Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Het centrale doel voor de ontwikkeling van de csBN-MS techniek was het verkrijgen van uitgebreide toegang tot de organisatie en assemblage van eiwitcomplexen die ten grondslag liggen aan signaaltransductie op en over het plasmamembraan van verschillende soorten weefsel en organen. csBN-MS biedt momenteel de hoogste resolutie veelzijdigheid voor de analyse van inheemse eiwitcomplex en hun subeenheid samenstelling, met name met betrekking tot membraaneiwitten. Hoewel de csBN-MS techniek werd ontwikkeld om complexe mengsels van membraan eiwit assemblages in knaagdier hersenen te analyseren kan het gemakkelijk worden aangepast aan de analyse van elk type biologisch monster.

Een van de belangrijkste stappen van onze methode is de inbedding van de gel stuk en de juiste uitlijning op het snijvlak voor het snijden. Wees voorzichtig niet te scheuren of om de gel te comprimeren en zorg ervoor dat het niet wordt gekanteld naar het snijvlak, omdat dit de resolutie van de analyse zou verminderen. Onze csBN-MS techniek heeft verschillende praktische stappen die cruciaal zijn voor goede resultaten.

Het is gemakkelijker om te laten zien hoe deze stappen in detail uit te voeren dan door ze gewoon te beschrijven. Gebruik om met deze procedure te beginnen een roerende gradiëntmixer met twee kamers die door een pomp wordt aangedreven om een lineaire of een hyperbolische poriegradiëntgel te werpen. Bereid oplossingen voor de mengkamer en reservoirkamer aan de voorzijde zoals beschreven in het tekstprotocol.

Start de roerder en voeg 30 microliter APS en 2,5 microliter TEMED toe aan de oplossing in de voorkamer. Start vervolgens de pomp en open de voorklep. Voeg na ongeveer een minuut 90 microliter APS en vijf microliter temed toe aan de reservoirkamer en open de kamerverbinding.

Laat de gel gedurende ten minste 24 uur bij kamertemperatuur langzaam en grondig polymeriseren om een homogene poriegroottegradiënt te genereren. Indien vochtig gehouden kan de gepolymeriseerde gel tot een week rechtop worden opgeslagen bij vier graden Celsius. Bereid vervolgens de laadsleuven voor door de juiste ruimten tussen de glasplaten in te voegen om tussen 0,5 en 2,0 milligram eiwit te scheiden.

De sleuven moeten minstens drie centimeter breed zijn. Voor het uitvoeren van buffers, maak een staande kathode buffer bestaande uit 50 millimolar tricine, 50 millimolar Bis-Tris, en 0,01%Coomassie G-250. Maak een standaard anodebuffer bestaande uit 50 millimolar Bis-Tris.

Verlossing ongeveer 2,5 milligram membraan en twee milliliter oplosbuffer met 1% niet-denatureringsmiddel op ijs gedurende 30 minuten. Dan ultracentrifuge op 130,000 keer G gedurende 11 minuten. Concentreer de solubilisaat op een korte 50%20%sucrose stap gradiënt door ultracentrifugatie op 400,000 keer G gedurende een uur.

Oogst hierna het sacharosegradiënt van de onderkant van de buis, voeg 0,05%Coomassie G-250 toe aan de solubilisaat en laad het monster op de gel. Voer 's nachts een opposerende BN-PAGINA uit op 10 graden Celsius met behulp van een spanningsprotocol in drie stappen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat de gel heeft uitgevoerd scan de gels voor documentatie doeleinden terwijl het tussen de glazen platen.

Inspecteer de kwaliteit van de gelscheiding. Vervolgens dissemble de platen en accijns op de lane secties van belang. Bevestig de rijstroken twee keer met 30% ethanol en 15% azijnzuur gedurende ten minste 30 minuten.

Breng het monster van het inbedden van medium en laat het weken en equilibrate voor ten minste twee uur, terwijl de gel plaat in slow motion op een orbitale shaker. Snijd vervolgens de vaste gelbanen in secties die precies parallel lopen met het eiwitmigratiefront of het bandpatroon. Plaats elke sectie op een plastic folie ondersteuning met gelijke afmetingen voor een gemakkelijkere behandeling.

