Name: Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Leer cryoslicing BN-MS voor hoogresolutie complexoomprofilering van membraaneiwitten. Deze methode analyseert native eiwitcomplexen in diverse biologische monsters met minimale artefacten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – project-ID 403222702 – SFB 1381 en onder de Duitse Excellence Strategy CIBSS-EXC-2189-project ID 390939984. Wij danken Katja Zappe voor technische assistentie.

1. preparatief BN-pagina
<ol><li>Gel preparaat<ol>
<li>Gebruik een middel-naar-groot formaat verticale gel elektroforese systeem (> 10 cm gel scheiding afstand; 14 cm x 11 cm, 1,5 mm spacer) met effectieve koeling ingesteld op 10 °C.</li>
		<li>Gegoten lineaire of hyperbolische porie gradiënt gel (1,5-3,0 mm spacers) met behulp van een roeren twee-kamer gradiënt mixer aangedreven door een pomp (Zie tabel met materialen en reagentia). In het gepresenteerde voorbeeld (lineaire gradiënt Gel 1%-13%):<ol>
<li>Bereid een 13 mL oplossing voor de voorste (Meng) kamer bestaande uit: 13% acrylamide (van 30% stamoplossing, 37,5:1.0 acrylamide: bisacrylamide), 0,75 M aminocapinezuur, 50 mM bis-tris (pH = 7,0), en 10% glycerol.</li>
			<li>Bereid een 10 mL oplossing voor de reservoir kamer bestaande uit: 1% acrylamide (van 30% stamoplossing, 37,5:1.0 acrylamide: bisacrylamide), 0,75 M aminocaproïnezuur, 50 mM bis-tris (pH = 7,0), en 0,2% CL-47 reinigingsmiddel.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Start de roerder en Voeg 30 micro liters APS (ammonium peroxodisulfaat, 10% stockoplossing) en 2,5 μL TEMED (N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine) en 2,5 microliter TEMED toe aan de oplossing in de voorste kamer. Start de pomp en open de klep aan de voorzijde (debiet moet worden afgesteld om het gieten in 10 minuten te voltooien). Voeg na 1 minuut 90 μL APS en 5 μL TEMED toe aan de oplossing in de reservoir kamer en open de kamer aansluiting.</li>
		<li>Laat de gel langzaam, maar grondig voor ten minste 24 uur polymeriseren bij kamertemperatuur (RT) om een homogene poriegrootte gradiënt te genereren. Bij vochtig gehouden kan de gepolymeriseerde gel rechtop worden bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 1 week. Opmerking: met opzet zal de bovenkant van de gel een zachte/Slimy consistentie hebben. Dit zal later worden verwijderd, maar zorgt voor een soepele invoer van eiwitten in de gel, met een minimaal risico op eiwit precipitatie dat anders kan leiden tot migratie artefacten (dat wil zeggen, strepen of eiwit precipitatie).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monstervoorbereiding en laden<ol>
<li>Laadsleuven voorbereiden door geschikte spacers (bijv. siliconen buizen) tussen de glasplaten te plaatsen voor het scheiden van 0,5-2,0 mg eiwit. De sleuven moeten worden gemaakt ten minste 3 cm breed (of beter, 5-6 cm breed).</li>
		<li>Solubilize ~ 2,5 mg membraan (muis nier endoeen-verrijkt preparaat) in 2 ml solubilisatie buffer met 1% (w/v) niet-denaturerende reinigingsmiddel (complexiolyte cl-47) gedurende 30 min op ijs. Ultracentrifugate (afsnijden van sedimentatie = 200 S of minder; hier wordt 130.000 x g/11 min gebruikt).</li>
		<li>Concentreer de solubilisate op een korte 50%/20% (w/v, 0,3 ml elk) sucrose stap gradiënt door ultracentrifugatie voor 1 h bij 400.000 x g. De uiteindelijke eiwitopbrengst moet ten minste 1 mg zijn.</li>
		<li>Voeg 0,05% (w/v) Coomassie G-250 toe aan de solubilisate en laad het monster op de gel. Beperk de eiwit belasting tot een doorsnede van 10-15 μg/mm2 gel Lane om hoge resolutie te verkrijgen en artefacten te voorkomen die voortvloeien uit eiwit precipitatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BN-pagina hardloop condities<ol>
<li>Voor het uitvoeren van buffers, bereid een standaard kathode buffer bestaande uit 50 mM tricine, 15 mM bis-Tris, en 0,01% Coomassie G-250. Bereid een standaard anode-buffer bestaande uit 50 mM bis-tris (pH = 7,0).</li>
		<li>Voer een preparatieve BN-pagina uit bij 10 °C 's nachts met behulp van een driefasenspanningsprotocol13 bestaande uit: een evenwichts fase voor 30 min bij 100 V, dan een langzame (3 uur) helling naar maximale spanning (40-50 v/cm gellengte) die ten minste 6 uur lang wordt gehandhaafd voor Endpoint focus van eiwitten. Opmerking: het wordt aanbevolen om elektroforese te onderbreken wanneer de migratie voorzijde het midden van de gel heeft bereikt en de kathode buffer voor verse buffer uitwisselde zonder Coomassie G250. Dit helpt om te voorkomen dat precipitatie artefacten in de gel die voortvloeien uit de lokale ineenstorting van de matrix poriënstructuur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. gel bemonstering en spijsvertering
<ol><li>Excisie van gelbanen<ol>
<li>Scan na de uitvoering de gels voor documentatiedoeleinden en houd deze tussen de glazen platen.</li>
		<li>Demonteer de platen en accijns op de rijstrook sectie (s) die van belang is.</li>
		<li>Neem een monster strook van de baan voor analyse met 2D BN/SDS-PAGE en eiwit kleuring of Western blotting (zoals weergegeven in Figuur 1B) om de regio's van belang, effectieve complexe grootte resolutie en eiwit overvloed te bepalen.</li>
		<li>Repareer geselecteerde gellanes tweemaal gedurende minstens 30 min met 30% (v/v) ethanol en 15% (v/v) azijnzuur.</li>
		<li>Breng het monster over naar het insluitings medium en laat het gedurende ten minste 2 uur op 4 °C weken en equilibraten, terwijl de gelplaat in slow motion op een rondschudapparaat blijft. Opmerking: de scheiding van de gel moet zorgvuldig worden gecontroleerd op algehele scheidings kwaliteit en migratie artefacten. Gelbanden die dominante eiwitten vertegenwoordigen, moeten vervormingsvrij en homogeen van intensiteit zijn. Lokale artefacten op de gel moeten worden weggesneden of uit de analyse worden weggelaten.</li>
	</ol></li>
	<li>Insluiten en cryomicrotome snijden Opmerking: dit is een verbeterde versie van de beschreven insluitings procedure en eerder foto-gedocumenteerd die het mogelijk maakt om bredere gellanes van maximaal 8 cm11in te sluiten en te snijden.<ol>
<li>Snijd eerst vaste gelbanen in secties (hier, 3 cm) precies parallel aan het eiwit migratie front/band patroon. Voor eenvoudiger gebruik, plaats elke sectie op een plastic film ondersteuning met gelijke afmetingen.</li>
		<li>Breng de rijstroken in een open buis met stoppers (gesloten op de bodem, centraal geperforeerd op de bovenkant, beide nauwkeurig uitgelijnd met de bovenste en onderste uiteinden van de gel sectie).</li>
		<li>Dompel de cilinder kort in vloeibare stikstof om het stollen snel te initiëren. Het transparante insluitings medium verstevigt binnen enkele seconden en wordt wit van kleur.</li>
		<li>Vul de holte met insluitings medium, dompel het kort in vloeibare stikstof en Vries de cilinder gedurende enkele uren bij-20 °C. Opmerking: koeling van de cilinder snel door het dompelen in vloeibare stikstof helpt om verplaatsing van de gelplaat in de buis te voorkomen. Vervorming moet worden vermeden om een hoge resolutie te waarborgen in de volgende analyse van de MS.</li>
