Productie van E. coli-uitgedrukt zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes voor vaccins die een Trimere epitope presentatie vereisen

Zelfassemblageeianodeeltjes, of SAPN's, kunnen worden gebruikt om vaccins tegen verschillende infectieziekten te ontwikkelen. Deze methode die we hier beschrijven, kan worden gebruikt om SAPN's met een zes-helix-bundel te zuiveren, opnieuw te vouwen en te karakteriseren. Dit nanodeeltje kan trimerïsche antigenen presenteren in een native-achtige conformatie.

Met kleine wijzigingen kan deze methode worden toegepast op andere innovatieve SAPN-vaccinconstructies. Bovendien kan het gemakkelijk worden overgedragen op grootschalige productie voor klinische proeven. Voor de lysis van geoogste E.coli uitdrukken van de zes-helix bundel SAPN, gebruik maken van een sonde met de sonicatie output van 150 watt met vier seconden van sonicatie en zes seconden rust, om resuspended bacteriële pellets sonicate in 40 milliliter van imidazool-vrije buffer op ijs gedurende vijf minuten.

Centrifugeer het cellulaire lysaat om een verduidelijkt supernatant te genereren en breng het supernatant over naar een steriele kolf van 150 milliliter. Breng het monster vervolgens naar een eindvolume van 100 milliliter met verse imidazoolvrije buffer. Als u het eiwit van belang wilt isoleren, opent u de FPLC-software en klikt u op de optie Nieuwe methode.

Open in het menu Methode-instellingen het vervolgkeuzemenu Kolompositie en selecteer C1-poort 3. Selecteer Affiniteit in het vervolgkeuzemenu Getoond op techniek. Selecteer anderen, HisTrap HP en vijf milliliter in het vervolgkeuzemenu Kolomtype.

Het kolomvolume en de drukvakken worden automatisch ingesteld op de juiste waarden. Klik op Methodeomtrek en sleep de knoppen Equilibratie en Voorbeeldtoepassing, drie kolomwasknoppen en de knop Elution in het pop-upmenu Fasebibliotheek naast de pijl voordat u het menu Fasebibliotheek sluit. Klik op Evenwicht en stel de waarden in de tabel in op Initiële Buffer B, 4%Eindbuffer B, 4% en Kolomvolume, vijf.

Klik op Voorbeeldtoepassing. Klik in het vak Voorbeeldladen op de keuzerondje voor Voorbeeld injecteren op kolom met voorbeeldpomp en bevestig of het vakje naast de stroomsnelheid van methode-instellingen gebruiken is ingecheckt in het vak Voorbeeldinjectie met systeempomp. Wijzig de waarde van het vak Volume in 100 milliliter en het regeling voor het verzamelen van breuken in Enable.

Klik het vak Fractiegrootte gebruiken uit methode-instellingen en wijzig de fractiegrootte in vier milliliter. Klik op de eerste kolomwasknop, stel de waarden in de tabel in op Initiële Buffer B, 4%Eindbuffer B, 4% en Kolomvolume, 10. Klik op het vak Regeling Groep verzameling breuken inschakelen en schakel de grootte van de breuk gebruiken uit methode-instellingen uit.

Wijzig de fractiegrootte in vier milliliter en klik op de tweede kolomwasknop. Stel de waarden in de tabel in op Initiële Buffer B, 0%Eindbuffer B, 0% en Kolomvolume, vijf. Klik op het vak Regeling Groep verzameling breuken inschakelen en schakel de grootte van de breuk gebruiken uit methode-instellingen uit.

Wijzig de fractiegrootte in vier milliliter en klik op de knop Derde kolomwasknop. Stel de waarden in de tabel in op Initiële Buffer B, 0%Eindbuffer B, 0% en Kolomvolume, 10. Klik op de knop Regeling Groep verzamelingen en schakel de grootte van de breuk gebruiken uit methode-instellingen uit.

Verander vervolgens de fractiegrootte in vier milliliter. Klik op de knop Elution en klik met de rechtermuisknop op de informatie in de tabel. Klik in het pop-upmenu op Stap verwijderen en sleep de knop Isocratisch verloop twee keer naar de tabel, zodat er twee vermeldingen zijn.

Stel de waarde voor de eerste vermelding in op Initiële Buffer B, 30%Eindbuffer B, 30% en Kolomvolume, 10. Stel de waarde voor de tweede vermelding in op Initiële Buffer B, 100%Eindbuffer B, 100% en Kolomvolume, 10. Klik op de knop Regeling Groepsverzameling inschakelen en klik op het vak Fractiegrootte gebruiken uit methode-instellingen.

Klik vervolgens op Opslaan als en geef de bestandszuivering een naam. Plaats de pomp Een slang van de FPLC in de imidazoolvrije wasbuffer en de b-slang van de pomp in de 500-millimolar imidazool buffer. Plaats de buis van de monsterpomp in het monster van 100 milliliter en voer het zuiveringsprogramma uit.

