Name: Isolatie van intacte oogbol voor het verkrijgen van integraal Oogoppervlak weefsel voor histologisch onderzoek en immunohistochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Leer een methode voor het isoleren van intacte muizenoogbollen met ooglid en oogoppervlak voor histologisch onderzoek. Deze techniek behoudt de anatomische integriteit voor immunohistochemische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken prof. Rong Ju voor de kritische lezing van het manuscript en alle lableden voor technische assistentie. Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Peking, China), het Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation project (201707020009; Guangzhou, provincie Guangdong, China), "100 people plan" van Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, provincie Guangdong, China), en onderzoek financiering van State Key laboratorium voor oogheelkunde in Zhongshan Ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, provincie Guangdong, China).

Alle procedures met betrekking tot het gebruik van muizen werden goedgekeurd door het Dierenzorg-en gebruiks Comité, Zhongshan Ophthalmic Center, en gehecht aan de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundige en Vision onderzoek.
1. dissectie van de oogbol met intact oculair oppervlak en oogleden
<ol><li>Ontleden het hoofd.<ol>
<li>Euthananisatie postnatale dag 10 (P10) en P28 muizen (Zie de tabel met materialen voor muis stammen) door cervicale dislocatie, snijd het hoofd van de nek door een paar scherpe schaar.</li>
		<li>Bisect hoofd met een paar rechte schaar langs de sagittale middellijn beginnend bij het interpariëtale bot rostrally naar de nasale (Figuur 1a, B). Opmerking: de schedel botten verhardt met muis veroudering, wees voorzichtig om de schaar zo veel mogelijk langs de middenlijn te snijden.</li>
		<li>Plaats elke helft van de gebisde kop in een schone Petri schaal, snijd de kaak en tong eerst met een scherpe schaar. Gratis de oogzenuw door het snijden van de hersenen voorafgaand aan de optiek Chiasm locatie, en verwijder alle hersenweefsels met inbegrip van olfactorische lamp bevestigd aan de schedel muur.</li>
		<li>Nu moeten de overgebleven weefsels alle schedel/orbitale botten hebben die geassocieerd zijn met de oogbol (Figuur 1C, D). Was het resterende deel met PBS om bloed en haar puin te reinigen.</li>
		<li>Voorvoegsel weefsels met 4% Paraformaldehyde (PFA, in fosfaat-gebufferde zoutoplossing [PBS], pH 7,4) in een conische buis van 50 mL bij kamertemperatuur (RT) met rotatie. De geschatte fixatietijd is als volgt: ~ 10 min voor P0 naar P7; ~ 20 min voor P8 naar P28; en ~ 30 min voor P29 en ouder. Opmerking: de voor fixatie biedt weefsel stijfheid waardoor de daaruit voortvloeiende dissectie gemakkelijker wordt. Bovendien vermijdt prefixatie het verlaten van vers weefsel niet te lang voordat de sectie is voltooid. Let op: PFA is gevaarlijk en moet voorzichtig behandeld worden.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder schedel/orbitale botten.<ol>
<li>Na de voor fixatie, spoel de ontleed kop snel in PBS drie keer om de gebroken haren en Fixatieven verder te elimineren om verder te gaan met verdere dissectie. Let op: blootstelling aan Fixatieven tijdens dissectie kan schadelijk zijn voor de gezondheid.</li>
		<li>Plaats het weefsel in 10 cm Petri schaaltje, snijd de schedel in drie delen langs de vlakken aangegeven in Figuur 1D, E. De oogbol in het stopcontact is verborgen in het middelste deel van de schedel onder ethmoïde, frontale en maxillaire botten (Figuur 1D, E).</li>
		<li>Gebruik twee paren van No. 4 rechte tang om het ethmoïde bot te schillen om de frontale en maxillaire botten volledig bloot te leggen (Figuur 1F).</li>
		<li>Geografisch verdelen het schedel oppervlak (met inbegrip van maxillaire en de frontale botten) in 4 gebieden (Figuur 1F). Steek de punt van de gebogen Tang horizontaal in elk gebied om de maxillaire en frontale botten opeenvolgend te verwijderen (Figuur 1F). Opmerking: de maxillaire botten kunnen niet allemaal tegelijk worden verwijderd. Met een geduldig ontleden ze stuk voor stuk. Het frontale bot is rechtstreeks verbonden met de oogbol door zachte bindweefsels. Wees voorzichtig bij het verwijderen van de oogbol om het strekken van de oogbol te voorkomen en het bindvlies te beschadigen.</li>
		<li>Na verwijdering van het partiële maxillaire bot en alle frontale botten zouden de onderliggende traan-en jukbeen beenderen worden blootgesteld (Figuur 1G). Verwijder de twee botten en bijbehorende subcutane spieren en vetten rond de oogbol, trim de oogbol met bijgevoegde oogleden en de huid in een klein vierkant vormig blok om het weefsel volume te verminderen en vergemakkelijkt het oriënteren van het weefsel bij het insluiten (Figuur 1 H).</li>
		<li>Plaats de oogbol en de bijbehorende weefsels terug in 4% PFA en blijf 's nachts op 4 °C fixeren. Het vaste weefsel kan gedurende ten minste één maand worden bewaard bij 4 °C in PBS met een toevoeging van 0,02% NaN3. U ook onmiddellijk naar histologische analyse gaan. Opmerking: als het weefsel voor langere perioden moet worden opgeslagen, kan het gemakkelijk worden opgeslagen in 70% ethanol.</li>
	</ol></li>
</ol>2. histologische analyse
<ol><li>Paraffine gedeelte en hematoxyline en eosine (H & E) kleuring<ol>
<li>Volg het standaardprotocol dat elders wordt beschreven9 om paraffine insluiten en snijden uit te voeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunohistochemie (IHC)<ol>