		<li>Na demontage, verwijder de plastic folie en breng het blok met de ingesloten gelsectie naar een gekoelde, grotere diameter, metalen cilinder geplaatst op een vlakke steun (dat wil zeggen, Petri schaal) en verzegeld met insluitings medium aan de buitenkant van de cilinder. Vul de cilinder met insluitings medium en Vries grondig.</li>
		<li>Herhaal deze procedure met de andere kant van de cilinder om een solide blok met coplanaire oppervlakken te verkrijgen.</li>
		<li>Verwijder het blok uit de cilinder, lijm het met het insluitings medium op een voorgekookte metalen houder en steek de houder in de cryoslicing machine (cryotome). Het oppervlak van het blok moet zorgvuldig worden uitgelijnd ten opzichte van het snijden vlak. Laat het op de optimale temperatuur voor het snijproces (hier,-15 °C). Opmerking: gebruik een langzaam voortschrijdend handmatige snijden cyclus van 0,1 mm stapgrootte tot het oppervlak van het ingesloten gelgedeelte raakt om een juiste positionering te garanderen.</li>
		<li>Oogst de gelschijfjes een voor een, met een uiteindelijke gewenste dikte van 0,25 mm stapgrootte, en breng ze afzonderlijk over naar reactie buizen met lage eiwitbinding eigenschappen. Let op: in deze set-up kunnen uniforme gelschijfjes gemakkelijk worden verkregen zo dun als 0,1 mm en zo dik als 0,5 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Tryptische spijsvertering<ol>
<li>Voer in-gel tryptische spijsvertering na uitgebreide wassing van de gelschijfjes (ten minste drie extra wasronden worden aanbevolen om polymere componenten van het insluitings medium te verwijderen) volgens een standaardprocedure11.</li>
		<li>Vacuümdrooggeeleerde peptiden en reoplossen in 0,5% (v/v) trifluorazijnzuur door schudden bij 37 °C (10 min) gevolgd door Bad sonicatie (5 min) en korte centrifugeren.</li>
	</ol></li>
</ol>3. massaspectrometrie
<ol><li>nanoHPLC en MS set-up<ol>
<li>Laad verteerde monsters op een C18-voor kolom (deeltjesgrootte = 5 μm; diameter = 300 μm) met 0,05% (v/v) trifluorazijnzuur met behulp van een (gesplitste vrije) nano-HPLC gekoppeld aan een massaspectrometer met hoge resolutie.</li>
		<li>Elute veroverde peptiden met een waterige-organische gradiënt (eluent A): 5 min. 3% B, 120 min van 3% B tot 30% B, 20 min van 30% B tot 99% B, 5 min 99% B, 5 min van 99% B tot 3% B, 15 min 3% B (debiet = 300 nL/min). Opmerking: csBN-MS-gelschijfjes resulteren meestal in monsters met een lage tot gemiddelde peptide overvloed en een beperkte mate van complexiteit. de analyse van nanoLC-MS/MS moet daarom worden uitgevoerd met een set-up die redelijke gevoeligheid en sequentie snelheid biedt, hoge massa resolutie (> 100000) en het maximale dynamische bereik (effectief 3-4 ordes van grootte). Het vereist echter geen lange kolom afmetingen of elutie-gradiënten die langer zijn dan 3 uur.</li>
		<li>Aparte geeleerde peptiden in een emitter (i.d. 75 μm; Tip = 8 μm) handmatig verpakt ongeveer 20 cm met C18-materiaal (deeltjesgrootte = 3 μm). Elektrospray de monsters bij 2,3 kV (positieve ionen modus) in het verwarmde overdrachts capillair (250 °C) van de massaspectrometer.</li>
		<li>Voer analyses uit met de volgende instrumentinstellingen11: maximale MS/MS injectie tijd = 400 MS; uitsluitings duur = 60 s; minimale signaaldrempel = 5.000 tellingen, Top 10 precursoren gefragmenteerd; isolatie breedte = 1,0 m/z). Opmerking: ter vergemakkelijking van de kalibratie van de massa, retentietijd en toewijzing van peptide signalen in een groot aantal gegevenssets of metingen, wordt aanbevolen om de respectieve MS-meetreeksen uit te voeren zonder onderbrekingen of wijzigingen in parameters en hardware ( dat wil zeggen, op dezelfde C18-kolom/emitter).</li>
	</ol></li>
	<li>Eiwit-identificatie (MS-gegevens geëvalueerd zoals eerder beschreven11)<ol>
<li>Extract piek lijsten van fragment Ion spectra met behulp van de "msconvert. exe" tool (onderdeel van ProteoWizard).</li>
		<li>Verschuiving van alle voorloper m/z-waarden voor elke gegevensset door de mediane m/z offset van alle peptiden toegewezen aan eiwitten in een voorlopige database zoeken met 50 ppm peptide massa tolerantie.</li>
		<li>Doorzoek de gecorrigeerde Peak lists met een geschikte zoekmachine (hier, mascotte 2.6.2) tegen alle muis ingangen van de UniProtKB/Swiss-Prot database (release 2018_11).</li>
		<li>Selecteer "acetyl (proteïne N-term)", "Carbamidomethyl (C)", "GLN | Pyro-glu (N-term Q), Glu | Pyro-glu (N-term E) "," oxidatie (M) ", en" Propionamide (C) "als variabele modificaties.</li>
		<li>Stel peptide en fragment massa tolerantie tot ± 5 ppm en ± 0,8 da, en laat een gemiste tryptische decolleté. Stel de verwacht waarde cut-off voor Peptide-id 0,5 of minder. Gebruik een Decoy database zoeken om te bepalen van de vals-positieve Discovery rate (FDR). Stel de FDR in op 1% of pas aanvullende kwaliteitscriteria toe om een betrouwbare identificatie te garanderen. Opmerking: het gepresenteerde experiment identificeerde meer dan 3.500 eiwitten, met een gemiddelde peptide FDR van 4,4 ± 0,77% (n = 101 segment monsters), of 3.000 eiwitten wanneer peptide FDR was ingesteld op 1%. Belangrijker is dat er strengere criteria werden gehanteerd voor de selectie van geprofileerde eiwitten (2.568). Het omvatte alle eiwitten die werden geïdentificeerd met ten minste twee peptiden, waarvan ten minste één eiwit-specifiek, in ten minste één van de 101 segment monsters.</li>
	</ol></li>
	<li>Eiwit kwantificering<ol>
<li>Gebruik Peptide signaal intensiteiten (piekvolumes [PVs]) voor eiwit kwantificering die zijn verkregen van FT volledige scans en correct voor retentietijd en massa verschuivingen met behulp van de juiste software (hier, MaxQuant v 1.6.3).</li>
		<li>Lijn MS-gegevenssets één voor één uit naar (totale gemiddelde) peptide elutie-tijden met behulp van loess regressie. Wijs Pv's toe aan peptiden, hetzij rechtstreeks (MS/MS-gebaseerde identificatie) of indirect (d.w.z. op basis van hun overeenkomende m/z-en elutie tijd binnen zeer nauwe toleranties). Opmerking: dit protocol gebruikt in-House software voor de toewijzing van de "ingevoegde" peptiden. Ingestelde parameters resulteren in effectieve tolerantie toleranties voor m/z en elutie tijd van respectievelijk ± 2 ppm en ± 1 min (Zie Figuur 2A, B).</li>
		<li>Correct voor systematische Run-to-run variaties in peptide belasting en ionisatie-efficiëntie door peptide intensiteit schaalaanpassing berekend op basis van de mediane verschillen van relatieve peptide intensiteiten tussen naburige segment monsters (Figuur 2C).</li>
		<li>Filter PV-gegevens voor uitschieters en resterende vals-positieve toewijzingen geïdentificeerd door interne PV-consistentie analyse.</li>
		<li>Normaliseer Pv's van elke peptide naar hun maximale waarden over alle segment gegevenssets die relatieve peptide abundantie profielen opleveren.</li>
		<li>Ten slotte, bereken relatieve eiwit abundantie profielen als gemiddelden van ten minste twee (en maximaal zes of 50%, welke waarde is groter) van de beste corgerelateerde peptide profielen over een venster van drie opeenvolgende segmenten. Dit maakt het overbruggen van ontbrekende PV-waarden mogelijk en vermindert ruis. NB: Dit resulteerde uiteindelijk in 2.545 (van 2.568 vooraf geselecteerde) eiwit profielen (Figuur 2D).</li>
	</ol></li>
