL PBS. Resuspend de celpellets in 10 mL ijskoude PBS. Neem een celvering aliquot (10 μL) en tel de cellen met behulp van 1% trypan blauw en een hemocytometer. Pas de celconcentratie aan op 20.000 cellen/mL.</li>
		<li>Injecteer TCD-BM (5 x 106/muis) met of zonder T-cellen (0,75 x 106/muis) en A20 lymfoom (5.000 cellen/muis).</li>
		<li>Follow-up op de ontvanger overleven, GVHD klinische symptomen, en gewichtsverlies tijdens de experimentele cursus. Zie details in stap 1.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer bioluminescente beeldvorming uit.<ol>
<li>Monitor de tumorgroei bij de getransplanteerde ontvanger door de ontvangende muizen te injecteren met 4 mg D-luciferine. Incubeer 5 min om ervoor te zorgen dat Luciferin reageert met luciferase.</li>
		<li>Verdoven de muis met behulp van 3% isoflurane in de kamer van een bioluminescentie imager en beeld de ontvangers voor 5 min in veld D en de belichtingstijd van 1 min.</li>
		<li>Analyseer gegevens met behulp van beeldanalysesoftware. Wijzig de schaal van de pseudo-kleurenafbeeldingen voor de beste resultaten. OPMERKING: Alle foto's moeten op dezelfde schaal zijn in experimenten.</li>
		<li>Gebruik de beeldanalyserende software om de interessegebieden te bepalen en de signaaldichtheid te kwantificeren door de flux (fotonen/s) te berekenen die uit elke interessegebied wordt uitgezonden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li>
<li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li>
<li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li>
<li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2010+report+from+the+Center+for+International+Blood+and+Marrow+Transplant+Research+%28CIBMTR%29%3A+current+uses+and+outcomes+of+hematopoietic+cell+transplants+for+blood+and+bone+marrow+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders.</a> Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).</li>
<li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+graft-versus-host+disease%3A+advances+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+%26+Mechanism%22%5BJournal%5D)">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).</li>
<li>Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Preclinical+Development+of+Allogeneic+Hematopoietic+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.</a> ILAR Journal. , ily006(2018).</li>
<li>Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T+cell+subsets+in+lethal+graft-versus-host+disease+%28GVHD%29+directed+to+class+I+versus+class+II+H-2+differences.+II.+Protective+effects+of+L3T4%2B+cells+in+anti-class+II+GVHD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD.</a> Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).</li>
<li>Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosuppressor+and+allohelper+T+cells+in+acute+and+chronic+graft-vs-host+disease.+I.+Alloreactive+suppressor+cells+rather+than+killer+T+cells+appear+to+be+the+decisive+effector+cells+in+lethal+graft-vs.-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).</li>
<li>Lu, Y., Waller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichotomous+role+of+interferon-gamma+in+allogeneic+bone+marrow+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).</li>
<li>Abdollahi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+platelet-derived+growth+factor+signaling+attenuates+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+regulation+of+graft-versus-host+disease+and+graft-versus-leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia.</a> Blood. 119, 5088-5103 (2012).</li>
<li>Ullmann, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li>
<li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li>
<li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation%3A+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li>
<li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li>
<li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417(2013).</li>
<li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+using+bioluminescence%3A+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li>
<li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+vs+minor+histocompatibility+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li>
<li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li>
<li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li>
<li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Het gebruik van stamcellen voor een bepaald individu is een effectieve aanpak voor de behandeling van gevorderde en resistente kankers18. Kleine molecuul geneesmiddelen, echter, zijn lang gebleven een primaire focus van gepersonaliseerde kankertherapie. Anderzijds kan in cellulaire therapie een veelheid aan interacties tussen donor en gastheer de behandelingsresultaten, zoals de ontwikkeling van GVHD na BMT1,beslissend beïnvloeden.
Grote MHC-niet...