<li>Dewax de paraffine delen met xyleen en hydrateer de secties door middel van alcohol Series (100%, 95%, 80%) in gedistilleerd water (dH2O).</li>
		<li>Antigeen opvraging uitvoeren door microgolf behandeling van de weefsel glaasjes in 0,01 M citroenzuur buffer (3 g triatriumcitraat, 0,4 g citroenzuur per 1 L dubbel gedistilleerd H2O) in een glazen schuif pot met laag vermogen (120 W). Energie moet met tussenpozen worden geleverd voor totaal 5-10 min met elk interval van ongeveer 2 min. Opmerking: High-Power magnetron of consistente verwarming zou leiden tot loslating van weefsel secties van de glijbaan.</li>
		<li>Kies de dia's uit de glazen pot, veeg voorzichtig de restvloeistof rond elke sectie af met behulp van gezichts weefsels en plaats ze op het schuif rek in een histologie doos. Teken een vierkant rond elke sectie met een waterdichte histologische pen. Plaats 100 μL blokkerende buffer (0,1% Triton X-100 en 10% Donkey serum in 1x PBS) op elk vierkant en inincuberen gedurende 30 minuten bij RT.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de blokkerende oplossing met vacuüm, voeg het primaire antilichaam toe (Zie de tabel met materialen) met de gewenste verdunning in de blokkerende buffer en blijf de glaasjes bij 4 °c gedurende 24 uur of langer inbroed. Opmerking: de concentratie voor elk primair antilichaam dat voor IHC wordt gebruikt, varieert en moet worden getest in proef experimenten.</li>
		<li>Wassen weefsel dia's met PBST (0,1% Triton in PBS) drie keer, voor 10 min elk. Herhaal stap 2.2.4 met behulp van het secundaire antilichaam (Zie tabel met materialen) samen met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ter vervanging van de blokkerende buffer. Blijven gedurende ten minste 4 uur of langer bij kamertemperatuur (RT) inbroed.</li>
		<li>Verwijder het secundaire antilichaam, de wasweefsel gedeelten met PBST-oplossing driemaal, gedurende 10 minuten per stuk, en spoel vervolgens met een schone PBS voor nog eens 5 minuten.</li>
		<li>Veeg de resterende PBS omringende weefsel secties af, Monteer de dekstroken op secties met afdekmedium. Voer fluorescerende microscopie uit om afbeeldingen te verkrijgen (Zie de tabel met materialen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).</li>
<li>Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Morphology+of+the+Lipid+Layer+of+the+Tear+Film%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film.</a> Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).</li>
<li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+immunology+of+the+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Immunology+and+Allergy%22%5BJournal%5D)">Anatomy and immunology of the ocular surface.</a> Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).</li>
<li>Mizoguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+alkali+injury+damages+meibomian+glands+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice.</a> The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).</li>
<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+of+the+conjunctiva%3A+A+review+of+recent+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).</li>
<li>Nowell, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+imposes+aberrant+cell+fate+in+regenerating+epithelia+through+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).</li>
<li>Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histochemical+study+of+the+development+of+premaxilla+and+maxilla+during+secondary+palate+formation+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Histology+and+Cytology%22%5BJournal%5D)">A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo.</a> Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+MEK+kinase+1+in+TGF-beta%2Factivin-induced+epithelium+movement+and+embryonic+eyelid+closure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure.</a> The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).</li>
<li>Sharov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+overexpression+inhibits+eyelid+opening+by+altering+epidermal+apoptosis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation.</a> The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).</li>
<li>Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+symptoms+are+increased+in+mice+deficient+in+phospholipid+transfer+protein+%28PLTP%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP).</a> The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mastermind-like+transcriptional+co-activator-mediated+Notch+signaling+is+indispensable+for+maintaining+conjunctival+epithelial+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity.</a> Development. 140 (3), 594-605 (2013).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signaling+inhibits+goblet+cell+differentiation+via+SPDEF+in+conjunctival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium.</a> Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een kritische herinnering voor de voorbereiding van de intacte oogbol is dat alle orbitale botten volledig moeten worden verwijderd, vooral de juga-en traan beenderen, die klein zijn en zich in de buurt van de onderkant van de oogkas bevinden. Eventuele overgebleven beenderen kunnen de daaruit voortvloeiende histologie compliceren. In het geval dat een klein stukje bot niet per ongeluk volledig uit de sectie is verwijderd, kan het worden afgehaald uit het insluitings paraffine blok met behulp van een paar sharppincet. Na...