	<li>Karakterisering van eiwitcomplexen<ol>
<li>Analyseer eiwit profielen door eerst piek detectie uit te voeren met behulp van de lokale maxima-methode en de normale verdelingen op deze pieken af te passen, waardoor de positie (d.w.z. segment index of schijnbare complexe grootte) van hun maxima en FWHM (volledige breedte bij maximale intensiteit) (inset van Figuur 4). Opmerking: in de gegevensset worden profielen automatisch geanalyseerd met behulp van aangepaste scripts. De kleinste FWHM waarden zijn indicatief voor de effectieve grootte resolutie van de aanpak (hier, 6 x 0,25 = 1,5 mm).</li>
		<li>Gebruik referentie-eiwit complexe pieken met gedefinieerde moleculaire massa (zoals gerapporteerd in de UniProtKB/Swiss-Prot-database) voor lineaire regressieanalyse van de log10 (voorspelde moleculaire massa) waarden om Segmentnummer indices om te zetten naar schijnbare moleculaire grootten (d.w.z. een schijnbare complexe grootte in kDa). Opmerking: in deze studie werden 23 marker complexen in het monster geselecteerd (Figuur 4) op basis van (i) deeltjes vormen van profiel pieken, (II) experimentele ondersteuning van molecuulgewichten, en (III) distributies langs de onderzochte bn-pagina gelsecties.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Majeran, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+C4+Differentiation+for+Chloroplast+Membrane+Proteomes+in+Maize+Mesophyll+and+Bundle+Sheath+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Consequences of C4 Differentiation for Chloroplast Membrane Proteomes in Maize Mesophyll and Bundle Sheath Cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 7, 1609-1638 (2008).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li>
<li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 538-549 (2012).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS ONE. 8 (7), e68340(2013).</li>
<li>Wöhlbrand, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+membrane-protein+complexes+of+the+marine+sulfate+reducer+Desulfobacula+toluolica+Tol2+by+1D+blue+native-PAGE+complexome+profiling+and+2D+blue+native-%2FSDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of membrane-protein complexes of the marine sulfate reducer Desulfobacula toluolica Tol2 by 1D blue native-PAGE complexome profiling and 2D blue native-/SDS-PAGE.</a> Proteomics. 16 (6), 973-988 (2016).</li>
<li>Takabayashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCoM-DB+Update%3A+A+Protein+Co-Migration+Database+for+Photosynthetic+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">PCoM-DB Update: A Protein Co-Migration Database for Photosynthetic Organisms.</a> Plant and Cell Physiology. 58 (1), e10(2017).</li>
<li>Senkler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+complexome+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial complexome of Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 89 (6), 1079-1092 (2017).</li>
<li>de Almeida, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+electron+transport+systems+of+an+anammox+bacterium%3A+A+complexome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound electron transport systems of an anammox bacterium: A complexome analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (10), 1694-1704 (2016).</li>
<li>Anand, R., Strecker, V., Urbach, J., Wittig, I., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mic13+Is+Essential+for+Formation+of+Crista+Junctions+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mic13 Is Essential for Formation of Crista Junctions in Mammalian Cells.</a> PLoS ONE. 11 (8), e0160258(2016).</li>
<li>Eydt, K., Davies, K. M., Behrendt, C., Wittig, I., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cristae+architecture+is+determined+by+an+interplay+of+the+MICOS+complex+and+the+F1FO+ATP+synthase+via+Mic27+and+Mic10%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Cristae architecture is determined by an interplay of the MICOS complex and the F1FO ATP synthase via Mic27 and Mic10.</a> Microbial Cell. 4 (8), 259-272 (2017).</li>
<li>Müller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoslicing+Blue+Native-Mass+Spectrometry+%28csBN-MS%29%2C+a+Novel+Technology+for+High+Resolution+Complexome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cryoslicing Blue Native-Mass Spectrometry (csBN-MS), a Novel Technology for High Resolution Complexome Profiling.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 669-681 (2016).</li>
<li>Castonguay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-pore+channel+TPC1+is+required+for+efficient+protein+processing+through+early+and+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The two-pore channel TPC1 is required for efficient protein processing through early and recycling endosomes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10038(2017).</li>
<li>Schägger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Banyard, S. H., Stammers, D. K., Harrison, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+density+map+of+apoferritin+at+2.8-A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electron density map of apoferritin at 2.8-A resolution.</a> Nature. 271 (5642), 282-284 (1978).</li>
<li>Dettmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+protein+147+%28TMEM147%29+is+a+novel+component+of+the+Nicalin-NOMO+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transmembrane protein 147 (TMEM147) is a novel component of the Nicalin-NOMO protein complex.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (34), 26174-26181 (2010).</li>
<li>Kimberly, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-secretase+is+a+membrane+protein+complex+comprised+of+presenilin%2C+nicastrin+Aph-1%2C+and+Pen-2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gamma-secretase is a membrane protein complex comprised of presenilin, nicastrin Aph-1, and Pen-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6382-6387 (2003).</li>
<li>Hong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+PIG-U+and+yeast+Cdc91p+are+the+fifth+subunit+of+GPI+transamidase+that+attaches+GPI-anchors+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Human PIG-U and yeast Cdc91p are the fifth subunit of GPI transamidase that attaches GPI-anchors to proteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1780-1789 (2003).</li>
<li>Van Damme, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+ATP6V1E1+or+ATP6V1A+Cause+Autosomal-Recessive+Cutis+Laxa%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in ATP6V1E1 or ATP6V1A Cause Autosomal-Recessive Cutis Laxa.</a> The American Journal of Human Genetics. 100 (2), 216-227 (2017).</li>
<li>Budenholzer, L., Cheng, C. L., Li, Y., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+Structure+and+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteasome Structure and Assembly.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3500-3524 (2017).</li>
<li>Heusel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-centric+proteome+profiling+by+SEC-SWATH-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Complex-centric proteome profiling by SEC-SWATH-MS.</a> Molecular Systems Biology. 15 (1), e8438(2019).</li>
<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).</li>
</ol>