Wanneer de 60% isopropanol wassen nodig is, pauzeer het programma, verplaats de pomp Een slang van de imidazool-vrije wassen in de 60% isopropanol wassen, en start het programma opnieuw. Aan het einde van de was, pauzeer het programma opnieuw, breng de pomp Een slang terug naar de imidazool-vrije wasbuffer en start het zuiveringsprogramma opnieuw. Om de zuiverheid van het gezuiverde eiwit te beoordelen, combineert u eerst de fracties van de stroom door, wast u één, wast u twee en wast u drie stappen in afzonderlijke conische buizen van 50 milliliter.

Meng vervolgens 15 microliter van elke monsterbuis met 15 microliters 2x Laemmli buffer in individuele 0,5 milliliter microcentrifugebuizen en ontatureer de monsters op 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Zet aan het einde van de incubatie een gelloopapparaat op met drie vlekvrije vier tot 20% prefab polyacrylamide gels in tris-Glycine SDS-PAGE loopbuffer. Laad acht microliter van moleculair gewicht marker aan de eerste put van elke gel en 30 microliter van gedenatureerd monster aan de andere putten.

Laat de gels op 200 volt lopen tot de kleurstofvoorzijde de onderkant van de gel raakt en spoel de gels kort af met gedeïsized water voordat ze onmiddellijk met een vlekvrij beeldvormingssysteem worden weergegeven. Identificeer vervolgens de breuken die eiwitbanden met de juiste grootte bevatten en verpool deze fracties. Voeg voor zes-helixbundel SAPN refolding 10 tot 20 milliliter gepoold eiwit toe aan een 10 kilodalton moleculair gewicht cut-off dialysecassette.

Dialyze de cassette in acht molaire ureum, 20-millimolar Tris, 5%glycerol en vijf millimolar TCEP bij kamertemperatuur 's nachts. De volgende ochtend, verlaag de ureumconcentratie in de dialysebuffer stapsgewijs met twee kies om de twee uur om langzaam dialyseren de ureum uit het monster. Wanneer de ureumconcentratie twee kiespunten bereikt, verplaatst u het dialyseapparaat naar vier graden Celsius en dialyseert u het monster in ureum van 120 millimolar, tris van 20 millimolar en 5%glycerol 's nachts om de refolding af te maken.

Haal de volgende ochtend het omgevouwen eiwit uit de cassette en filter de zes-helixbundel SAPN door een 0,22 micrometer polyvinylidene fluoride spuitfilter. Om de gemiddelde deeltjesgrootte van de zes-helix-bundel SAPN te meten, voegt u 45 microliters van zes-helix-bundel SAPN toe aan een wegwerp cuvette en plaatst u de cuvette in de DLS-machine. Maak vervolgens een nieuw meetbestand en voer een vooraf geschreven standaardwerkprocedure uit voor eiwit in 120-millimolar ureum, 20-millimolar Tris en 5%glycerolbuffer bij 25 graden Celsius.

Start vervolgens met de meting. De Z-gemiddelde grootte, de PDI en de distributieresultaten worden berekend voor elke run. De machine leest het monster vijf keer.

Deze volledig geassembleerde zes-helix bundel SAPN is gebouwd op eiwit sequenties die naar verwachting vouwen in een deeltje dat 60 kopieën van de monomeer bevat. Het totale cellysaat werd gebruikt om de zes-helixbundel SAPN monomeren door FPLC te zuiveren met behulp van een nikkelkolom, waaruit bleek dat het eiwit zowel 150 als 500 millimolar imidazool ontlokte. Het chromatogram toont ook twee andere pieken op 185 en 210 milliliter totaal volume dat overeenkomt met de isopropanol was en de imidazool-vrije was respectievelijk.

De fracties en de zuiverheid van het recombinant eiwit kunnen worden geïdentificeerd door gradiënt SDS-PAGE gels met het eiwit van belang voornamelijk gelegen in fractie 68 tot en met 79. Westerse vlekanalyse met anti-His en anti-167D4 antilichamen gaven aan dat de gepoolde fracties inderdaad het eiwit van belang waren. De vlekken toonden ook de aanwezigheid van de zes-helix bundel SAPN multimers.

De monsters die de eiwitmonomers van belang bevatten, werden door dialyse- en deeltjesgrootteverdeling in de volledig geassembleerde six-helix-bundel SAPN gevouwen door dialyse- en deeltjesgrootteverdeling. Visualisatie door transmissie elektronenmicroscopie bleek goed gevormde individuele zes-helix bundel SAPN deeltjes met de grootte verdeling verkregen uit de twee deeltjes dimensionering technieken. De belangrijkste stap in dit protocol is het opnieuw vouwen van de zes-helix bundel SAPN.

De juiste pH en ionische sterkte van de refolding buffer zijn essentieel. Met behulp van een isopropanolwas tijdens de zuivering konden we vervuilende LPS tot een zeer laag niveau reduceren. LPS kan echter verder worden verminderd met behulp van een anion uitwisseling kolom indien nodig.

Deze technologie kan eenvoudig worden aangepast voor menselijke toepassing. Een bacterie-uitgedrukte SAPN is al opgeschaald voor een komende fase 1/2a malaria klinische studie.