Name: Immunoglobuline G N-Glycan-analyse door Ultra-prestatie vloeistofchromatografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Leer ultra-prestatie vloeistofchromatografie voor analyse van IgG N-glycanen met hoge gevoeligheid en reproduceerbaarheid. Deze methode biedt specifieke informatie over glycanstructuren voor diagnostische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) en de Australische-Chinese samenwerkings beurs (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).

Alle onderwerpen die in het protocol zijn opgenomen, zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Capital Medical University, Peking, China12. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van elk onderwerp aan het begin van de studie.
1. IgG-isolatie
<ol><li>Bereid de chemicaliën inclusief bindende buffer (fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutraliserende buffer: 10x PBS (pH = 6,6-6.8), eluent: 0,1 M mierenzuur (pH = 2,5), neutraliserende oplossing voor eluent: 1 M Ammoniumbicarbonaat, opgeslagen buffer: 20% ethanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), reinigingsoplossing voor proteïne G: 0,1 M NaOH + 30% Propan-2-OL. Opmerking: het niveau van de pH is van cruciaal belang in dit protocol. De elutie van IgG vereist een zeer lage pH en er bestaat een risico op verlies van sialic zuren als gevolg van zure hydrolyse. Daarom komt elutie binnen enkele seconden, en de pH wordt snel hersteld naar neutraliteit, behoud van de integriteit van IgG en de sialic zuren.</li>
	<li>Bereid de monsters voor: ontdooit het bevroren plasma monster en centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 80 x g en laat de proteïne g monolithische plaat en de bovengenoemde chemicaliën gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Breng een 100 μL monster (dat kan worden gebruikt om 2x te detecteren om de eerste storing te voorkomen) over in een 2 mL Verzamel plaat (hier, in totaal zes standaardmonsters, één controlemonster [Ultra-zuiver water] en 89 plasma monsters zijn ontworpen voor 96 put platen en willekeurig toegewezen aan de plaat).</li>
	<li>Verdun de monsters met 1x PBS met 1:7 (v/v).</li>
	<li>Reinig een 0,45 μm-filterplaat met hydrofiele polypropyleen (GHP) met 200 μL ultrazuiver water (Herhaal 2x).</li>
	<li>Breng de verdunde monsters in de filterplaat en filtreer de monsters in de opvang plaat met behulp van een vacuümpomp (controle-vacuüm druk bij 266.6-399.9 PA).</li>
	<li>Bereiding van de proteïne G monolithische platen<ol>
<li>Gooi de opslag buffer weg.</li>
		<li>Reinig de monolithische platen met 2 mL ultrazuiver water, 2 mL 1x PBS, 1 mL 0,1 M mierenzuur, 2 mL 10x PBS, 2 mL 1x PBS (opeenvolgend) en verwijder vloeiende vloeistof met behulp van een vacuümpomp.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de gefilterde monsters over naar de proteïne G monolithische plaat voor IgG binding en reiniging en reinig vervolgens de monolithische platen met 2 mL 1x PBS (Herhaal de reiniging 2x).</li>
	<li>Elute IgG met 1 mL van 0,1 M mierenzuur en filtreer de monsters door de vacuümpomp in de opvang plaat, voeg vervolgens 170 μL van 1 M Ammoniumbicarbonaat toe aan de opvang plaat.</li>
	<li>Detecteer de IgG-concentratie met behulp van een absorptie spectrofotometer (optimale golflengte = 280 nm).<ol>
<li>Open de software en selecteer de proteïne-CY3 modus.</li>
		<li>Trek 2 μL Ultra zuiver water en laad het in het scherm en klik vervolgens op ' leeg ' in de software om het scherm te wissen (1x herhalen).</li>