De auteur uwe Schulte is een werknemer en aandeelhouder van Logopharm GmbH dat een ComplexioLyte 47 produceert in deze studie. Het bedrijf levert ComplexioLyte reagentia aan academische instellingen op non-profit basis.

De gepresenteerde studie gebouwd op de csbn-MS techniek eerder gebenchmarkt met een mitochondriale voorbereiding11 en opgenomen verbeteringen in monstervoorbereiding, gel verwerking, en MS data-evaluatie. Gerichte analyse van een deel van de grootschalige scheiding BN-pagina op voorwaarde dat een uitgebreide set van gegevens tonen van kwaliteitsmetingen vergelijkbaar met de studie met mitochondriale membranen. Massa-en retentietijd fouten, evenals Run-to-run variaties werden zeer laag gehouden en de basis voor het bepalen van betrouwbare eiwit overvloed profielen. De grootte resolutie leek goed te zijn, met de helft-maximale piek breedtes zo laag als zes sneetjes (overeenkomend met 1,5 mm, Figuur 4) en relatieve grootte verschillen van minder dan 10% verdwenen (Figuur 3, Figuur 5A). Deze waarden niet volledig voldoen aan de grootte resolutie kwaliteit van de vorige csBN-MS analyse van mitochondriën (ondanks de kleinere gel bemonstering stapgrootte gekozen), maar ze zijn aanzienlijk beter dan de prestaties van conventionele BN-MS of grootte-uitsluiting MS benaderingen20 die onlangs populair geworden.
Het belang van een hoge effectieve complexe grootte resolutie wordt onderstreept door het simulatie-experiment in Figuur 3 (met behulp van de TPC1-geassocieerde complexen) dat nauwelijks kan worden opgelost met 2D bn/SDS-page Western Blot analyse (Figuur 1B). Deze resultaten suggereren dat de 0,25 mm snijden in dit geval resulteerde in een aantal oversampling, maar dit bleek nog steeds nuttig voor de eliminatie van "kwantificerings ruis" zonder afbreuk te doen aan de effectieve grootte resolutie. Dus, in overeenstemming met de vorige resultaten11, een steekproef stapgrootte van ~ 0,3 mm is over het algemeen aan te bevelen.
Met name, discriminatie van TPC1-geassocieerde complexen is volledig verloren met 1 mm gel bemonstering, dat is de kleinste stapgrootte voorzien door handmatig snijden in conventionele bn-MS5,6. Dit kan verklaren dat ondanks het feit dat krachtige MS-technologieën beschikbaar zijn, zeer weinig eiwitcomplexen en subeenheden geïdentificeerd zijn door complexome profiling. Naast zijn goede oplossend vermogen biedt csBN-MS een grote veelzijdigheid. Membraangebonden complexen en oplosbare eiwitcomplexen variërend van 50 kDa tot verschillende MDa kunnen effectief worden opgelost in een enkel experiment met minimale bias11. Dit contrasteert met alternatieve scheidingstechnieken die worden gebruikt voor complexome profilering zoals grootte uitsluiting of ionenwisselingschromatografie, die werken met subsets van oplosbare eiwitten met bepaalde grootte bereiken of laad eigenschappen. Aan de andere kant, csBN-MS is minder schaalbaar (maximale belasting van ~ 3 mg eiwit per gel), kan technisch uitdagend zijn, en kan niet worden geautomatiseerd.
Over het algemeen tonen de resultaten aan dat op csBN-MS gebaseerde complexome profilering met succes kan worden toegepast op niet-mitochondriale doelstellingen, maar ook enkele bijbehorende uitdagingen aangeven. Dus, efficiënte extractie en biochemische stabiliteit van eiwitcomplexen vereisen meer optimalisatie, en schoonmaak stappen en kan nog steeds beperkt zijn. Binnen het onderzochte formaat venster was het aantal goed gerichte, deeltjes eiwitcomplexen inderdaad aanzienlijk lager (gegevens niet weergegeven) in vergelijking met een mitochondriaal monster. Het wordt ook aanbevolen om de monster belasting van BN-PAGINA'S te verlagen om acceptabele gelschei ding te verkrijgen. Voor hogere belastingen kunnen bredere gellanes nodig zijn die moeilijker te verwerken zijn voor snijden (Zie begeleidende video). Bovendien, eiwit complexiteit van de monsters was hoger (rond twee-voudige) dan de mitochondriën-afgeleide segment verteerd, wat leidt tot meer ontbrekende PV-waarden en een verminderd dynamisch bereik. Sommige kleine eiwitten die naar verwachting deel zouden uitmaken van de in Figuur 5 getoonde complexen ontbreken in de analyses. Deze problemen kunnen in de toekomst worden opgelost door het gebruik van snellere en meer gevoelige instrumenten van de MS of Data-onafhankelijke acquisitie modes.
Monstervoorbereiding is zeer kritisch voor eiwit complex ophalen, stabiliteit en gel scheiding kwaliteit. Parameters en procedures moeten worden geoptimaliseerd voor elk bron weefsel, cellysaat, membraan (breuk) en eiwit complex van belang. De volgende algemene aanbevelingen zijn beschikbaar die kunnen helpen bij het uitbreiden van toepassingen van csBN-MS:
i) het bereiden van verse monsters en het vermijden van opwarming/bevriezing, sterke verdunningen, veranderingen in buffer condities en onnodige vertragingen;
II) het gebruik van buffers die in wezen verstoken zijn van zouten (vervangen door 500-750 mm betaïne of aminocapinezuur), over een neutrale pH en bevattende maximaal 1% (w/v) van niet-denaturerende detergens (eiwit: detergens verhouding tussen 1:4-1:10 voor solubilisatie van membraan eiwitcomplexen, geen wasmiddel nodig voor oplosbare eiwitcomplexen);
III) zorgvuldige tests en aanpassing van detergenten voorwaarden door analytische BN-pagina, aangezien deze een sterk effect kunnen hebben op de efficiëntie van complexe solubilisatie, weergave van membraan-eiwitcomplexen in het monster, de stabiliteit en de homogeniteit van eiwit-reinigingsmiddel micellen. De laatste zijn voorwaarden voor eiwitten om zich te concentreren als verschillende bands/complexe populaties op BN-PAGE gels. Eerdere literatuur biedt een breed scala aan neutrale reinigingsmiddelen. Echter, DDM (n-dodecyl β-d-maltoside)1,2,4,5,6 en digitonine3,5,7,8, 9,10,13,18 zijn de meest populaire keuzes voor bn-MS analyses tot nu toe. Er moet worden benadrukt dat elke wasmiddel voorwaarde noodzakelijkerwijs een compromis vormt tussen de solubilisatie-efficiëntie en het behoud van eiwit interacties en mogelijk niet even geschikt is voor alle soorten doel eiwitten en uitgangsmateriaal;
IV) het verwijderen van geladen polymeren zoals fibrils, filamenten, poly lysine, DNA en overvloedige componenten van een lager moleculair gewicht (d.w.z. metabolieten, lipiden of peptiden). Dit kan worden bereikt door ultracentrifugatie, gel filtratie of dialyse. Dit is met name belangrijk voor de totale cel of weefsel lysaten;
(v) toevoeging van Coomassie G-250 (eindconcentratie 0,05%-0,1%) en sucrose (om de dichtheid te verhogen voor het laden, eindconcentratie 10%-20% [w/v]) aan het monster vlak voor het laden, om te wissen door korte ultracentrifugatie, het monster te laden zonder perturbatie, en start de run onmiddellijk daarna.
Als toekomstig perspectief biedt csBN-MS gebaseerde complexome profilering opties voor multiplexing om eiwit complexe dynamiek te bestuderen of veranderingen in verband met specifieke biologische omstandigheden. Gecombineerde scheiding van monsters met een Metabo-label zoals voorgesteld voor op grootte-uitsluiting gebaseerde profilering21 lijkt eenvoudig, maar kan worden belemmerd door spontane uitwisseling van subeenheid in complexen die onafhankelijk van de gebruikte scheiding plaatsvinden Methode. Als alternatief kunnen gelabelde monsters worden opgelost in naburige gellanes, die vervolgens samen kunnen worden gesneden of gecombineerd na verteren voor differentiële analyse met hoge gevoeligheid en robuustheid.

