Een High-Throughput In Situ Methode voor schatting van Hepatocyte Nucleaire Ploidy in muizen

Deze methode stelt de gebruiker in staat om een profiel van hepatocyte nucleaire DNA-inhoud te genereren uit 2D-weefselsecties voor de studie van leverontwikkeling, regeneratie en chronische ziekte. Deze geautomatiseerde hoge doorvoerbenadering kan worden toegepast op alle 2D-leverweefselsecties, waardoor een intern gekalibreerde uitlezing van nucleaire trucs voor alle eenvoudige cirkelvormige hepatocyte kernen wordt geboden. Veranderingen in hepatocyte nucleaire ploidy worden geassocieerd met veroudering, chronische leverziekte, en kanker.

Deze techniek biedt een eenvoudig middel om nucleaire truc in vaste of cryopreserved leverexemplaren te profileren. In situ ploidy profilering methoden hebben een aanzienlijk potentieel als onderzoek en klinische instrumenten voor het bijhouden van de progressie van leverziekten als ze niet vereisen weefsel desegregatie of toegang tot vers materiaal. Na het oogsten van de murine leverweefsel monster, insluiten de lever lobule in een optimale snijtemperatuur medium gevuld cryomold en onmiddellijk plaats de mal op droog ijs om een snelle bevriezing te garanderen.

Om plakjes van het bevroren leverlobbulemonster te verkrijgen, doorsnijdt u het monster op een dikte van zes micrometer en plaatst u gedurende vijf seconden een gelabelde gecoat polyamide-gecoate dia over elk monster om elk monster aan de dia te laten plakken. Wanneer alle plakjes zijn verzameld, laat u de monsters drie tot vijf minuten in evenwicht brengen bij kamertemperatuur voordat immunotikseikend wordt. Bevestig aan het einde van het evenwicht de weefselsecties in een rookkap met één milliliter van 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de fixatie, spoel de dia's met drie drie minuten wast in PBS met zachte agitatie. Na de laatste wasbeurt, droog het gebied rond elke weefselsectie en gebruik een hydrofobe pen om een cirkel rond elk monster te trekken. Om de monsters te doorgronden, behandel de secties met een 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de incubatie, was de monsters gedurende drie minuten in PBS twee maal met zachte agitatie zoals aangetoond voordat de niet-specifieke binding wordt geblokkeerd met een gefilterde oplossing van 1%runderserumalbumen, 5%paardenserum en 0,2% niet-ionische oppervlaktevloeistof in PBS gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur. Vervolgens, incubeer de dia's met de HHF4-alpha antilichaam verdund in het blokkeren van buffer 's nachts op vier graden Celsius in een vochtige kleurkamer beschermd tegen licht. De volgende ochtend, was de dia's vier keer in PBS met zachte agitatie voor incubatie met een geschikte fluorescentie geconjugeerd secundair antilichaam en Hoechst verdund in gefilterd 1%runder serum albumen en 0,2% niet-ionische oppervlakteactieve stof in PBS gedurende twee uur bij kamertemperatuur in een vochtige kleurkamer beschermd tegen licht.

Aan het einde van de incubatie, was de glijbanen vier keer zoals aangetoond, gevolgd door twee drie minuten wast in dubbel gedestilleerd water met zachte agitatie. Na de laatste wasbeurt, monteer de monsters met twee druppels fluorescentie montagemedium op een coverslip en breng zachte druk toe als dat nodig is om eventuele bellen te elimineren. Controleer vervolgens de dia's met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop om een goede fixatie en immunolabeling te garanderen.

Voor fluorescentie beeld verwerving, stel de parameters op een hoog gehalte imaging platform om fluorescentie beelden te verwerven met behulp van de juiste excitatie voor de gebruikte fluoroforen. Scan vervolgens monsters om voldoende beelden te verkrijgen om volledige dekking van de weefselsectie te verkrijgen. Pas aan het einde van de scan de parameters van de nucleaire segmentatie van de software aan om ervoor te zorgen dat de kernen optimaal gescheiden zijn en wijzig de drempelintensiteit om een optimale gating van de HNF4-alpha-positieve hepatocyten en HNF4-alfa negatieve niet-parenchymale cellen te garanderen.