		<li>Trek 2 μL Ultra zuiver water en laad het in het scherm en klik vervolgens op sample in de software om het ultrazuivere water te detecteren.</li>
		<li>Trek 2 μL IgG-monster en laad het in het scherm en klik vervolgens op voorbeeld in de software om het monster te detecteren.</li>
		<li>Trek 2 μL Ultra zuiver water en laad het in het scherm en klik vervolgens op leeg in de software om het scherm te wissen.</li>
		<li>Sluit de software. Opmerking: de formule voor het berekenen van de IgG-concentratie is als volgt: CIgG = extinctiecoëfficiënt x (13,7) x 1.000 μg/ml</li>
	</ol></li>
	<li>Zet de geëxtraheerde IgG droog in een oven bij 60 °C en bewaar de geëxtraheerde IgG (300 μL geëxtraheerd IgG voor 4 uur).<ol>
<li>Verwijder 300 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie groter is dan 1.000 μg/mL.</li>
		<li>Verwijder 350 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie tussen 500-1000 μg/mL ligt.</li>
		<li>Verwijder 400 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie tussen 200-500 μg/mL ligt.</li>
		<li>Verwijder 600 μL geëxtraheerde IgG als de concentratie kleiner is dan 200 μg/mL. Opmerking: de concentratie van IgG moet bij voorkeur > 200 μg/mL voor de daaropvolgende detectie. De gemiddelde hoeveelheid IgG moet bij voorkeur > 1200 μg zijn, die 2x kan worden getest voor het geval de eerste test mislukt.</li>
	</ol></li>
	<li>Reiniging van de proteïne G monolithische plaat voor hergebruik<ol>
<li>Was de plaat met 2 mL ultrazuiver water, 1 mL 0,1 M NaOH (voor het verwijderen van neergeprecipiteerde eiwitten), 4 mL ultrazuiver water en 4 mL 1x PBS (opeenvolgend) en verwijder vervolgens de vloeiende vloeistof met behulp van een vacuümpomp.</li>
		<li>Was de plaat met 2 mL ultrazuiver water, 2 mL 30% propaan-2-OL (voor het verwijderen van gebonden hydrofobe eiwitten), 2 mL ultrazuiver water en 4 mL 1x PBS (opeenvolgend) en verwijder vervolgens vloeiende vloeistof met behulp van een vacuümpomp.</li>
		<li>Was de plaat met 1 mL buffer (20% ethanol + 20 mm tris + 0,1 M NaCl) en voeg 1 mL buffer (20% ethanol + 20 mm tris + 0,1 M NaCl) toe aan de plaat en laat de plaat vervolgens bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. glycan vrijlating
<ol><li>Bereid de gedroogde IgG en bewaar de chemicaliën, waaronder 1,33% SDS, 4% Igepal (bewaren uit de buurt van licht), en 5x PBS bij RT.</li>
	<li>Bereid PNGase F enzym door verdunning 250 U enzym met 250 μL ultrazuiver water.</li>
	<li>Denaturatie van IgG<ol>
<li>Voeg 30 μL van 1,33% SDS toe en meng door vortexing, breng het monster 10 min in een oven van 65 °C, haal het uit de oven en laat 15 minuten rusten.</li>
		<li>Voeg 10 μL 4% Igepal toe en plaats het op de schud incubator gedurende 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijdering en afgifte van glycanen<ol>
<li>Voeg 20 μL 5x PBS en 30-35 μL 0,1 mol/L NaOH toe om een pH van 8,0 te reguleren en meng door vortexing. Voeg 4 μL PNGase F-enzym toe en meng door vortexing. Inincuberen voor 18-20 h in een waterbad van 37 °C.</li>
		<li>Zet de vrijkomende glycanen droog in een oven bij 60 °c voor 2.5-3,0 h.</li>
		<li>Bewaar de vrijgegeven glycanen bij-80 °c tot verdere meting. Opmerking: deze stap is van cruciaal belang. De sleutel tot ontwikkelen release is het verbeteren van de activiteit van het pngase F-enzym om de efficiëntie te maximaliseren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. glycan-etikettering en-zuivering