Het oogoppervlak bestaat uit een continu blad van geregiinaliseerd epitheel, inclusief palpebrale conjunctiva, bulbaire conjunctiva en cornea1. Veel klierstructuren worden geassocieerd met het oculaire oppervlak epitheel en samen genereren een laag van scheur film bescherming van het oppervlak van het hoornvlies van drogen en milieu invasies2. Verstoring van OS zou leiden tot keratitis, conjunctivitis of beide (keratoconjunctivitis). Zowel genetische factoren als milieu irriterende stoffen of hun interacties dragen bij aan pathologische veranderingen van het OS3,4. Dienovereenkomstig is een verscheidenheid aan genetisch gemanipuleerde en fysiek of chemisch geïnduceerde diermodellen gebruikt voor het bestuderen van ziekteprocessen van het menselijk OS.
De structuur en functie van de muis OS is op vele manieren vergelijkbaar met die van de mens. De door de oogklieren afgescheiden traan folie componenten zijn ook vergelijkbaar tussen muizen en mensen. Een schat aan studies is uitgevoerd met behulp van Muismodellen voor verhelderende mechanismen van menselijke OS ziekten5,6,7. In veel gevallen is het van cruciaal belang om wereldwijd te analyseren in plaats van lokale moleculaire veranderingen van het besturingssysteem om uitgebreide informatie te krijgen onder dezelfde experimentele behandeling. Daarom is Monstervoorbereiding met een goede integriteit nodig om ervoor te zorgen dat elk deel van het besturingssysteem gelijktijdig wordt geanalyseerd.
De muis OS nauw verbonden met de oogbol die werd ingebed in het oog socket/baan (een Bony Cup gemaakt van verschillende schedel botten) en verbindt met het door dunne bindweefsels. Er bestaan enorme uitdagingen voor het ontleden van het hele oogoppervlak zonder beschadiging van de palpebrale of bulbaire conjunctiva. Deze uitdagingen dalen van: (i) het besturingssysteem is zacht en dun en aangebracht op fysiek gescheiden maar beweegbare oogleden en oogbol, daarom kwetsbaar voor vervorming en beschadiging; en (II) de beperkte ruimte tussen de orbitale botten en de oogbol beperken de dissectie operaties. De uitdagingen zijn veel groter voor de volwassen muis. In de embryonale muis, de orbitale botossificatie is niet compleet en omringende weefsels zijn relatief los8. Het hoofd kan worden verwijderd en gebisde, en vervolgens direct onderworpen aan Paraformaldehyde (PFA) fixatie en inbedding9. Daarentegen zijn de postnatale en volwassen muis orbitale botten volledig verbeend met dikke omringende weefsels, waardoor de penetratie van Fixatieven minder efficiënt. Bovendien zijn de orbitale/schedel botten hard en broos, gemakkelijk gebroken bij het snijden in de zachte inbedding verbindingen zoals paraffine. De gebroken stukjes botten zullen unaniem de nabijgelegen weefsels scheuren, wat resulteert in inferieure weefsel morfologie.
Veel gepubliceerde studies vertoonden vaak een gedeeltelijk oogoppervlak, wat voldoende kan zijn voor hun specifieke onderzoeksdoeleinden10,11. Een totaal onderzoek van literatuur vond slechts weinig studies waaruit blijkt dat het geheel intact oculair oppervlak wordt gedemonstreerd zonder een gedetailleerde beschrijving van de dissectie protocollen12,13. In dit protocol hebben we een dissectie methode uitgewerkt om een integraal postnatale oculair oppervlak te verkrijgen, waarin orbitale en schedel botten ordelijk werden verwijderd, waardoor het onaangetaste oculaire oppervlak samen met de oogbol en oogleden werd gelaten en de fysieke schade werd geminimaliseerd. We onderzochten verder de OS histologie en voerden immunohistochemie uit met behulp van de weefsel secties die met dit protocol zijn bereid.

