Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

Deze methode helpt bij het overwinnen van beperkingen bij het bestuderen van menselijke hematopoietische ontwikkeling door het verstrekken van een eenvoudige en aanslepende in vitro platform op basis van directe cel herprogrammering. Visuele demonstratie van deze methode zal ideale begeleiding bieden in fundamentele stappen om menselijke hemogene cellen te genereren, namelijk tijdens de lentivirale productie, fibroblast transductie en celkweek. Door huidfibroblasten om te zetten in hemogene precursoren, hopen we patiëntspecifieke hematopoietische stam- en voorlopercellen in voldoende aantallen te genereren voor stamceltransplantatie.

Begin met het kweken van HEK293T cellen in een 100 millimeter weefselkweek behandelde schotel met 10 milliliter volledige DMEM bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide tot samenvloeiing. Op de dag voorafgaand aan de transfectie, na het aspireren van het medium, was de schotel zorgvuldig met vijf milliliter PBS en maak de cellen los met 1,5 milliliter dissociatieoplossing. Na vijf tot tien minuten uitbroeden bij 37 graden Celsius, activeer de oplossing met drie milliliter complete DMEM en breng de celsuspensie over naar een conische buis van 15 milliliter.

Was de schotel met 5 milliliter complete DMEM om de resterende aangesloten cellen te verwijderen en trek de was met de celoplossing. Verzamel de cellen door centrifugatie, aspirate de supernatant en resuspend de pellet in zes milliliter van volledige DMEM. Splits de suspensie vervolgens gelijkmatig over zes 100 millimeter weefselkweek behandelde gerechten in een uiteindelijk volume van 10 milliliter complete DMEM per gerecht.

De volgende dag, voeg 10 microgram totale massa van de drie overdracht plasmiden samen aan een nieuwe 15 milliliter conische buis. Voeg vervolgens 10 microgram van de tweede generatie psPAX2-verpakkingsvector toe die de gag-, pol-, tat- en toerengencodeert, gevolgd door de toevoeging van vijf microgram pMD2. G envelop vector codering van de VSV-G gen aan de buis.

Voeg ten slotte water toe om het uiteindelijke volume op 500 microliters te brengen. Voeg in twee nieuwe 15 milliliter conische buizen 10 microgram FUW-M2rtTA plasmide, 10 microgram van de verpakkingsvector en vijf microgram van de envelopvector aan elke buis toe. Voeg vervolgens water toe tot een eindvolume van 500 microliters aan elke buis.

Voeg vervolgens 62,5 microliter van twee molaire calciumchloride toe aan elk van de drie buizen en gebruik een pipetcontroller die is uitgerust met een Pasteur Pipet om bubbels in elk mengsel vrij te geven. Terwijl de bellen zich vormen, voeg 500 microliters van BES gebufferde zoutoplossing dropwise tegen de Pasteur Pipet en op het mengsel. Broed de buizen minstens 15 minuten op kamertemperatuur tot de mengsels licht troebel lijken.

Vervang tijdens incubatie de supernatant van de HEK293T celculturen zorgvuldig door 10 milliliter complete DMEM zonder antibiotica. Verdeel de DNA-complexen dropwise over individuele HEK293T celkweekgerechten en incubbate gedurende 24 uur. De volgende dag, vervang de supernatants met vier milliliter van volledige DMEM per cultuur en breng de gerechten terug naar een 37 graden Celsius 5%koolstofdioxide cel cultuur incubator 's nachts.

De volgende ochtend, verzamel de supernatants in een 50 milliliter buis per schotel en voeg vier milliliter vers medium aan elk gerecht. Na nog acht uur cultuur, zwembad de supernatant in elk gerecht met de eerder geoogste supernatant en voeg vier milliliter vers medium. Breng de gerechten 's nachts terug naar de couveuse van de celcultuur en verzamel de supernatants nog een laatste keer.

Wanneer al het virus is verzameld, filter elke lentivirale supernatant door middel van een 0,45 micrometer laag eiwitbindend filter in individuele buizen en voeg een maximum van 15 milliliter gefilterde supernatant aan individuele centrifugale filter eenheden voor centrifugatie. Gooi de stroom door. In de filterunit blijft een stroperig lentivirus met vloeistof achter.

Wanneer alle lentivirale supernatant is gefilterd aliquot 50 tot 200 microliter van de geconcentreerde lentivirussen voor koude opslag. Voordat u met de herprogrammeringsprocedure begint, code een behandelde plaat van zes goed weefselkweek met 500 microliters van 0,1% gelatine per put en de plaat gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius uitbroeden. Aan het einde van de incubatie, aspirate de resterende gelatine oplossing.