<ol><li>Bereid het 2-aminobenzamide (2-AB) etiketteer reagens met 0,70 mg 2-AB, 10,50 μL azijnzuur, 6 mg natrium cyanoborohydride (NaBH3CN) en 24,50 μL dimethylsulfoxide (DMSO) (totaal volume = 35 μL). Voeg vervolgens azijnzuur, 2-AB, en NaBH3cn in de DMSO in orde.</li>
	<li>Label de glycanen met behulp van 35 μL 2-AB etiketteer reagens, breng de gelabelde glycanen over naar de oscillator gedurende 5 minuten, zet deze over naar de oven voor 3 uur bij 65 °c en breng vervolgens 30 minuten over naar RT. Opmerking: de hele ontwikkelen-etiketterings stap moet worden uitgevoerd terwijl deze beschermd is tegen licht.</li>
	<li>Voorbehandelen van een 0,2 μm GHP filterplaat met 200 μL 70% ethanol, 200 μL ultrazuiver water, en 200 μL 96% acetonitril (4 °C), verwijder vervolgens afval met behulp van een vacuümpomp.</li>
	<li>Zuivering van 2-AB gelabelde ontwikkelen<ol>
<li>Voeg 700 μL 100% acetonitril toe aan de 2-AB met het label ontwikkelen en breng gedurende 5 minuten over op een schud incubator.</li>
		<li>Centrifugeer bij 134 x g gedurende 5 min (4 °c).</li>
		<li>Breng het monster gedurende 2 minuten over in een GHP-filterplaat van 0,2 μm en verwijder het filtraat (vloeiende vloeistof) met behulp van een vacuümpomp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was 2-AB gelabeld ontwikkelen met 200 μL 96% acetonitril (4 °c) en verwijder het filtraat (vloeiende vloeistof) met behulp van een vacuümpomp 5x-6x.</li>
	<li>Elute 2-AB gelabelde ontwikkelen met 100 μL Ultra zuiver water 3x.</li>
	<li>Breng de 2-AB met gelabelde ontwikkelen over in een oven om te drogen bij 60 °c gedurende 3,5 uur.</li>
	<li>Bewaar het gelabelde N-glycans bij-80 °c tot verdere meting.</li>
</ol>4. hydrofiele interactie chromatografie en analyse van glycanen
<ol><li>Conditionering van UPLC-instrumenten en voorbereiding van mobiele fasen<ol>
<li>Bereid mobiele fasen voor, inclusief oplosmiddel A: 100 mM ammonium formaat (pH = 4,4), oplosmiddel B: 100% acetonitril, oplosmiddel C: 90% ultrazuiver water (10% methanol) en oplosmiddel D: 50% methanol (Ultra zuiver water).</li>
		<li>Open de software om de mobiele fases te controleren.</li>
		<li>Wash UPLC instrumenten met een debiet van 0,2 mL/min (50% oplosmiddel B en 50% oplosmiddel C) balanceren gedurende 30 min, vervolgens bij een debiet van 0,2 mL/min (25% oplosmiddel A en 75% oplosmiddel B) balanceren gedurende 20 min, vervolgens een debiet van 0,4 mL/min Balancing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Los het gelabelde N-glycans op met 25 μL van een mengsel van 100% acetonitril en ultra zuiver water bij een 2:1 ratio (v/v). Centrifugeer vervolgens op 134 × g gedurende 5 min (4 °c) en laad 10 μL van het gelabelde N-GLYCANS in de UPLC-instrumenten.</li>
	<li>Scheid de gelabelde N-glycans met een debiet van 0,4 ml/min met een lineair stijgingspercentage van 75% tot 62% acetonitril gedurende 25 minuten. Voer vervolgens een analytische uitvoering uit door dextran kalibratie ladder/glycopeptide kolom op een UPLC bij 60 °C (hier worden monsters vóór de injectie op 4 °C gehouden).</li>
	<li>Detectie van N-glycan-fluorescentie bij excitatie en emissie golflengtes van respectievelijk 330 nm en 420 nm.</li>
	<li>Integreer de glycanen op basis van piekpositie en retentietijd.</li>
	<li>Bereken de relatieve waarde van elke Glycan piek (GP)/alle Glycan pieken (GPs) (percentage,%) als volgt: GP1: GP1/GPs * 100, GP2: GP2/GPs * 100, GP3: GP3/GPs * 100, etc.</li>
</ol>