<table><tbody><tr><td>1× Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>FG701-01</td><td></td></tr><tr><td>50ml centrifuge tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Kleefmicroscoopglazen</td><td>Verschillend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Aanbevolen concentratie 1:500 - 1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12380</td><td>Aanbevolen concentratie 1:500 - 1.000</td></tr><tr><td>Anti-K12 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab124975</td><td>Aanbevolen concentratie 1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-K14 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td>Aanbevolen concentratie 1:800</td></tr><tr><td>Citroenzuur</td><td>Verschillend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Verschillend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gebogen pincet</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop.</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalcohol</td><td>Verschillend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente microscoop</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Montagemedium</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Micro dissecteer schaar - rechte kling</td><td>World Precision Instruments</td><td>503242</td><td></td></tr><tr><td>Microgolfovens</td><td>Galanz</td><td>P70D20TL-D4</td><td></td></tr><tr><td>Muisstammen</td><td>C57/BL6 en Sv129 gemengd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nr. 4 rechte pincet</td><td>World Precision Instruments</td><td>501978-6</td><td></td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Verschillend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Verschillend</td><td></td><td>Bereid een 4% oplossing in 1× PBS en filter met 0,45 μm filtermembraan</td></tr><tr><td>Weefselkweekschaal</td><td>Verschillend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trisodiumcitraat</td><td>Verschillend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBW6818</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van intacte oogbol voor het verkrijgen van integraal oogoppervlak weefsel voor histologisch onderzoek en immunohistochemie

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Oculaire oppervlak (OS) bestaat uit een epitheel blad met drie verbonden delen: palpebrale conjunctiva, bulbaire conjunctiva en corneale epitheel. Verstoring van OS zou leiden tot keratitis, conjunctivitis of beide (keratoconjunctivitis). In experimentele diermodellen met bepaalde genetische modificaties of kunstmatige operaties, is het nuttig om alle delen van het OS epitheel blad te onderzoeken om relatieve Pathogenetische veranderingen van elk deel parallel te evalueren. Echter, dissectie van OS weefsel als geheel zonder vervorming of beschadiging is uitdagend, voornamelijk te wijten aan de zachtheid en de dunheid van het besturingssysteem aangebracht op fysiek gescheiden maar beweegbare oogleden en oogbol. Bovendien wordt het diepe oogcontact dat wordt gevormd door de harde schedel/orbitale botten volledig bezet door de oogbol, waardoor er weinig ruimte is voor de exploitatie van dissecties. Als gevolg daarvan, directe dissectie van de oogbol met geassocieerde OS weefsels uit de gezichts zijde zou vaak leiden tot weefselschade, vooral de palpebrale en bulbaire conjunctiva. In dit protocol hebben we een methode beschreven om de schedel en orbitale botten opeenvolgend te verwijderen van een in elkaar verteerde muis hoofd, waarbij oogleden, oogoppervlak, lens en netvlies helemaal in één stuk worden verwijderd. De integriteit van het OS-blad was goed bewaard gebleven en kon in één sectie worden onderzocht door histologie of immunokleuring.