Breng de rijstroken in een open buis met stoppers die zijn gesloten op de bodem en centraal geperforeerd aan de bovenkant, zowel precies uitgelijnd met de bovenste en onderste uiteinden van de gel sectie. Dompel de cilinder kort in de vloeibare stikstof om snel de stolling te initiëren. Het transparante inbeddingsmedium stolt binnen enkele seconden en wordt wit van kleur.

Vul de holte met inbedding medium, kort dompel de cilinder in vloeibare stikstof, en laat het grondig bevriezen bij min 20 graden Celsius voor enkele uren. Verwijder na demontage de plastic folie en breng het blok met de ingebouwde gelsectie over naar een gekoelde metalen cilinder. De cilinder is groter in diameter en verzegeld aan de buitenkant met inbedding medium.

Het is geplaatst op een platte ondersteuning. Vul de cilinder met inbedding medium en bevriezen grondig zoals eerder vermeld. Herhaal deze procedure met de andere kant van de cilinder om een solide blok met een coplanar bodemoppervlak te verkrijgen.

Verwijder vervolgens het blok uit de cilinder en gebruik inbeddingsmedium om het op een voorgekoelde metalen houder te lijmen. Plaats de metalen houder in de cryoslicing machine. De houder moet zorgvuldig worden afgestemd op het snijvlak.

Laat het blok op de optimale temperatuur van het snijproces in evenwicht brengen. Na deze oogst snijdt de gel de ene na de andere met een uiteindelijke gewenste dikte van 0,25 millimeter stapgrootte en breng ze individueel over op reactiebuizen met eiwitarme bindingseigenschappen. Vervolgens worden de segmenten onderworpen aan tryptische vertering en massaspectrometrische analyse.

Dit protocol breidt de toepassing van complexe profilering met hoge resolutie uit op niet-mitochondriale membranen die laag-overvloedige eiwitten uitdrukken. Complexe scheiding toont sterk gekleurde eiwitbanden met zeer weinig migratieartefacten. Afwijkingen van peptide signalen in massa en retentie tijd wijzen op een zeer laag tarief voor vals-positieve piek volume toewijzing.

Run-to-run variaties worden gemakkelijk geëlimineerd door het herschalen van de piek volume data sets. De resulterende peptide intensiteit informatie wordt vervolgens gebruikt om 2545 eiwitprofielen van relatieve overvloed te reconstrueren. De relevantie van de stapgrootte van de gelbemonstering voor de oplossing van eiwitcomplexen werd beoordeeld door datasets van aangrenzende plakjes samen te voegen.

Op 0,25 millimeter, grootte scheiding van TPC1 geassocieerde complexe populaties is mooi in overeenstemming met de resultaten van de westelijke vlek analyse. Het samenvoegen van meer dan twee plakjes schaft discriminatie van TPC1-complexe subpopulaties af. Ten slotte geeft de analyse informatie over goed gekarakteriseerde complexen en toont het bestaan van nieuwe subeenheden en complexe samenstellingen aan.

Voor ferritine wijzen de subeenhedenprofielen die zijn aangepast aan hun relatieve overvloed op het bestaan van ten minste drie complexe isovormen met verschillende zware/lichte kettingstoetassen. Nicalin-nomo1 complexen, het gamma-secretase kerncomplex en de GPI-transamidase-machines vertonen daarentegen vaste overvloedsratio's van hun kernsubeenheden over het gehele groottebereik en onafhankelijk van associatie met extra eiwitten. De belangrijkste parameter van csBN-MS-analyse is de effectieve oplossing van complexen, die wordt bepaald door monsterbiochemie, BN-gelkwaliteit, een goede uitlijning tijdens het inbedden en snijden, en de kwaliteit van de verkregen MS-gegevens.

Het kammen van csBN-MS met isotopenetikettering van eiwitten en monsters zal een directe vergelijking mogelijk maken van complexomen in verschillende pathofysiologische, biologische of ontwikkelingstoestanden. csBN-MS uitgevoerd op membranen uit het knaagdierbrein onthulde de enorme diversiteit van receptoren, ionkanalen en transporters met betrekking tot hun subeenheidsamenstelling en hun functie, en het zal instrumenteel zijn voor het analyseren van de 3D-structuur in inheemse preparaten.