Allogene hematopoietische stamceltransplantatie (BMT) is een effectieve therapie voor de behandeling van hematologische maligniteiten1,2 door middel van het graft-versus-leukemieeffect (GVL)effect 3. Donorlymfocyten voeren echter altijd ongewenste immunologische aanvallen op ontvangende weefsels op, een proces dat graft-versus-host disease (GVHD) wordt genoemd4.
Murine modellen van GVHD zijn een effectief instrument om de biologie van GVHD en de GVL respons5te bestuderen. Muizen zijn een kosteneffectief onderzoeksdiermodel. Ze zijn klein en efficiënt gedoseerd met moleculen en biologische in de vroege fasen van de ontwikkeling6. Muizen zijn ideale onderzoeksdieren voor genetische manipulatiestudies omdat ze genetisch goed gedefinieerd zijn, wat ideaal is voor het bestuderen van biologische paden en mechanismen6. Verschillende muis grote histocompatibiliteit complex (MHC) MHC-mismatched modellen van GVHD zijn goed ingeburgerd, zoals C57BL/6 (H2b) naar BALB/c (H2d) en FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Dit zijn bijzonder waardevolle modellen om de rol van individuele celtypen, genen en factoren te bepalen die GVHD beïnvloeden. Transplantatie van C57/BL/6 (H2b) ouderdonoren naar ontvangers met mutaties in MHC I (B6.C-H2bm1) en/of MHC II (B6.C-H2bm12) heeft aangetoond dat een mismatch in zowel MHC klasse I als klasse II een belangrijke vereiste is voor de ontwikkeling van acute GVHD. Dit suggereert dat zowel CD4+ als CD8+ T-cellen nodig zijn voor ziekteontwikkeling7,8. GVHD is ook betrokken bij een ontstekingscascade die bekend staat als de 'pro-inflammatoire cytokinestorm'9. De meest voorkomende conditioneringsmethode in murinemodellen is totale lichaamsbestraling (TBI) door röntgenfoto's of 137Cs. Dit leidt tot de beenmergablatie van de ontvanger, waardoor donorstamcelen engraftment mogelijk zijn en voorkomen dat het transplantaat wordt afgekeurd. Dit wordt gedaan door het beperken van de proliferatie van ontvanger T-cellen in reactie op donorcellen. Bovendien spelen genetische verschillen een belangrijke rol bij ziekte-inductie, die ook afhangt van kleine MHC-mismatch10. Daarom varieert de myeloablative bestralingsdosis bij verschillende muizenstammen (bijvoorbeeld BALB/c→C57BL/6).
Activering van donor-T-cellen door gastheerantigeen presenterencellen (APC's) is essentieel voor gvhd-ontwikkeling. Onder de APC's zijn dendritische cellen (DC's) het meest krachtig. Ze zijn erfelijk in staat om GVHD te induceren vanwege hun superieure antigeenopname, expressie van T-cel co-stimulerende moleculen, en de productie van pro-inflammatoire cytokinen die T-cellen polariseren in pathogene subgroepen. Ontvanger DC's zijn van cruciaal belang voor het vergemakkelijken van T-cel priming en GVHD-inductie na transplantatie11,12. Daarom zijn DC's interessante doelwitten geworden bij de behandeling van GVHD12.
TBI is nodig om de donorcel engraftment te verbeteren. Als gevolg van het TBI-effect worden ontvangende DC's geactiveerd en overleven gedurende een korte tijd na de transplantatie12. Ondanks de grote vooruitgang in het gebruik van bioluminescentie of fluorescentie, is het nog steeds een uitdaging om een effectief model vast te stellen om de rol van ontvanger-DC's in GVHD te bestuderen.
Omdat donor T-cellen zijn de drijvende kracht voor GVL activiteit, behandeling strategieën met behulp van immunosuppressieve geneesmiddelen zoals steroïden te onderdrukken T-cel alloreactivity veroorzaken vaak tumor terugval of infectie13. Daarom kunnen targeting van ontvanger DC's een alternatieve aanpak bieden voor de behandeling van GVHD met behoud van het GVL-effect en het voorkomen van infectie.
Kortom, de huidige studie biedt een platform om te begrijpen hoe verschillende soorten signalering in ontvanger DC's gvhd-ontwikkeling en het GVL-effect na BMT reguleert.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0 100ML</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td>MACS buffer</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>MACS buffer</td></tr><tr><td>A20 B-cell lymphoma</td><td>University of Central Florida</td><td>In house</td><td>GVL experiment</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl</td><td>Jackson Lab</td><td>30954</td><td>GVL experiment</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl CD4cre</td><td>University of Central Florida</td><td></td><td>GVL experiment</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>Anti-Human/Mouse CD45R (B220)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0452-85</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>Anti-mouse B220 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10452-85</td><td>Flow cytometry analysis</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c- AF700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>117319</td><td>Flow cytometry analysis</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD25 PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0251-82</td><td>Flow staining</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0041-86</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 eFluor&reg; 450 (Pacific Blue&reg; replacement)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0042-82</td><td>Flow staining</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45.1 PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0900-83</td><td>Flow cytometry analysis</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD8a APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0081-83</td><td>Flow cytometry analysis</td></tr><tr><td>Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5958-82</td><td>Flow cytometry analysis</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC Class II-antibody APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5320-82</td><td>Flow cytometry analysis</td></tr><tr><td>Anti-Mouse TER-119 Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5921-85</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>Anti-Thy1.2</td><td>Bio Excel</td><td>BE0066</td><td>BM generation</td></tr><tr><td>B6 fB-/- mice</td><td>University of Central Florida</td><td>In house</td><td>Recipients</td></tr><tr><td>B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice</td><td>Charles River</td><td>564</td><td>Donors</td></tr><tr><td>BALB/c mice</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>Transplant recipients</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>Donors/Recipients</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0112-85</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>CD25-biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0251-82</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0452-82</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5971-82</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>Cell strainer 40 uM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>Cell preparation</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 uM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>Cell preparation</td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td>Live animal imaging</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Bilogicals R&amp;D system</td><td>D17051</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Flow cytometry tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>Flow cytometry analysis</td></tr><tr><td>FVB/NCrl</td><td>Charles River</td><td>207</td><td>Donors</td></tr><tr><td>Lipopolysacharide (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>DC mature</td></tr><tr><td>LS column</td><td>Mitenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Cell preparation</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>New Brunswick Galaxy 170R incubator</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>Media</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scienctific</td><td>11875-093</td><td>Media</td></tr><tr><td>TER119</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5921-82</td><td>T-cell enrichment</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS-200</td><td>Perkin Elmer</td><td>Xenogen IVIS-200</td><td>Live animal imaging</td></tr><tr><td>X-RAD 320 Biological Irradiator</td><td>Precision X-RAY</td><td>X-RAD 320</td><td>Total Body Irradiation</td></tr></tbody></table>