De belangrijkste schedel botten bekeken vanuit verschillende perspectieven werden geïllustreerd in Figuur 1A-E, met kleuren die wijzen op verschillende botten. We gebruikten vier weken oud dier voor demonstratie van de dissectie processen. Na dissectie stappen 1.1.1-1.1.3 en een korte voor fixatie (stap 1.1.4), wordt de oogbol met bijbehorende gelaats beenderen gedemonstreerd in Figuur 1E. Verder...

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van de muis oogbol met ooglid, oogoppervlak, voorste en posterieure segmenten in relatief intacte positie.

Isolatie van intacte oogbol voor het verkrijgen van integraal Oogoppervlak weefsel voor histologisch onderzoek en immunohistochemie

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Ons lab richt zich op oculaire ontwikkeling en de ziekten. Dit protocol beschrijft een methode om de schedel en de orbitale botten achtereenvolgens te verwijderen van ontleed muishoofd. Het verlaten van oogleden, oogoppervlak, lens, en het netvlies allemaal samen in een stuk. Het protocol komt ten goede aan oogartsen die geïnteresseerd zijn in oculaire oppervlakte didactiek. Ik ben Dianlel Guo, om de techniek te vertellen met een waarschijnlijke strijd wanneer het proberen om de beschadiging van de oogbol te voorkomen, terwijl het ontleden van de gezichtsbeenderen. Het belangrijkste voordeel van deze dissectiekwestie is dat de integriteit van de ooglijke oppervlakte epitheelplaat goed bewaard blijft en de verschillende delen van het oculaire oppervlak kunnen worden onderzocht door histologie of immunostaining in één enkele sectie. Zorg ervoor dat alle kleine botten en puin af te snijden van de zachte weefsels. Reden, het zal littekensporen veroorzaken op weefsel sectie anders. Na het euthanaseren van de muis, gebruik een paar rechte schaar af te snijden van het hoofd en bisect het langs de sagittale middellijn begin bij de intraparietale bot rostrally aan de neus. Plaats elke helft van de doorgesneden hoofd in een schone petrischaal en gebruik een scherpe schaar om de kaak en tong af te snijden. Bevrijd de oogzenuw door het af te snijden van de hersenen voorafgaand aan de optische chiasm locatie. En verwijder alle hersenweefsels, inclusief de reukbol, die aan de schedelwand is bevestigd. Nu alle resterende weefsels zullen alle schedel en orbitale botten geassocieerd met de oogbol hebben. Was de resterende delen met PBS om bloed en haarresten schoon te maken. Pre-fix de weefsels door ze te plaatsen in een 50 milliliter buis met 4% paraformaldehyde en draaien ze op kamertemperatuur. Nadat het voorvoegsel is voltooid, snel wassen de ontleed hoofd in PBS drie keer om verder te elimineren de gebroken haren en fixatiemiddelen. Plaats het weefsel in een petrischaal van 10 centimeter en snijd de schedel in drie delen langs de vlakken aangegeven in figuur een van het tekstprotocol. De oogbol en de socket is verborgen in het middelste deel van de schedel onder ethmoïde, frontale en maxillaire botten. Gebruik twee paar van nummer vier rechte tangen af te pellen van de ethmoïde bot en volledig bloot de frontale en maxillaire botten. Verdeel vervolgens geografisch het schedeloppervlak in vier gebieden. Plaats de punt van gebogen tangen horizontaal in elk gebied om de maxillaire en frontale botten achtereenvolgens te verwijderen. Hierna worden de onderliggende traan- en kruikbeenderen blootgesteld. Verwijder de twee botten en de bijbehorende onderhuidse spieren en vetten rond de oogbol. Trim de oogbol met bijgevoegde oogleden en huid in een klein, vierkant gevormd blok om het weefselvolume te verminderen en het oriënteren van het weefsel bij het inbedden te vergemakkelijken. Plaats de oogbol en de bijbehorende weefsels terug in 4% paraformaldehyde en blijven fix 's nachts op 4

isolation-intact-eyeball-to-obtain-integral-ocular-surface-tissue-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, zullen we laten zien hoe je netvlies stamcellen uit het ciliaire epitheel van de muis oog te isoleren en te groeien ze in cultuur tot klonale netvlies bollen te vormen. De bollen die zijn geïsoleerd beschikken over de kardinale eigenschappen van stamcellen: self-vernieuwing en multipotentiality.

