Karakteriseren van individuele eiwit aggregaten door infrarood nano spectroscopie en Atoom kracht microscopie

Methoden op basis van atomaire kracht microscopie maken het mogelijk om biomoleculaire processen op nanoschaal te karakteriseren met morfologische chemische of structurele resolutie, eindelijk het openen van een nieuwe voorste venster van observatie op de biologie. Methoden van één molecuul maken indringende zeer heterogene systemen mogelijk, een kenmerk dat bijzonder relevant is voor het begrijpen van eiwitaggregatie. Door het combineren van enkele moleculen met rugbenaderingen, kunnen we fundamentele informatie verkrijgen over het gedrag van eiwitten, hun banden met menselijke ziekte en het ontwerpen van farmacologische interventies die succesvol kunnen zijn.

Bovendien kan deze methode met succes worden toegepast om de chemische en structurele eigenschappen van biomaterialen voor de levering van geneesmiddelen, toepassingen en andere biotechnologische doeleinden te bestuderen. Het kan in eerste instantie een uitdaging zijn om de juiste AFM-parameters voor hoge resolutie in te stellen en het is eenvoudig om uw AFM in te stellen tijdens het meten van uw fibrillar aggregaten. Schakel 30 minuten voor de afm-beeldvorming het AFM-systeem in en klik op instellen en sonde.

Klik in het venster voor het wijzigen van de sonde naast de focusfase van Z. Schakel de AFM-balkschakelaar uit als deze is ingeschakeld en ontgrendel de zwaluwstaartsloten. Koppel het hoofd los van het systeem en klik in het venster voor het wijzigen van de sonde op de volgende.

Monteer de AFM cantilever op de sondehouder. Sluit het hoofd aan op het systeem en vergrendel de zwaluwstaartsloten. Schakel de AFM-laserstraalschakelaar in en klik in het venster voor sondewisselaar op volgende.

Klik in het pop-upvenster op nee als het cantilever-type niet is gewijzigd en pas de optische uitlijnknoppen aan om de cantilever te vinden. Pas de focus aan op de cantilever en klik vervolgens. Klik in het pop-upvenster op ja als de focus op de cantilever ligt.

Gebruik de detectie laserstraalknoppen om de laserstraal aan het einde van de cantilever te plaatsen. Gebruik de afgebogen laserstraalknoppen om het totale signaal gemeten door de vier kwadrantfotodiode te maximaliseren tot ten minste één volt. Klik in het venster voor het wijzigen van de sonde op volgende en sluit.

Na 15 minuten wachten op de cantilever om thermische stabiliteit te bereiken, pas indien nodig de positie van de afgebogen laserstraal aan op de positiegevoelige fotodode. Klik op NCM sweep, selecteer de gewenste amplitude van oscillatie, klik op fase gebruiken en klik op automatisch. Stem de cantilever dicht bij het maximum van zijn eerste vrije resonantie van oscillatie af op ongeveer 300 kilohertz voor een cantilever met een veerconstante van 40 newton per meter.

Plaats het monster op de monsterhouder. Klik op scangebied en stel de resolutie in op 256 bij 256 en 1024 bij 1024 pixels en stel vervolgens de scangrootte en het pixelnummer in. Stel de scansnelheid in op 0,3 op één hertz voor een scangebied van één bij vijf bij vijf micrometer in het kwadraat.

Richt de optische weergave op het monster en klik op de aanpak om het monsteroppervlak te benaderen. Klik vervolgens 100 micrometer optillen om de AFM-tip 100 micrometer boven het oppervlak van het monster te verhogen en klik op uitzetten op het optische beeld van het monster. Klik op de focusfasebalk om de weergave op het oppervlak van het monster te richten en gebruik de pijlen om in het gebied van het interessant voorbeeld te bewegen.

Klik op de aanpak om het oppervlak te betrekken en klik op de lijn scan om te controleren of de tip is na het oppervlak goed. Pas het instelpunt zo nodig aan. Klik vervolgens op scannen om te beginnen met het beeldvorming van het monsteroppervlak, met behoud van een constant regime van faseverandering dat niet hoger is dan delta 20 tijdens de beeldvorming om een grote beeldvormingskracht te voorkomen en om de consistentie tussen onafhankelijke monsters te behouden.

Voor IR nanospectroscopie beeldvorming, 30 tot 60 minuten voor de analyse, schakelt u het AFM IR-systeem en de IR-laser in. Open de ingebouwde software om het instrument te bedienen en klik op bestand en nieuw om een nieuw nano-IR-bestand te openen. Klik op initialiseren om het AFM IR-systeem te starten en open de instrumentenhoes.

Monteer een siliconen goud gecoate sonde met een nominale straal van 30 nanometer en een veerconstante van 0,2 newton per meter op het AFM IR-systeem om het monster in contactmodus te meten. Klik op laden in de sectie AFM-sonde en vervolgens. Gebruik de focus op sondepijlen om de camera op de cantilever te richten en gebruik de punt om het vizier te kruisen om het vizier aan het einde van de cantilever te plaatsen.