BN-pagina scheiding werd voor het eerst direct gekoppeld aan LC-MS-analyse (BN-MS) door de onderzoeksgroepen Majeran1 en Wessels2 met behulp van handmatige segmentering van bn-page gel Lanes. Hun analyses identificeerden een aantal overvloedige membraan-eiwitcomplexen met bekende samenstelling van de subeenheid van planten plastiden en de mitochondriën van de HEK cellen, respectievelijk. Deze analyses waren echter verre van alomvattend en maakten geen objectieve identificatie van nieuwe assemblages mogelijk. De prestaties van massaspectrometers en de etiket vrije kwantificeringsmethoden zijn sindsdien aanzienlijk verbeterd, waardoor uitgebreide BN-MS-analyses zijn ingeschakeld. Dit heeft de term ' complexome profiling ' bedacht. Bijvoorbeeld, Heide en collega's geanalyseerd rat hart mitochondriën identificeren en clusteren 464 mitochondriale eiwitten, waardoor vele bekende assemblages te bevestigen. Daarnaast vonden ze TMEM126B een nieuwe en cruciale subeenheid van een specifiek assemblage complex3. Vergelijkbare resultaten (met 437 mitochondriale eiwit profielen) werden verkregen in een parallelle studie van de mitochondriën van de HEK cellen4.
Ondanks deze verbeteringen zijn er verschillende kwesties gebleven die het volledige potentieel van BN-MS voor complexome profilering beperken. Een belangrijke beperking is de effectieve grootte resolutie van complexen die wordt bepaald door twee factoren: de (i) kwaliteit van de BN-pagina scheiding, die afhangt van de uniformiteit van de gelmatrix porie gradiënt, evenals de stabiliteit/oplosbaarheid van de monster complexen, en (II) stapgrootte van de gel bemonstering, die op zijn best 1 mm bij het gebruik van conventionele handmatige snijden5,6. Slechte grootte resolutie mist niet alleen subtiele complexe isovormen en heterogeneities, maar het heeft ook een negatieve invloed op het dynamische bereik en het vertrouwen van onbevooroordeelde, de Novo subeenheid toewijzing en kwantificering.
Andere uitdagingen zijn de precisie van de eiwit kwantificering en de dekking van het werkelijke dynamische bereik van proteïne Abundances in het monster door massa spectrometrische analyse. Daarom is de toepassing van bn-MS complexome profilering grotendeels beperkt gebleven tot biologische monsters met een lagere complexiteit, hoge expressie van doel complexen en gunstige solubilisatie-eigenschappen (d.w.z. plastiden, mitochondriën en micro-organismen)6,7,8,9,10.
We introduceerden onlangs cryomicrotome slicing-Assisted BN-MS (csBN-MS), die nauwkeurige sub-millimeter bemonstering van BN-pagina gellanes combineert met uitgebreide MS-analyse en uitgebreide MS-gegevensverwerking voor de bepaling van eiwit profielen met hoge vertrouwen11. Toepassing op een mitochondriale membraan preparaat van rat hersenen toonde eerder onvervulde effectieve complexe grootte resolutie en maximale dekking van oxidatieve respiratoire keten complex (OXPHOS) subeenheden (dat wil zeggen, 90 van 90 MS-toegankelijk). Dit voorbeeld identificeerde ook een aantal nieuwe eiwit assemblages.
Hier beschreven zijn geoptimaliseerde procedures voor preparatieve schaal BN-pagina scheiding van eiwitcomplexen (niet beperkt tot een bepaalde biologische bron), het gieten van grote preparatieve BN-pagina gels, cryomicrotome segmentering van brede gelbanen en MS data Verwerking. Prestaties van hoge resolutie profilering wordt aangetoond voor een eiwit complex preparaat van muis nier endosome-verrijkt membranen. Ten slotte worden de voordelen van het verhogen van de resolutie en de nauwkeurigheid van massaspectrometrische kwantificering besproken.