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

De paper beschrijft een vereenvoudigde techniek om accijnzen hoornvlies en het netvlies weefsels uithalen van de oculaire bol van de menselijke postmortale donoren. De techniek die hier beschreven zal helpen om accijnzen goede kwaliteit weefsels worden gebruikt voor transplantatie, chirurgisch of wetenschappelijke doeleinden zonder deze te beschadigen andere weefsels van het oculair wereld.

Een vereenvoudigde methode voor<em&gt; In situ</em&gt; Excisie van het hoornvlies en het verwijderen van de ingewanden van retinaal weefsel van Human Ocular Globe

This video demonstrates a method to induce ocular surface inflammation and meibomian gland dysfunction in a murine model. Stimulation of the mouse's immune system using an immunogen and later restimulation with the same immunogen promotes ocular surface inflammation, which causes plugging of meibomian gland secretion through neutrophil-produced aggNETs and leads to dry eye disease.

A Method to Induce Ocular Surface Inflammation in a Murine Model

Het doel van dit protocol is om een effectieve techniek te laten zien om een volledige, intacte vitreuze kern en cortex van post mortem geënucleeerde varkensogen te isoleren.

Hele glasvocht Dissection voor Vitreodynamic Analyse

Het blootgestelde normale oculaire oppervlak bestaat uit hoornvlies en conjunctiva. Epitheliale cellen, spekcellen en immuuncellen zijn aanwezig in de conjunctiva. Hier wordt een niet-invasieve techniek van impressie cytologie beschreven met behulp van een impressie cytologie apparaat en flow cytometrie om immuuncellen in de conjunctiva te analyseren.

Een niet-invasieve manier om te isoleren en fenotype cellen uit de conjunctiva

Het doel van dit protocol is het karakteriseren van een nieuw model van glaucoomneurodegeneratie op basis van 360° thermische cauterisatie van de limbale vasculaire plexus, die subacute oculaire hypertensie induceert.

Volledige cirkel Cauterisatie van limbale vasculaire plexus voor chirurgisch geïnduceerd glaucoom bij knaagdieren

Dit artikel presenteert een protocol voor oculaire microdissectie bij knaagdieren. Het proces omvat de enucleatie van de oogbol samen met het nictitating membraan (d.w.z. het derde ooglid). Dit wordt dan gevolgd door de scheiding van de achterste en voorste oogschelpen.

Microdissectie van het knaagdieroog

Dit protocol schetst de procedure voor het verkrijgen en kweken van primaire retinale pigmentepitheelcellen (RPE) uit lokaal geproduceerde varkensogen. Deze cellen dienen als hoogwaardig alternatief voor stamcellen en zijn geschikt voor in vitro netvliesonderzoek.

Isolatie van primaire retinale pigmentepitheelcellen van varkens voor in vitro modellering

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het isoleren van retinale gliacellen Müller uit muizenogen. Het protocol begint met enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door isolatie, zaaien en kweken van Müller-cellen.

Isolatie van primaire müllercellen van de retinale glia van muizen

Grondige grossing en gestandaardiseerde doorsnede van niet-neoplastische bollen zijn belangrijk voor het verkrijgen van reproduceerbare histopathologische doorsneden van hoge kwaliteit. Richtlijnen voor een gestandaardiseerde grossisatie van volwassen en foetale niet-neoplastische bollen worden hierin gegeven. Verschillende opties voor het doorsnijden van wereldbollen worden gedemonstreerd en besproken, inclusief criteria voor case-based besluitvorming.

Grossing van niet-neoplastische bollen, inclusief foetale ogen

Deze studie presenteert een methodologie voor de toediening van therapieën in het netvlies en de oogzenuwen van de volwassen rat. Daarnaast wordt een unieke methode voor weefselverzameling geïntroduceerd voor een top-down en bloc verzameling van de oogzenuw en het netvlies bij een volwassen rat.

Oculaire therapeutische toediening en geavanceerde weefselafname bij volwassen ratten

Leer een methode voor het isoleren van intacte muizenoogbollen met ooglid en oogoppervlak voor histologisch onderzoek. Deze techniek behoudt de anatomische integriteit voor immunohistochemische analyse.

Isolatie van intacte oogbol voor het verkrijgen van integraal Oogoppervlak weefsel voor histologisch onderzoek en immunohistochemie (Video) | JoVE Journal

Isolatie van intacte oogbol voor het verkrijgen van integraal Oogoppervlak weefsel voor histologisch onderzoek en immunohistochemie

Meer video's verkennen