Plaat menselijke dermale fibroblasten bij een dichtheid van 1,5 keer tien tot de vijfde cellen per plaat in twee milliliter van volledige DMEM per put en incubeer 's nachts. De volgende ochtend, vervang het medium in elke put met twee milliliter van volledige DMEM aangevuld met acht microgram per milliliter polybrene en voeg een een tot een mengsel van zwembad geproduceerde transcriptie factor lentivirussen en M2rtTA in een nieuwe microcentrifuge buis. Vervolgens de fibroblast omzetten met een optimaal volume van het lentivirale mengsel, tussen 10 tot 100 microliter per put.

Na 16 uur incubatie, vervang de supernatants met volledige DMEM en breng de cellen terug naar de celcultuur incubator voor zes tot acht uur. Vervang na het herstel de supernatants door twee milliliter complete DMEM aangevuld met polybrene en voer een tweede transductie uit zoals net is aangetoond. Vervang aan het einde van de tweede transductieincubatie de supernatants door volledige DMEM aangevuld met één microgram per milliliter doxycycline en breng de plaat 48 uur terug naar de celkweek incubator.

Aan het einde van de incubatie, split elke put op een een tot twee verhouding en replate cellen in twee milliliters per put van hematopoietisch medium aangevuld met doxycycline in een nieuwe gelatine gecoate zes put plaat. Om een voldoende aantal cellen te verkrijgen voor chromatine immunoprecipitatie sequencing analyse, plaat drie keer 10 tot de vijfde fibroblasten in een gelatine gecoate zes put plaat en incubaat 's nachts. Aan het einde van de incubatie transplantatie, transduce cellen tweemaal in twee opeenvolgende dagen met 10 tot 20 microliter van lentivirus met de individuele factoren van belang of een pool van de drie factoren plus FUW-M2rtTA op een een-op-een verhouding.

16 uur na de tweede transductie, verwijder het virus dat supernatant bevat en ontcubeer de cellen in volledige DMEM gedurende 24 uur. Aan het einde van de incubatie, replate de inhoud van elke put in individuele gelatine gecoate 100 millimeter weefsel cultuur behandelde gerechten met volledige DMEM tot een uiteindelijk volume van 10 milliliter medium per schotel, en de cellen terug te keren naar de celcultuur incubator. Na zes dagen, vervang de supernatant met volledige DMEM aangevuld met doxycycline.

Breng de culturen terug naar de couveuse voor nog eens twee dagen. Zoals deze representatieve cytometriepercelen aantonen, drukt ongeveer 17% van de geherprogrammeerde cellen zowel CD49f als CD9 uit na 25 dagen herprogrammering. De meerderheid van de dubbele positieve cellen uiten CD143 en een kleine bevolking express CD34, wat wijst op een dynamische hemogene lot inductie.

Deze markers worden niet geactiveerd in M2rtTA getransduceerde menselijke dermale fibroblasten gekweekt voor 25 dagen. Immunofluorescentie beeldvorming bevestigt de expressie van CD9 en CD143 in aanhangende en ronde cellen die morfologisch onderscheiden zijn van fibroblasten, die negatief zijn voor deze markers. Brightfeild imaging wordt uitgevoerd om celvloeiing, morfologie en kolonievorming te visualiseren tijdens het herprogrammeringsproces.

Singlecell RNA sequencing analyse van geherprogrammeerde cellen onthult een stapsgewijze toename van cd49f, CD9 en CD143 expressie van dag twee tot 25. Na chromatine immunoprecipitatie, Genome Browser profielen toont GATA2 bindend voor genomische regelgevende regio's van ITGA6 en ACE wanneer fibroblasten worden gecotransduceerd met de drie factoren of GATA2 individueel. Het volume van antivirale deeltjes toegevoegd aan de cultuur moet worden geoptimaliseerd voor een succesvolle herprogrammering zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid van de cel.

Dit platform kan worden gekoppeld aan farmacologische remming en genoom-schaal screening technologieën, zoals CRISPR-Cas9, om nieuwe regelgevers van de menselijke definitieve hematopoiesis te definiëren. Deze directe herprogrammeringsbenadering zal onderzoekers in staat stellen nieuwe vragen op het gebied van menselijke ontwikkelingshematopoiesis te verkennen en mechanismen te ontcijferen die ten grondslag liggen aan de specificatie van menselijke hematopoietische stamcellen. Het is belangrijk om antivirale inzamelingen en transducties uit te voeren in een laminaire stroomkap die is gewijd aan lentivirale werkzaamheden en om viraal verontreinigd afval in een geschikte container te verwijderen.