<table><tbody><tr><td>30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610158</td><td>Aanbevolen voor acrylamide gradient gel oplossingen tot 13%</td></tr><tr><td>30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610154</td><td>Aanbevolen voor acrylamide gradient gel oplossingen >13%</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby Protein Blot Stain</td><td>Bio Rad</td><td>#1703127</td><td>Totale proteïne kleur op blot membranen; gevoelig en compatibel met immunodetectie</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Serva</td><td>nr. 35050</td><td>Centrifugeer stockoplossingen voor gebruik</td></tr><tr><td>ComplexioLyte 47</td><td>Logopharm</td><td>CL-47-01</td><td>Klaar-voor-gebruik detergent buffer (1%) voor milde solubilisatie van membraaneiwitten</td></tr><tr><td>Embedding Medium / Tissue Freezing Medium</td><td>Leica Biosystems</td><td>14020108926</td><td>Insluitingsmedium voor gel secties om gesneden te worden door een cryo-microtoom</td></tr><tr><td>Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 &micro;m</td><td>Merck</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof spuit met rubberen stop, 20-30 ml</td><td>n.v.t.</td><td>n.v.t.</td><td>elke leverancier, belangrijk voor het maken van een gel sectie insluitingsgereedschap</td></tr><tr><td>brede scheermesjes</td><td>n.v.t.</td><td>n.v.t.</td><td>elke leverancier, voor BN-PAGE gel trimmen / excisie van banen</td></tr><tr><td>metalen buis / cilinder, ca. 4 cm lang</td><td>n.v.t.</td><td>n.v.t.</td><td>vorm voor het insluiten en bevriezen van gelmonsters</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubes, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Nr. 0030108116</td><td>ten zeerste aanbevolen om eiwit/peptide verlies te minimaliseren door absorptie</td></tr><tr><td>sequencing-grade gemodificeerde trypsine</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>C18 PepMap100 precolumn, deeltjesgrootte 5 &micro;m</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>P/N 160454</td><td></td></tr><tr><td>PicoTip emitter (i.d. 75 &micro;m; tip 8 &micro;m)</td><td>New Objective</td><td>FS360-75-8</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 &micro;m)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.93.</td><td>kolommen handmatig gevuld</td></tr><tr><td>konijn anti-TPC1 antilichaam</td><td>Gramsch Laboratories</td><td>aangepaste productie</td><td>beschreven in Castonguay, et al., 2017 (Referentie 12)</td></tr><tr><td>Cy3-gebiotinyleerde geit anti-konijn IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>CY-1300</td><td>beschreven in Castonguay, et al., 2017 (Referentie 12)</td></tr><tr><td>biotinyleerde Lotus tetragonolobus lectin, FITC-geconjugeerd</td><td>Vector Laboratories</td><td>#B1325</td><td>beschreven in Castonguay, et al., 2017 (Referentie 12)</td></tr><tr><td>cryo-microtoom Leica CM1950</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743905</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean II Cell met wetblot unit</td><td>Bio Rad</td><td>n.v.t.</td><td>voor SDS-PAGE en Westernblot (niet meer verkocht)</td></tr><tr><td>Penguin Midi Gel Electrophoresis System</td><td>PeqLab</td><td>n.v.t.</td><td>voor BN-PAGE (niet meer verkocht)</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200 M microscoop + Photometrics Coolsnap 2 digitale camera</td><td>Zeiss / Photometrics</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>peristaltische pomp (IP hoge precisie meerkanaals)</td><td>Ismatec</td><td>ISM940</td><td>voor het gieten van gradiënt polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>gradiëntmixer met roeren (twee kamers)</td><td>zelf gemaakt, alternatief Bio Rad</td><td>1652000 of 1652001</td><td>voor het gieten van gradiënt polyacrylamide gels, handleiding bevat instructies voor het gieten van lineaire of hyperbolische gradiënt gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)</td></tr><tr><td>ultracentrifuge Sorvall M120 met S80 AT3 rotor</td><td>Sorvall / Thermo Scientific</td><td>n.v.t.</td><td>voor monstervoorbereiding (niet meer verkocht)</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano HPLC</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite massaspectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td><td></td></tr></tbody></table>