beenmergtransplantatie platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogene beenmergtransplantatie (BMT) is een effectieve therapie voor hematologische maligniteiten als gevolg van het graft-versus-leukemieeffect om tumoren uit te roeien. De toepassing ervan wordt echter beperkt door de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte (GVHD), een belangrijke complicatie van BMT. GVHD wordt opgeroepen wanneer T-cellen in de donorgrafts alloantigeen herkennen, uitgedrukt door ontvangende cellen en ongewenste immunologische aanvallen op gezonde weefsels van de ontvanger oppakken. Zo zijn traditionele therapieën ontworpen om donor T-cel alloreactiviteit te onderdrukken. Deze benaderingen tasten echter het GVL-effect aanzienlijk aan, zodat het voortbestaan van de ontvanger niet wordt verbeterd. Inzicht in de effecten van therapeutische benaderingen op BMT, GVL en GVHD, is dus essentieel. Vanwege de antigeen-presenterende en cytokine-afscheidingscapaciteit om donor T-cellen te stimuleren, spelen de ontvanger dendritische cellen (DC's) een belangrijke rol bij de inductie van GVHD. Daarom wordt targeting ontvanger DC's een potentiële aanpak voor het beheersen van GVHD. Dit werk geeft een beschrijving van een nieuw BMT-platform om te onderzoeken hoe host DC's gvh- en GVL-reacties na transplantatie reguleren. Ook gepresenteerd is een effectief BMT model om de biologie van GVHD en GVL studie na transplantatie.

