Isolatie van intacte oogbol voor het verkrijgen van integraal Oogoppervlak weefsel voor histologisch onderzoek en immunohistochemie
20 oktober 2019
Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van de muis oogbol met ooglid, oogoppervlak, voorste en posterieure segmenten in relatief intacte positie.
Ons lab richt zich op oculaire ontwikkeling en de ziekten. Dit protocol beschrijft een methode om de schedel en de orbitale botten achtereenvolgens te verwijderen van ontleed muishoofd. Het verlaten van oogleden, oogoppervlak, lens, en het netvlies allemaal samen in een stuk. Het protocol komt ten goede aan oogartsen die geïnteresseerd zijn in oculaire oppervlakte didactiek. Ik ben Dianlel Guo, om de techniek te vertellen met een waarschijnlijke strijd wanneer het proberen om de beschadiging van de oogbol te voorkomen, terwijl het ontleden van de gezichtsbeenderen. Het belangrijkste voordeel van deze dissectiekwestie is dat de integriteit van de ooglijke oppervlakte epitheelplaat goed bewaard blijft en de verschillende delen van het oculaire oppervlak kunnen worden onderzocht door histologie of immunostaining in één enkele sectie. Zorg ervoor dat alle kleine botten en puin af te snijden van de zachte weefsels. Reden, het zal littekensporen veroorzaken op weefsel sectie anders. Na het euthanaseren van de muis, gebruik een paar rechte schaar af te snijden van het hoofd en bisect het langs de sagittale middellijn begin bij de intraparietale bot rostrally aan de neus. Plaats elke helft van de doorgesneden hoofd in een schone petrischaal en gebruik een scherpe schaar om de kaak en tong af te snijden. Bevrijd de oogzenuw door het af te snijden van de hersenen voorafgaand aan de optische chiasm locatie. En verwijder alle hersenweefsels, inclusief de reukbol, die aan de schedelwand is bevestigd. Nu alle resterende weefsels zullen alle schedel en orbitale botten geassocieerd met de oogbol hebben. Was de resterende delen met PBS om bloed en haarresten schoon te maken. Pre-fix de weefsels door ze te plaatsen in een 50 milliliter buis met 4% paraformaldehyde en draaien ze op kamertemperatuur. Nadat het voorvoegsel is voltooid, snel wassen de ontleed hoofd in PBS drie keer om verder te elimineren de gebroken haren en fixatiemiddelen. Plaats het weefsel in een petrischaal van 10 centimeter en snijd de schedel in drie delen langs de vlakken aangegeven in figuur een van het tekstprotocol. De oogbol en de socket is verborgen in het middelste deel van de schedel onder ethmoïde, frontale en maxillaire botten. Gebruik twee paar van nummer vier rechte tangen af te pellen van de ethmoïde bot en volledig bloot de frontale en maxillaire botten. Verdeel vervolgens geografisch het schedeloppervlak in vier gebieden. Plaats de punt van gebogen tangen horizontaal in elk gebied om de maxillaire en frontale botten achtereenvolgens te verwijderen. Hierna worden de onderliggende traan- en kruikbeenderen blootgesteld. Verwijder de twee botten en de bijbehorende onderhuidse spieren en vetten rond de oogbol. Trim de oogbol met bijgevoegde oogleden en huid in een klein, vierkant gevormd blok om het weefselvolume te verminderen en het oriënteren van het weefsel bij het inbedden te vergemakkelijken. Plaats de oogbol en de bijbehorende weefsels terug in 4% paraformaldehyde en blijven fix 's nachts op 4
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol richt zich op een methode voor het isoleren van de muisogbol waarbij het ooglid en het botoppervlak intact blijven, zodat de anatomie behouden blijft voor anatomische studies. De techniek is bijzonder nuttig voor oogartsen die geïnteresseerd zijn in het onderzoeken van botoppervlakken zonder delicate weefsels te beschadigen.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Oculaire Ontwikkeling
- Oculaire Aandoeningen
- Histologie en Immunokleuring
Achtergrond
- Het belang van het behouden van de integriteit van het oogoppervlak
- Uitdagingen bij het dissekeren van muizenoogballen zonder beschadiging
- Toepassingen voor oogheelkundig onderwijs
Gebruikte methoden
- Sequentiële verwijdering van de schedel- en oogkasbeenderen
- Muismodell
- Gebruik van paraformaldehyde voor weefselfixatie
Belangrijkste resultaten
- Het protocol preserveert het epitheelvel van het oogoppervlak voor verder onderzoek
- Maakt histologische analyse of immunovleuring mogelijk