<ol><li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics%2C+glycoproteomics+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).</li>
<li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Biology%22%5BJournal%5D)">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li>
<li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Glycosylation+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Antibodies%22%5BJournal%5D)">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392(2013).</li>
<li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65(2018).</li>
<li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598(2014).</li>
<li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841(2013).</li>
<li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779(2014).</li>
<li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuropsychopharmacology+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20(2014).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235(2018).</li>
<li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240(2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension%3A+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).</li>
<li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22GLYCOBIOLOGY%22%5BJournal%5D)">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).</li>
<li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).</li>
<li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).</li>
<li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

UPLC dient als relatieve kwantitatieve analysemethode5,15. De resultaten geven aan dat UPLC een stabiele detectietechnologie is met een goede reproduceerbaarheid en relatieve kwantitatieve nauwkeurigheid. De hoeveelheid glycanen in elke piek wordt uitgedrukt als een percentage van het totale geïntegreerde gebied met behulp van UPLC, wat de relatieve waarde is. De relatieve kwantificering verbetert de vergelijkbaarheid van de test monsters. Daarnaast worden 96 wel...

N-glycosylatie van menselijke eiwitten is een gemeenschappelijke en essentiële post-translationele modificatie1 en kan het optreden en de ontwikkeling van ziekten relatief nauwkeurig voorspellen. Vanwege de complexiteit van de structuur, wordt verwacht dat er meer dan 5.000 ontwikkelen structuren, het bieden van grote potentie als diagnostische en voorspellende biomarkers voor ziekten2. N-glycans gekoppeld aan immunoglobuline G (IgG) zijn essentieel gebleken voor de functie van IgG, en IgG N-glycosylatie neemt deel aan de balans tussen de Pro-en ontstekingsremmende systemen3. Differentiële IgG N-glycosylatie is betrokken bij ziekte ontwikkeling en progressie, die zowel een aanleg als een functioneel mechanisme dat betrokken is bij ziekte pathologie representeren. De ontstekings functie van IgG N-glycosylation is geassocieerd met veroudering, ontstekingsziekten, auto-immuunziekten, en kanker4.
Met de ontwikkeling van detectietechnologie worden de volgende methoden het meest gebruikt in hoge doorvoer glycomics: hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) Ultra-Performance vloeistofchromatografie met fluorescentiedetectie (UPLC-FLR), multiplex capillaire gel elektroforese met laser geïnduceerde fluorescentiedetectie (xCGE-LIF), matrix-geassisteerde Laser desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF-MS), en vloeibare chromatografie elektro spray massaspectrometrie (LC-ESI-MS) . Deze methoden hebben overwonnen eerdere tekortkomingen van lage flux, instabiele resultaten, en slechte gevoeligheid specificiteit5,6.
UPLC wordt veel gebruikt om de associatie te onderzoeken tussen IgG N-glycosylatie en bepaalde ziekten (d.w.z. veroudering7, obesitas8, dyslipidemie9, type II diabetes10, hypertensie11, ischemische beroerte12, en de ziekte van Parkinson13). In vergelijking met de andere drie bovengenoemde methoden heeft UPLC de volgende voordelen5,14. Ten eerste biedt het een relatieve kwantitatieve analysemethode en de gegevensanalyse die de totale gebieds normalisatie omvat, verbetert de vergelijkbaarheid van elk monster. Ten tweede zijn de kosten van apparatuur en vereiste expertise relatief laag, wat het gemakkelijker maakt om glycosylatie biomarkers in klinische toepassingen te implementeren en te transformeren. Hier gepresenteerd is een inleiding tot UPLC, zodat het meer op grote schaal kan worden gebruikt.