hoge-resolutie complexome profilering door cryoslicing bn-ms analyse

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Eiwitten oefenen over het algemeen biologische functies uit via interacties met andere eiwitten, hetzij in dynamische eiwit assemblages of als onderdeel van stabiel gevormde complexen. De laatste kan elegant worden opgelost volgens de moleculaire grootte met behulp van inheemse Polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). De koppeling van dergelijke scheidingen aan gevoelige massaspectrometrie (BN-MS) is goed vastgesteld en maakt theoretisch een uitputtende beoordeling mogelijk van de extractabele complexis in biologische monsters. Echter, deze aanpak is nogal moeizaam en biedt beperkte complexe grootte resolutie en gevoeligheid. Ook, de toepassing ervan is beperkt gebleven tot overvloedige mitochondriale en de eiwitten. Voor een meerderheid van eiwitten ontbreekt dus informatie over integratie in stabiele eiwitcomplexen nog steeds. Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerde aanpak voor complexome profilering bestaande uit de preparatieve schaal BN-pagina scheiding, sub-millimeter bemonstering van brede gellanes door cryomicrotome slicing, en massaspectrometrische analyse met label-vrije eiwit kwantificering. De procedures en hulpprogramma's voor kritieke stappen worden gedetailleerd beschreven. Als een toepassing, het rapport beschrijft complexome analyse van een ontbindend endosoom verrijkte membraan Fractie van muis nieren, met 2.545 eiwitten geprofileerd in totaal. De resultaten tonen identificatie van uniforme, laag-abundantie membraan proteïnen zoals intracellulaire ionenkanalen en hoge resolutie, complexe eiwit assemblage patronen, waaronder glycosylatie isoforms. De resultaten zijn in overeenstemming met onafhankelijke biochemische analyses. Kortom, deze methodologie maakt een alomvattende en onbevooroordeelde identificatie mogelijk van eiwit (Super) complexen en hun samenstelling van de subeenheid, wat een basis vormt voor het onderzoeken van stoichiometrie, assemblage en interactie dynamiek van eiwitcomplexen in biologisch systeem.

Een veelzijdig cryoslicing BN-MS protocol met behulp van een microtoom wordt gepresenteerd voor hoge-resolutie complexome profilering.

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Het centrale doel voor de ontwikkeling van de csBN-MS techniek was het verkrijgen van uitgebreide toegang tot de organisatie en assemblage van eiwitcomplexen die ten grondslag liggen aan signaaltransductie op en over het plasmamembraan van verschillende soorten weefsel en organen. csBN-MS biedt momenteel de hoogste resolutie veelzijdigheid voor de analyse van inheemse eiwitcomplex en hun subeenheid samenstelling, met name met betrekking tot membraaneiwitten. Hoewel de csBN-MS techniek werd ontwikkeld om complexe mengsels van membraan eiwit assemblages in knaagdier hersenen te analyseren kan het gemakkelijk worden aangepast aan de analyse van elk type biologisch monster.Een van de belangrijkste stappen van onze methode is de inbedding van de gel stuk en de juiste uitlijning op het snijvlak voor het snijden. Wees voorzichtig niet te scheuren of om de gel te comprimeren en zorg ervoor dat het niet wordt gekanteld naar het snijvlak, omdat dit de resolutie van de analyse zou verminderen. Onze csBN-MS techniek heeft verschillende praktische stappen die cruciaal zijn voor goede resultaten.Het is gemakkelijker om te laten zien hoe deze stappen in detail uit te voeren dan door ze gewoon te beschrijven. Gebruik om met deze procedure te beginnen een roerende gradiëntmixer met twee kamers die door een pomp wordt aangedreven om een lineaire of een hyperbolische poriegradiëntgel te werpen. Bereid oplossingen voor de mengkamer en reservoirkamer aan de voorzijde zoals beschreven in het tekstprotocol.Start de roerder en voeg 30 microliter APS en 2,5 microliter TEMED toe aan de oplossing in de voorkamer. Start vervolgens de pomp en open de voorklep. Voeg na ongeveer een minuut 90 microliter APS en vijf microliter temed toe aan de reservoirkamer en open de kamerverbinding.Laat de gel gedurende ten minste 24 uur bij kamertemperatuur langzaam en grondig polymeriseren om een homogene poriegroottegradiënt te genereren. Indien vochtig gehouden kan de gepolymeriseerde gel tot een week rechtop worden opgeslagen bij vier graden Celsius. Bereid vervolgens de laadsleuven voor door de juiste ruimten tussen de glasplaten in te voegen om tussen 0,5 en 2,0 milligram eiwit te scheiden.De sleuven moeten minstens drie centimeter breed zijn. Voor het uitvoeren van buffers, maak een staande kathode buffer bestaande uit 50 millimolar tricine, 50 millimolar Bis-Tris, en 0,01%Coomassie G-250. Maak een standaard anodebuffer bestaande uit 50 millimolar Bis-Tris.Verlossing ongeveer 2,5 milligram membraan en twee milliliter oplosbuffer met 1% niet-denatureringsmiddel op ijs gedurende 30 minuten. Dan ultracentrifuge op 130,000 keer G gedurende 11 minuten. Concentreer de solubilisaat op een korte 50%20%sucrose stap gradiënt door ultracentrifugatie op 400,000 keer G gedurende een uur.Oogst hierna het sacharosegradiënt van de onderkant van de buis, voeg 0,05%Coomassie G-250 toe aan de solubilisaat en laad het monster op de gel. Voer 's nachts een opposerende BN-PAGINA uit op 10 graden Celsius met behulp van een spanningsprotocol in drie stappen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat de gel heeft uitgevoerd scan de gels voor documentatie doeleinden terwijl het tussen de glazen platen.Inspecteer de kwaliteit van de gelscheiding. Vervolgens dissemble de platen en accijns op de lane secties van belang. Bevestig de rijstroken twee keer met 30% ethanol en 15% azijnzuur gedurende ten minste 30 minuten.Breng het monster van het inbedden van medium en laat het weken en equilibrate voor ten minste twee uur, terwijl de gel plaat in slow motion op een orbitale shaker. Snijd vervolgens de vaste gelbanen in secties die precies parallel lopen met het eiwitmigratiefront of het bandpatroon. Plaats elke sectie op een plastic folie ondersteuning met gelijke afmetingen voor een gemakkelijkere behandeling.Breng de rijstroken in een open buis met stoppers die zijn gesloten op de bodem en centraal geperforeerd aan de bovenkant, zowel precies uitgelijnd met de bovenste en onderste uiteinden van de gel sectie. Dompel de cilinder kort in de vloeibare stikstof om snel de stolling te initiëren. Het transparante inbeddingsmedium stolt binnen enkele seconden en wordt wit van kleur.Vul de holte met inbedding medium, kort dompel de cilinder in vloeibare stikstof, en laat het grondig bevriezen bij min 20 graden Celsius voor enkele uren. Verwijder na demontage de plastic folie en breng het blok met de ingebouwde gelsectie over naar een gekoelde metalen cilinder. De cilinder is groter in diameter en verzegeld aan de buitenkant met inbedding medium.Het is geplaatst op een platte ondersteuning. Vul de cilinder met inbedding medium en bevriezen grondig zoals eerder vermeld. Herhaal deze procedure met de andere kant van de cilinder om een solide blok met een coplanar bodemoppervlak te verkrijgen.Verwijder vervolgens het blok uit de cilinder en gebruik inbeddingsmedium om het op een voorgekoelde metalen houder te lijmen. Plaats de metalen houder in de cryoslicing machine. De houder moet zorgvuldig worden afgestemd op het snijvlak.Laat het blok op de optimale temperatuur van het snijproces in evenwicht brengen. Na deze oogst snijdt de gel de ene na de andere met een uiteindelijke gewenste dikte van 0,25 millimeter stapgrootte en breng ze individueel over op reactiebuizen met eiwitarme bindingseigenschappen. Vervolgens worden de segmenten onderworpen aan tryptische vertering en massaspectrometrische analyse.Dit protocol breidt de toepassing van complexe profilering met hoge resolutie uit op niet-mitochondriale membranen die laag-overvloedige eiwitten uitdrukken. Complexe scheiding toont sterk gekleurde eiwitbanden met zeer weinig migratieartefacten. Afwijkingen van peptide signalen in massa en retentie tijd wijzen op een zeer laag tarief voor vals-positieve piek volume toewijzing.Run-to-run variaties worden gemakkelijk geëlimineerd door het herschalen van de piek volume data sets. De resulterende peptide intensiteit informatie wordt vervolgens gebruikt om 2545 eiwitprofielen van relatieve overvloed te reconstrueren. De relevantie van de stapgrootte van de gelbemonstering voor de oplossing van eiwitcomplexen werd beoordeeld door datasets van aangrenzende plakjes samen te voegen.Op 0,25 millimeter, grootte scheiding van TPC1 geassocieerde complexe populaties is mooi in overeenstemming met de resultaten van de westelijke vlek analyse. Het samenvoegen van meer dan twee plakjes schaft discriminatie van TPC1-complexe subpopulaties af. Ten slotte geeft de analyse informatie over goed gekarakteriseerde complexen en toont het bestaan van nieuwe subeenheden en complexe samenstellingen aan.Voor ferritine wijzen de subeenhedenprofielen die zijn aangepast aan hun relatieve overvloed op het bestaan van ten minste drie complexe isovormen met verschillende zware/lichte kettingstoetassen. Nicalin-nomo1 complexen, het gamma-secretase kerncomplex en de GPI-transamidase-machines vertonen daarentegen vaste overvloedsratio's van hun kernsubeenheden over het gehele groottebereik en onafhankelijk van associatie met extra eiwitten. De belangrijkste parameter van csBN-MS-analyse is de effectieve oplossing van complexen, die wordt bepaald door monsterbiochemie, BN-gelkwaliteit, een goede uitlijning tijdens het inbedden en snijden, en de kwaliteit van de verkregen MS-gegevens.Het kammen van csBN-MS met isotopenetikettering van eiwitten en monsters zal een directe vergelijking mogelijk maken van complexomen in verschillende pathofysiologische, biologische of ontwikkelingstoestanden. csBN-MS uitgevoerd op membranen uit het knaagdierbrein onthulde de enorme diversiteit van receptoren, ionkanalen en transporters met betrekking tot hun subeenheidsamenstelling en hun functie, en het zal instrumenteel zijn voor het analyseren van de 3D-structuur in inheemse preparaten.