Het grote B6-model (H2kbb)-BALB/C (H2kd)kwam na de transplantatie nauw overeen met de ontwikkeling van GVHD(figuur 2). Alle zes gvhd klinische symptomen die eerder door Cooke et al.16 werden vastgesteld, kwamen voor bij de ontvangers die met WT-B6 T-cellen werden getransplanteerd, maar niet bij de ontvangers die alleen met BM werden getransplanteerd (stap 1.5), die de GVHD-negatieve groep vertegenwoordigden. Er zi...

Graft-versus-host ziekte is een belangrijke complicatie na allogene beenmergtransplantatie. Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van graft-versus-host ziekte. Het huidige artikel beschrijft een nieuw beenmergtransplantatieplatform om de rol van dendritische cellen te onderzoeken bij de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect.

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Dit nieuwe beenmergtransplantatieprotocol kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe host dendritische cellen de reacties op graft-versus-host en graft-versus-leukemie na transplantatie reguleren. Ex vivo celregeneraties maakt het mogelijk om dit protocol aan te passen aan de rol van andere immuuncelpopulaties zoals macrofaag en neutrofielen te testen door simpelweg de cultuurconditie te wijzigen. Het demonstreren van de procedure met mij zal lab manager Krystal Hossack en undergraduate Sanjeev Gurshaney.Voor donor T-cel-uitgeputte C57BL/6 beenmergvoorbereiding, oogst het dijbeen en scheenbeen volgens standaardprotocollen van geëuthanaseerde donormuizen en breng de botten over in een petrischaal met een diameter van 92 millimeter met 1%RPMI-medium. Verwijder met een schaar de uiteinden van elk bot en vul een drie milliliter spuit uitgerust met een 26-meter naald met vers 1%RPMI-medium. Steek de naald in het ene uiteinde van een been en druk de zuiger om het beenmerg uit de holte te spoelen en in een opvangcelzeef.Wanneer al het beenmerg is verzameld, stam de beenmerg stukken door middel van een 75 micrometer mesh filter en breng de eencellige suspensie in een nieuwe 50 milliliter buis. Sediment de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet op een 20 keer 10 tot de zes cellen per milliliter concentratie in PBS aangevuld met 0,5%BSA. Voeg vervolgens 0,05 microgram THI1-antilichaam per één keer 10 toe aan de zes cellen voor een incubatie van 30 minuten bij vier graden Celsius.Aan het einde van de incubatie, was de cellen twee maal met 10 milliliter ijskoude PBS en resuspend de pellet op een twee keer 10 tot de zeven cellen per milliliter concentratie in 0,5%BSA aangevuld met 10% jonge konijn complement en 2%DNAse in steriel water voor een 45-minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie was de cellen twee maal met 15 milliliter verse PBS per wasbeurt en spoel de pellet opnieuw op in 20 milliliter PBS met 0,5%BSA. Pool de lymfeklieren en de milt in een 40 micrometer poriezeef en gebruik een spuitzuiger om de weefsels door de filters te macereren om de cellen vrij te geven.Was de zeef en zuiger met RPMI medium aangevuld met 1%FBS om alle cellen en sediment de cellen te verzamelen door middel van centrifugatie. Voeg vijf milliliter ACK lyse buffer toe aan de celpellet. Na vijf minuten bij kamertemperatuur, stop de reactie met vijf milliliter medium aangevuld met 1%FBS en pellet de witte bloedcellen door centrifugatie.Resuspend de pellet in vijf milliliter MACS buffer voor het tellen en verdunnen van de cellen tot een concentratie van twee keer 10 tot de acht cellen per milliliter in verse MACS buffer. Voeg de juiste concentratie anti-erythroïde, anti-granulocyte, anti-B-cel en anti-NK-cel uitputtingsantilichamen