<table><tbody><tr><td>2-aminobenzamide, 2-AB</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well collectieplaat</td><td>AXYGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well filterplaat</td><td>Pol</td><td>0.45 um GHP</td><td></td></tr><tr><td>96-well monolithische plaat</td><td>BIA Separations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plate rotor</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumformiaat</td><td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Constant schuddende incubator/rocker</td><td>Zhicheng analytisch instrumentenfabriek co., Ltd, China</td><td>ZWY-10313</td><td></td></tr><tr><td>Dextran kalibratieladder/Glycopeptide kolom</td><td>Watts technologie Co., Ltd, China</td><td>BEH kolom</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumfosfaat</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrische ovens</td><td>Tester instrumenten Co., Ltd</td><td>202-2AB</td><td></td></tr><tr><td>Empower 3.0</td><td>Waters technologie Co., Ltd, Amerika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoProfile 2-AB Labeling kit</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hogesnelheid centrifuge</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koudcentrifuge</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koudkoelkast</td><td>Qingdao Haier Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manifold 96-well plaat</td><td>Watts technologie Co., Ltd, China</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q zuiver watermeter</td><td>Millipore Co., Ltd, Amerika</td><td>Advantage A10</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH tester</td><td>Sartorius Co., Ltd, Germany</td><td>PB-10</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td><td>4672100, 0.5-10&mu;l &amp; 10-100&mu;l &amp; 20-200&mu;l &amp; 1000&mu;l</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F enzym</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogeenfosfaat</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propaan-2-ol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumcyanoborohydride (NaBH3CN)</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td><td>B-500</td><td></td></tr><tr><td>Transfer vloeistofpistool</td><td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td><td>4672100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, Amerika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-lage temperatuur koelkast</td><td>Thermo Co., Ltd, Amerika</td><td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-prestatie vloeistofchromatografie</td><td>Watts technologie Co., Ltd, China</td><td>Acquity MLtraPerformance LC</td><td></td></tr><tr><td>Vacuümpomp</td><td>Watts technologie Co., Ltd, China</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Verdampingsmachine/Droger</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Germany</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China</td><td>NP-30S</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Tester instrumenten Co., Ltd</td><td>DK-98-IIA</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>MP200B</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoglobuline g n-glycan-analyse door ultra-prestatie vloeistofchromatografie

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics is een nieuwe subspecialiteit in het omics-systeem onderzoek dat een significant potentieel biedt bij het ontdekken van de volgende generatie biomarkers voor ziekte gevoeligheid, detectie van drugs doel en precisie geneeskunde. Alternatieve IgG N-glycans zijn gemeld bij verschillende gemeenschappelijke chronische ziekten en suggereerden veel potentieel in klinische toepassingen (d.w.z. biomarkers voor diagnose en voorspelling van ziekten). IgG N-glycans worden op grote schaal gekenmerkt door de methode van hydrofiele interactie chromatografie (HILIC) Ultra-Performance vloeistofchromatografie (UPLC). UPLC is een stabiele detectietechnologie met een goede reproduceerbaarheid en een hoge relatieve kwantitatieve nauwkeurigheid. Bovendien, de structuur van IgG N-ontwikkelen is duidelijk gescheiden, en ontwikkelen samenstelling en relatieve overvloed in plasma worden gekenmerkt.

Zoals weergegeven in Figuur 1, werden IgG N-glycans geanalyseerd in 24 initiële IgG ontwikkelen pieken (GPS) op basis van piekpositie en retentietijd. De N-glycan structuren zijn beschikbaar via massaspectrometrie detectie volgens een eerdere studie (tabel 1)15. Om ervoor te zorgen dat de resultaten vergelijkbaar waren, werd de totale oppervlakte-normalisatie toegepast, waarbij de hoeveelheid glycanen...

Immunoglobuline G (IgG) N-glycan wordt gekenmerkt met behulp van hydrofiele interactie CHROMATOGRAFIE UPLC. Daarnaast is de structuur van IgG N-glycan duidelijk gescheiden. Hier gepresenteerd is een inleiding tot deze experimentele methode, zodat het op grote schaal kan worden gebruikt in onderzoeksinstellingen.