Voor nucleaire kwantificering, stel het nucleaire gebied in vierkante micrometers op basis van de Hoechst kleuring, de belangrijkste nucleaire Hoechst intensiteit, de nucleaire verlenging factor, de gemiddelde nucleaire rondheid index, de HNF4-alpha-status, en de nucleaire X, Y coördinaten op basis van het zwaartepunt. Om een hepatocyte nucleaire ploidy analyse uit te voeren, eerst downloaden en installeren van de ploidy quantification analyse programma. Navigeer in MATLAB naar het tabblad App van de gereedschapsstrip en klik op App installeren.

Open het Ploidy Application ML App Install-programma. Er verschijnt een bericht om de succesvolle installatie te bevestigen. Neem in elk gegevensanalysebestand een blad op dat celmaatjes wordt genoemd, met alle gegevens die nodig zijn voor de ploidy-analyse die in kolommen is vermeld, zoals aangegeven.

Voor elke experimentele voorwaarde, bieden een controle dataset die zal worden gebruikt om de interne controle voor twee tot vier N nucleaire ploidy kalibratie te berekenen. Voor biologische replica's slaat u elke spreadsheet op in een eigen map en noemt u de mapvoorvoegsels stapsgewijs. Start vervolgens de Ploidy applicatie.

De Ploidy applicatie grafische gebruikersinterface zal verschijnen. Klik op de knop Pad naar controlegegevens om naar de map te gaan waarin de besturingsgegevens zich bevinden. Dit gegevenspad wordt vervolgens weergegeven in de interface.

Typ in Mapvoorvot de naam die aan de uitvoerbestanden moet worden gegeven. Klik op de knop Pad naar andere gegevens en navigeer naar de map waarin de vergelijkende gegevens zich bevinden. Dit gegevenspad wordt vervolgens weergegeven in de interface.

Klik vervolgens op Uitvoeren. Wanneer de analyse is voltooid, wordt op de statusbalk Analyse voltooid gelezen. Na immunotikking is het belangrijk om alle dia's door conventionele fluorescentiemicroscopie te controleren om te bevestigen dat een fixatie en kleuring van goede kwaliteit is verkregen.

Smeren of vervagen van de Hoechst kleurstof kan duiden op onvoldoende fixatie of monster afbraak voorafgaand aan fixatie. Parameters voor nucleaire segregatie en HNF4-alfadrempel moeten zorgvuldig worden geoptimaliseerd voordat automatische beeldanalyse wordt uitgevoerd om het visuele patroon van de immunostaining die door fluorescentiemicroscopie wordt waargenomen, ruim weer te geven. Na beeldanalyse moeten de gegevens het toenemende aantal niet-parenchymale cellen en de kleine, maar significante, vermindering van HNF4-alpha positieve kernen in de lever met DDC-letsel weerspiegelen.

In gezonde controlelevers vertonen ongeveer 63% van de HNF4-alfa-positieve kernen een eenvoudige cirkelvormige morfometrie. Vergelijking van de relatieve nucleaire truc tussen controle en DDC behandelde groepen moet wijzen op een aanzienlijk verlies van 2C en 4C hepatocyte kernen met letsel samen met een toename van het aantal meer dan 8C cellen. De relatieve positionele informatie voor elke ploidy sub-groep kan worden ondervraagd door het ophalen van de 2D-locatie van bepaalde hepatocyte subsets binnen de hoge inhoud beeldanalyse software.

Immunolabeling met extra antilichamen, zoals Ki-67, kan worden uitgevoerd om celreplicatie te beoordelen en hepatocyte nucleaire morfolytiegegevens kunnen verder worden ondervraagd om de pleidy-analyse te complimenteren. Het weefselbrede ploidyprofiel dat door deze methode wordt gegenereerd, beschrijft het minimale DNA-gehalte voor alle cirkelvormige hepatocyte kernen, maar maakt geen onderscheid tussen mononucleaire cellen en binucleaire hepatocyten. De methode kan mogelijk worden aangepast om rekening te houden met parameters zoals celperimeter, om de identificatie van binucleaire cellen te vergemakkelijken en een extra uitlezing van cellulaire truc te bieden.