per een keer 10 toe aan de zes cellen voor een incubatie van 15 minuten bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de cellen met 10 milliliter ijskoude MACS buffer en resuspend de pellet op een keer 10 tot de acht cellen per milliliter concentratie in verse MACS buffer.Voeg vervolgens 0,22 microliter anti-biotine microbeads per één keer 10 toe aan de zes cellen met mengen voor een incubatie van 15 minuten bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de cellen met 10 milliliter ijskoude MACS buffer en het verzamelen van de ongebonden verrijkte T-cellen door magnetische kraal scheiding met behulp van MACSxpress separator volgens de standaard kraal isolatie protocollen. Aan het einde van de scheiding, sediment de T-cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in vijf milliliter verse MACS buffer voor het tellen.Voor het genereren van beenmerg-afgeleide dendritische cellen, isoleren van het beenmerg van de femurs van wilde type of factor B knock-out muizen zoals aangetoond en lyse de rode bloedcellen in vijf milliliter van ACK lysis buffer, het stoppen van de reactie met 10 milliliter RPMI aangevuld met 1%FBS na vijf minuten. Na het verzamelen van de gehele bloedcellen door centrifugatie, resuspend de pellet in 10 milliliter van cultuurmedium tot twee keer 10 tot de zesde cellen per milliliter concentratie en voeg 20 nanogram per milliliter van GM-CSF aan de cellen voor het zaaien van 10 milliliter cellen op individuele 100 bij 15 millimeter Petri schotels bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende zes dagen. Activeer op dag zes de beenmerg-afgeleide dendritische celculturen met 25 microgram per milliliter LPS per plaat.Ten minste 85% van de gekweekte beenmergcellen onderscheiden zich in dendritische cellen. De T-cel zuiverheid na magnetische kraalverrijking is 90%De grote MHC mismatched C57BL/6 BALB/c model komt nauw overeen met GVHD ontwikkeling na transplantatie. De piek van ernst treedt op ongeveer 11 dagen na celoverdracht, gevolgd door een vermindering van de klinische scores en het herstel van het lichaamsgewicht tot dag 16.De ontvangers bezweken uniform aan GVHD door 30 tot 40 dagen posttransplantatie. Interessant is dat transplantatie met factor B knock-out dendritische cellen verbetert de overleving van de ontvanger en GVHD klinische scores. Luciferase-getransduceerde A20 B-cel lymfoom maakt het mogelijk de tumorgroei bij levende dieren te monitoren.In dit representatieve experiment stierven alle ontvangers van het wilde type BALB/c die alleen beenmerg plus A20 kregen, aan een tumorreval. Wild type BALB/c ontvangers getransplanteerd met beenmerg-afgeleide ACC1-uitgeputte donor T-cellen overleden aan GVHD. Bovendien stierven dieren die donorbeenmerg en ACC1-uitgeputte T-cellen kregen aan zowel GVHD als tumorreval.Om voldoende beenmergcellen te genereren, moeten de verzamelde scheenbeen- en dijbeenbotten vóór de beenmergcorrectie volledig vrij zijn van spierweefsel. Negatieve zuivering van de beenmergcellen met biotinelase anti-CD3 en Anti-Biotine MicroBeads kan ook per uitgevoerd om de lymfocyten uit het beenmerg te putten.

bone-marrow-transplantation-platform-to-investigate-role-dendritic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft een eenvoudige techniek om allogeen-specifieke anergie induceren in humane perifere bloed mononucleaire cellen. De techniek kan klinisch worden toegepast op niet-alloreactieve donorcellen te genereren. Infusie van deze cellen zou kunnen verbeteren immuun reconstitutie en vermindering van toxiciteit na allogene hematopoietische stamceltransplantatie.