Immunoglobuline G N-Glycan-analyse door Ultra-prestatie vloeistofchromatografie

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Ultra-performance vloeibare chromatografie is gevestigde technologie voor nauwkeurige analyse van IgG n-glycan Vanwege de gevoeligheid lijkt te zijn en het heeft de mogelijkheid om een specifieke informatie van glycan Deze methode is gemakkelijk te gebruiken en heeft het aantal verschillende relatief lage kosten van stappen, hoge reproduceerbaarheid De mogelijkheid om glycan isomers. De metingen van eiwitten in plasma kunnen aantrekkelijk zijn. in de geneeskunde.ook geassocieerd met IgG in glycose basis en dergelijke en biologische met de bevolking. Je weet dat van onzuivere toestand wordt gebruikt om IgG te testen in glycanen. Eigenlijk kan het n-glycanen van eiwitten testen.Dit is nodig in een grensoverschrijdend eiwit van twee zuivere toestand kan worden toegepast op het eiwit De OR experimenteel proces is relatief eenvoudig, terwijl het experimentele proces moet worden gestandaardiseerd. Het end-to-end experimentele proces duurt drie dagen om te werken, en de experimentele stappen moeten worden onthouden om de experimentele vaardigheden onder de knie te krijgen. Ontdooi om de monsters voor te bereiden, ontdooi het bevroren plasmamonster.Dan, centrifuge op 80 keer G gedurende 10 minuten. Laat het eiwit G monolithische plaat 30 minuten op kamertemperatuur. Breng 100 micrometer monster over in elke put van de twee-milliliter verzamelplaat.Voeg ultra zuiver water toe als één controlemonster. Verdun de monsters met één X PBS met één tot zeven volumeverhouding. Reinig een 0,45 micron hydrofiele polypropolene filterplaat met 200 microliter ultra zuiver water.Herhaal de reiniging twee keer extra. Breng de verdunde monsters over in de filterplaat en filtreer de monsters in de collectieve plaat met een vacuümpomp met druk op 266,6 tot 399,9 Pascals. Om het eiwit G monolithische platen te bereiden, gooi je eerst de opslagbuffer weg.Reinig de monolithische platen met twee milliliter ultra zuiver water, twee milliliter van één X PBS, een milliliter 0,17 molaire mierenzuur, twee milliliter 10 X PBS en twee milliliter van één X PBS sequentieel. Verwijder de volgende vloeistof met behulp van een vacuümpomp. Breng met behulp van een meerkanaalspipet de gefilterde monsters over naar de eiwit G monolithische plaat voor IgG binding en reiniging.Voeg vervolgens twee milliliter van één X PBS toe om de monolithische platen schoon te maken. Verwijder de PBS met behulp van een vacuümpomp en herhaal de reiniging twee keer. Illute IgG met een milliliter 0,17 molaire mierenzuur, en filter de monsters in de opvangplaat door vacuümpomp.Voeg vervolgens 170 microliter van één molar ammoniumbicarbonaat toe aan de verzamelplaat. Detecteer de IgG-concentratie met behulp van een absorptiespecttropetometer op de optimale golflengte van 280 nanometer. Plaats de geëxtraheerde IgG in een oven om drie uur lang op 60 graden Celsius te drogen.Bepaal het bedrag dat moet worden waargenomen op basis van de concentratie zoals beschreven in het manuscript, en bewaar het in min 80 graden Celsius. Verzamel de gedroogde IgG en bewaar chemicaliën, waaronder 1,33%SDS, vier procent IgePal en 5%PBS bij kamertemperatuur. Bereid indoglycosidase F enzym door verdunnen 250 eenheden enzym met 250 microliter van ultra zuiver water.Om de IgG te denatureren, voeg 30 microliters van 1,33% SDS toe en meng door vortexing. Breng het monster in een oven van 65 graden Celsius gedurende 10 minuten. Haal het vervolgens uit de oven en laat het 15 minuten afkoelen.Voeg 10 microliters van vier procent IgePal in hetzelfde monster, en plaats het op een schudden incubator voor vijf minuten. Voeg 20 microliter van vijf X PBS en 30 tot 35 microliter van 0,1 molaire natriumhydroxide toe om de pH tot 8,0 te reguleren en meng door vortexing. Voeg vier microliters van endoglycosidase F enzym, en meng door vortexing.Dan, incubeer voor 18 tot 20 uur in een 37 graden Celsius waterbad. De