Draai de knoppen die de positie van de detectielaser regelen om de laser aan het einde van de cantilever te plaatsen. Draai de laserknoppen om de som te detecteren en te maximaliseren die door de vier kwadrantfotodode wordt gemeten tot een waarde groter dan drie volt. Draai de afbuigingknop om de afbuiging van de cantilever aan te passen op min één volt en klik vervolgens.

Sluit vervolgens de cover van het instrument. Gebruik de focus op sondepijlen om de camera op het monster en de tip te richten om pijlen te kruisen om in het gebied van belang van het monster te bewegen. Klik op volgende en engageer.

Selecteer in het microscoopvenster de hoogte voor morfologie, amplitude twee voor de IR-absorptie- en PLL-frequentie om de tip naar monstercontactresonantie in kaart te brengen. Stel in de sectie AFM-scan de parameters in zoals aangetoond voor de AFM-beeldvorming en klik op scan om een morfologiekaart te verkrijgen. Wanneer de morfologietoewijzing is voltooid, klikt u in het microscoopvenster op de hoogtekaart om de sonde op de bovenkant van één aggregaat te plaatsen.

Klik in de nano-IR-sectie op start-IR om het monster te verlichten met de IR-laser. Als u de infraroodlaser op de cantilever wilt richten, klikt u op optimaliseren en voert u 1655 centimeter in voor het golfnummer. Klik op toevoegen en scannen om de IR-laserpositie te bepalen en klik op update en oke om de positie uit te lijnen met de cantilever.

Voer in de algemene sectie een golfnummer in waarvoor een hoge absorptie in het relatieve veld wordt verwacht en schakel de optie filter van de bandpas uit. Klik op start IR en controleer de meterstand en de FFT van de cantileverrespons. Verplaats in het FFT-venster de groene cursor om de resonantiefrequentie van de cantilever te lezen.

Een typische waarde van FFT van de resonantie van de cantilevers is rond 200 kilohertz. Voer de gegenereerde resonantiefrequentiewaarde in de algemene sectie in het frequentiecentrumveld in en gebruik een frequentievenster van 50 kilohertz. Klik op laserpuls tune venster om de resonantie verbeterde modus te selecteren en stel een hartslag van 222 kilohertz, een tune bereik van 50 kilohertz en een laser duty cyclus van 5%Klik te verwerven om de hartslag van de laser te vegen.

Gebruik de cursor om de laserpuls af te stemmen op de frequentie van de mechanische respons van de thermische uitzetting van het monster dat het IR-licht absorbeert. Selecteer vervolgens fase vergrendelde lus om de contactresonantie tussen het monster en de tip te controleren en klik op nul. Voor andere chemische eigenschappen op nanoschaal volgt u de contactresonantie tijdens de spectra-verwerving om ervoor te zorgen dat het monsterspectrum niet wordt beïnvloed door oververhitting en verzachting.

Selecteer inschakelen om het monster bij te houden om contactresonantie tip en selecteer een integrale versterking van 0,5 en een proportionele versterking van 10 en klik vervolgens op OK. Klik in het venster optimaliseren op de golflengte en scan om de IR-laser te lokaliseren voor ten minste drie golfnummers die overeenkomen met grote absorptiebanden van het monster en voor ten minste één golfnummer voor elke chip van de laser. Klik op gereedschappen, IR-achtergrondkalibratie en nieuw en stel de golfnummers in op 1200 tot 1800 centimeter. Stel de achtergronden op gemiddeld op een, de taak cyclus van 5%en de veegsnelheid op 100 centimeter in het kwadraat.

Klik op acquire om de IR-laserachtergrond te meten voor normalisatie van de gemeten nanoschaal gelokaliseerde spectra, sla het bestand op en sluit het venster. Selecteer in de IR-spectra-instellingen een IR-spectrumresolutie tussen één en vier centimeter en een aantal cogemiddelden van ten minste 64 keer. Klik vervolgens op acquire om een nanoschaal gelokaliseerd IR-spectrum in het eiwitbereik te meten.

Als u een nanoschaal opgelost chemische kaart te verwerven, selecteert u 1655 centimeter en IR-beeldvorming en klik op scannen in de AFM-scanvenster. Wanneer de toewijzing is voltooid, slaat u de metingen op. Gebruik vervolgens de ingebouwde AFM-beeldverwerkingssoftware om de verworven kaarten van morfologie, contactresonantie en chemie en gelokaliseerde spectra op nanoschaal te analyseren.

Het is een cruciale stap om een zeer zuivere monomeeroplossing te verkrijgen, omdat de aanwezigheid van geaggregeerde soorten kan resulteren in een slechte reproduceerbaarheid van kinetiek en artefacten in uw metingen kan introduceren. Een fundamentele factor voor het succesvol bestuderen van biologische monsters met een hoge heterogeniteit is de juiste positie van vaste substraten. Microfluïde spray afzetting kan worden benut in plaats van handmatige een om de monsterarchitectuur en heterogeniteit te behouden.

Deze methoden effenen de weg voor het ontrafelen van de chemische structuur en eigenschappen van individuele biomoleculen en hun interacties in fysiologische en inheemse vloeibare omgeving.