Inductie van allogeen-specifieke anergie in humane perifere bloed mononucleaire cellen door allogeen stimulatie met Co-stimulerende signaal blokkade

Murine beenmergtransplantatie is een veel gebruikte techniek om immunologische mechanismen voor graft-versus-host ziekte bij mensen bestuderen. De mogelijkheid om T-cel mensenhandel patronen te...

Inductie van Graft-versus-host ziekte en<em&gt; In Vivo</em&gt; T-cel monitoren door gebruik van een MHC-matched muizenmodel

Beenmergtransplantatie geeft een manier om het genotype van het beenmerg afgeleide cellen. Als het gen van interesse tot expressie wordt gebracht in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen kan beenmergtransplantatie wijzigen beenmerg afgeleide cellen een ander genotype zonder de niet-beenmerg cellen genotype.

Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

This video describes a protocol for the generation of dendritic cells--key antigen-presenting cells that activate T cells--from the bone marrow of an adult mouse.

Bone Marrow-Derived Dendritic Cells Generation: A Method to Generate Dendritic Cells from Mouse Bone Marrow

This video demonstrates the induction of intestinal graft-versus-host disease, GvHD, in a lethally-irradiated recipient mouse using allogeneic hematopoietic stem cells and GvHD-inducing splenic alloreactive T lymphocytes. This protocol helps establish a severe acute intestinal GvHD model to understand the mechanism of the disease and develop innovative therapeutic options.

Induction of Graft Versus Host Disease in Mouse Models via Allogeneic Bone Marrow and Splenic Cell Transplantation

Hier presenteren we een protocol bij het opwekken van tolerantie in transplantatie, en beoordelen van in vitro en in vivo de onderdrukkende capaciteit van afzonderlijke cel subsets van de ontvanger en de immuunstatus van de ontvanger naar donor of exogene antigenen.

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

Hier presenteren we een protocol waarin wordt beschreven van Allogene hematopoietische stamceltransplantatie en repetitieve mini-Endoscopische evaluaties van de distale dubbelpunt ter plaatse voor de aanwezigheid, de kenmerken en de ernst van Colon ontsteking binnen live kunt muizen intestinale graft - versus - host-ziekte lijden.

Inductie van intestinale Graft - versus host klauwzeer en haar Mini-Endoscopische beoordeling in levende muizen

Hier presenteren we een protocol voor het opwekken en scoren van ziekten in een Xenogenic graft-versus-hostziekte (xenoGVHD) model. xenoGVHD biedt een in vivo model om immunosuppressie van menselijke T-cellen te bestuderen. Daarnaast beschrijven we hoe we menselijke T-cellen in weefsels met digitale PCR kunnen detecteren als een hulpmiddel om immunosuppressie te kwantificeren.

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

We beschrijven een humaan perifeer bloed mononucleaire cel (PBMC) — op basis van gehumaniseerd xenotransplantaatmodellen is muismodel voor translationeel immuno-oncologisch onderzoek. Dit protocol kan dienen als een algemene richtlijn voor het vaststellen en karakteriseren van vergelijkbare modellen voor I-O-therapie beoordeling.

Een humane perifere bloed mononucleaire cel (PBMC) Engrafted gehumaniseerd xenograft model voor translationele immuno-oncologie (I-O) onderzoek

We beschrijven drie methoden van beenmergtransplantatie (BMT): BMT met total-body bestraling, BMT met afgeschermde bestraling en BMT-methode zonder pre-conditionering (adoptieve BMT) voor de studie van klonale hematopoiese in muismodellen.

Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

Leer een beenmergtransplantatieprotocol om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect te onderzoeken. Deze methode is aanpasbaar voor andere immuuncellen.

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

Meer video's verkennen