volgende dag, plaats de vrijgelaten gylcans in een oven op 60 graden Celsius te drogen voor twee en een half tot drie uur. Bewaar de release glycans op min 80 graden Celsius tot verdere meting.Bereid de twee amino benzimide labelen reagens met 24,5 microliter DMSO, 10,5 microliter azijnzuur, 0,7 milligram van twee amino benzimide, en zes milligram natriumcyanoborohydride. Vervolgens, in een donkere kamer, label de glycanen door het toevoegen van 35 microliter van twee amino benzimide etikettering reagens. Breng de gelabelde glcans vijf minuten naar een oscillator en breng het vervolgens drie uur naar de oven bij 65 graden Celsius.Daarna breng je het 30 minuten op kamertemperatuur. De IgG n-glycase, we zullen het labelen met om ontdekt te worden door de fluorescerende detectie van onzuivere toestand. Pretreat een 0,2 micron GHP filterplaat met 200 microliter van 70%ethanol, 200 microliters ultra zuiver water en 200 microliter van 96%aceto nitril bij vier graden Celsius.Verwijder vervolgens het afval met behulp van een vacuümpomp. Om de twee amino benzimide gelabeld glycans te zuiveren, voeg 700 microliters van 100% acetonitril aan het monster, en breng het naar een schudden incubator gedurende vijf minuten. Centrifuge op 134 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Breng de supernatent twee minuten naar een GHP-filterplaat van 0,2 micron en verwijder het filtraat met behulp van het vacuüm. Was de twee amino benzimide gelabeld glycan met 200 microliter van 96%acetonitril op vier graden Celsius, en verwijder het filtraat met behulp van een vacuümpomp vijf tot zes keer. Illute twee amino benzimide gelabeld glycan met 100 microliter van ultra zuiver water drie keer.Breng de twee amino benzimide gelabeld glycan in een oven te drogen op 60 graden Celsius voor drie en een half uur. Bewaar de gelabelde n-glycans bij min 80 graden Celsius tot verdere meting. Open eerst de software om de mobiele fasen te bedienen.Was UPLC-instrumenten met 50%solvent B en 50%solvent C bij de stroomsnelheid van 0,2 milliliter per minuut gedurende 30 minuten. Was vervolgens met 25%oplosmiddel A en 75%oplosmiddel B bij een debiet van 0,2 milliliter per minuut gedurende 20 minuten. Voeg vervolgens een stroomsnelheid van 0,4 milliliter per minuut toe.Los de gelabelde n-glycans op met 25 microliter van een mengsel van 100%acetonitril en ultra zuiver water met een volumeverhouding van twee tot één. Dan, centrifugeren op 134 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius, en gebruik een droge pijp om 10 microliters van de supernatent te laden in de UPLC-instrumenten. Scheid de gelabelde n-glycanen met een stroomsnelheid van 0,4 milliliter per minuut met een lineair verloop van 75% tot 62% acetonitril gedurende 25 minuten.Voer vervolgens een analytische uitgevoerd door Dexteran kalibratie ladder glycopeptide kolom op een UPLC op 60 graden Celsius. Detecteer n-glycan fluorescerende stoffen bij X citatie en emissiegolflengten van respectievelijk 330 nanometer en 420 nanometer. Zoals blijkt uit deze figuur, IgG n-glycanen werden geanalyseerd in 24 initiële IgG glycan pieken op basis van piekpositie en retentietijd.De n-glycan structuren zijn verkrijgbaar in 24 soorten door middel van massaspectrometrie detectie. Om de herhaalbaarheid en stabiliteit van de methode te insten, werd het standaardmonster zes keer parallel getest. De glycan pieken met relatief kleine proporties vertoonden hoge meetfouten van meer dan 10% van de variatiecoëfficiënt.In het stuk en belangrijk voor de vorming van een gevestigde van IgG n-glycan structuur, met name voor de oprichting van terminal Daarom, in plaats van 3,3 IgG n-glycase gevonden in is van cruciaal belang in dit het belang van IgG. Glycans uit staan bekend als anders. Met de ontwikkelingen in glycan prototomics, gecombineerd in glycanen om informatie te verkennen om dit zodanig dat Het kan worden gebruikt als een potentieel voor de diagnose van vandaag.Na deze techniekontwikkeling biedt het een nieuwe manier om de