- Demonstreert effectieve technieken voor de dissectie van het oog
Conclusies
- De studie presenteert een betrouwbare methode voor het isoleren van de muisogbol met de bijbehorende structuren
- Van groot belang voor studies met betrekking tot oculaire gezondheid en ziekten
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het behouden van de integriteit van het epitheliale vel van het oogoppervlak maakt een parallelle evaluatie van de palpebrale conjunctiva, de bulbaire conjunctiva en het corneaal epitheel in ziektemodellen mogelijk. Deze aanpak ondersteunt mechanistische risicoreductie door een gelijktijdige beoordeling van pathogene veranderingen in onderling verbonden weefsels mogelijk te maken. Het verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid in preklinische studies waarbij een intacte weefselarchitectuur vereist is voor histologische analyse en immunokleuring.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door ruimtelijke relaties binnen het epitheelvel van het oogoppervlak te behouden.
- Operationele waarde: Faciliteert biologische risicoreductie door middel van intacte weefselpreparatie voor parallelle histologische analyse van ziektegerelateerde veranderingen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor met behouden architectuur van het oogoppervlak voor daaropvolgende immunokleuringen en histologische analyses.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van analyses door weefselvervorming tijdens de dissectie te minimaliseren, wat de reproduceerbaarheid tussen coupes verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de integriteit van het ziekterelevante systeem, wat de translationele afstemming van biomarkers over verbonden regio's van het oogoppervlak mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Waarborgt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de weefselmorfologie te behouden voor consistente doorsneden en analyse.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in workflows voor discovery biology door het mogelijk maken van de preparatie van intact weefsel voor histologische en immunokleuring-uitlezingen die hypothesetesten en de verduidelijking van signaalpaden ondersteunen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door de integriteit van het epitheelvel te behouden voor parallel onderzoek van de conjunctivale en corneale regio's.
- Screening: Verbetert de assay-gereedheid door reproduceerbare weefselisolatie, waardoor de variabiliteit bij histologische doorsneden wordt verminderd.
- Analytics: Maakt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen mogelijk via immunokleuring en histologie op intacte weefselcoupes.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekkingen met preklinische continuïteit door de architectuur van het oogoppervlak te behouden voor een consistente pathologische evaluatie.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbare capaciteit voor de preparatie van het oogoppervlak over meerdere ziektemodellen en screeningcampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door behoud van de weefselarchitectuur, waardoor gelijktijdige analyse van meerdere compartimenten van het oogoppervlak mogelijk is.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via een consistent dissectieprotocol dat weefselschade en coupesnedeartefacten minimaliseert.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanistische ambiguïteit in modellen van oogziekten via evaluatie van intact weefsel.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk gemaakt door betrouwbare histologische en immunokleuringsgegevens van intacte preparaten van het oogoppervlak.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microsurgische dissectietechnieken om weefselschade tijdens de botverwijdering te voorkomen.
- Afhankelijkheid van scharen met een scherpe snede en fijne pincetten voor de nauwkeurige scheiding van de schedel- en oogkasbeenderen van de weke delen.
- Vereist gestandaardiseerde fixatieprotocollen met paraformaldehyde om de weefselintegriteit voor het maken van coupes te behouden.
- Aanpassingen zijn noodzakelijk bij toepassing op verschillende modelsystemen of ontwikkelingsstadia.
- Praktische beperking: de effectiviteit van de procedure is afhankelijk van de volledige verwijdering van botresten om artefacten tijdens het coupesnijden te voorkomen.