high-resolution-complexome-profiling-by-cryoslicing-bn-ms-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound...

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Een protocol voor het metabool profiel van biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie met behulp van een sheathless poreuze tip interface design wordt gepresenteerd.

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de scheiding, identificatie en karakterisering van proteoforms in EiwitSteekproeven met behulp van capillaire zone elektroforese-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (CZE-ESI-MS/MS). Het protocol kan worden gebruikt voor de hoge-resolutie karakterisatie van proteoforms in simple EiwitSteekproeven en de grootschalige identificatie van proteoforms in complexe Proteoom monsters.

Grootschalige topdown Proteomics met behulp van capillaire Zone elektroforese Tandem massaspectrometrie

Dit protocol beschrijft een interne doorvoer voor aanvullende analytische en omics technieken, culminerend in een volledig gekoppeld karakterisering van natuurlijke organische stof en microbiële proteomics in verschillende ecosystemen. Deze aanpak maakt robuuste vergelijkingen voor het identificeren van de metabolische banen en het transformaties die belangrijk zijn voor het beschrijven van de gasproductie van broeikasgassen en het voorspellen van reacties op veranderingen in het milieu.

Single-doorvoer complementaire High-resolution analytische technieken voor het karakteriseren van complexe natuurlijke organische stof mengsels

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de monstervoorbereiding bij het plannen van experimenten met MALDI MSI om metabole en moleculaire detectie in biologische monsters te maximaliseren.

Monstervoorbereiding voor metabole profilering met behulp van MALDI massaspectrometrie beeldvorming

Een nieuwe monstervoorbereidingsmethode wordt gedemonstreerd voor de analyse van op agar gebaseerde, bacteriële macrokolonies via matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatiebeeldvorming massaspectrometrie.

Onderzoek naar microbiële samenwerking via beeldvorming massaspectrometrie analyse van bacteriekolonies gekweekt op agar en in weefsel tijdens infectie

Dit protocol heeft tot doel celmetabolieten te behouden voor eencellige massaspectrometrie (SCMS) door het wassen van vluchtige zoutoplossingen, het snel afschrikken van vloeibare stikstof, vriesdrogen en opslag van -8 °C te combineren. Het toont aan dat het afschrikken van vloeibare stikstof essentieel is voor het behoud van metabolietprofielen, terwijl langdurige koude opslag tot een minimum moet worden beperkt om metabole veranderingen te voorkomen.

Monstervoorbereiding voor eencellige massaspectrometrie Metabolomics-onderzoeken: gecombineerd cellenwassen, afschrikken, drogen en bewaren

Leer cryoslicing BN-MS voor hoogresolutie complexoomprofilering van membraaneiwitten. Deze methode analyseert native eiwitcomplexen in diverse biologische monsters met minimale artefacten.

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Meer video's verkennen