immunoglobulin-g-n-glycan-analysis-ultra-performance-liquid

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een specifieke en gevoelige methode om inzicht te krijgen in de expressie profiel van glycosfingolipiden antigenen in het immuunsysteem organen en cellen wordt beschreven. De methode maakt gebruik van de ion trap massaspectrometrie waardoor stapsgewijze versnippering van glycosfingolipiden moleculen voor structurele analyse in vergelijking met chemisch gesynthetiseerde standaard.

Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

This video demonstrates the principle of separation of hydrophilic polar compounds using hydrophilic interaction liquid chromatography. This technique helps in the purification of various polar analytes, including N-glycans.

Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography: A Technique to Separate Hydrophilic Polar Analytes Using Hydrophilic Beads

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Dit artikel presenteert een verbeterde vorm van een nieuwe bottom-up glycomische techniek die is ontworpen om het gepoolde samenstellingsprofiel van glycanen in niet-gefractioneerde biofluiden te analyseren door de chemische afbraak van glycanen in hun samenstellende bindingsspecifieke monosacchariden voor detectie door GC-MS. Mogelijke toepassingen omvatten vroege detectie van kanker en andere glycan-beïnvloedende aandoeningen.

Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics

Een sialoglycan microarray test kan gebruikt worden om anti-Neu5Gc antilichamen in humane sera te evalueren, waardoor het een potentiële diagnostische test voor kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde menselijke ziekten is.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay

Dit werk toont het potentieel van gedrukte glycan matrix (PGA) technologie voor de analyse van de circulerende anti-koolhydraten antistoffen bij kleine dieren.

Gedrukte Glycan Array: Een gevoelige techniek voor de analyse van het Repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren

Een gedetailleerd protocol voor de zuivering en daaropvolgende analyse van een monoklonaal antilichaam uit geoogste celkweek vloeistof (HCCF) van geautomatiseerde microbioreactoren is beschreven. Het gebruik van analyses om kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) te bepalen en beperkt sample volume te maximaliseren om vitale informatie te extraheren wordt ook gepresenteerd.

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Het glycosyleringspatroon van een antilichaam bepaalt de klinische prestaties, dus industriële en academische inspanningen om glycosylatie te beheersen blijven bestaan. Omdat typische glyco-engineeringcampagnes tijd- en arbeidsintensief zijn, zou het genereren van een snel protocol om de impact van glycosyleringsgenen te karakteriseren met behulp van transiënte uitschakeling nuttig zijn.

Snelle antilichaamglycosengineering in ovariumcellen van Chinese hamsters

Dit protocol beschrijft de glycomics-geleide glycoproteomics-methode, een geïntegreerde omics-technologie die uitgebreide inzichten biedt in het heterogene glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen die nodig zijn om de glycobiologie van kankers beter te begrijpen.

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen 

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de afgifte van O-glycanen uit mucines en de daaropvolgende ontzouting, permethylering en analyse met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie.

Profilering van gepermethyleerde mucine O-glycanen met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie Time-of-flight massaspectrometrie

Leer ultra-prestatie vloeistofchromatografie voor analyse van IgG N-glycanen met hoge gevoeligheid en reproduceerbaarheid. Deze methode biedt specifieke informatie over glycanstructuren voor diagnostische toepassingen.

Immunoglobuline G N-Glycan-analyse door Ultra-prestatie vloeistofchromatografie

Meer video's verkennen