Enkele Synapse indicatoren van glutamaat release en opname in acute hersenen plakjes van normale en Huntington muizen

Hoge resolutie beeldvorming van enkele synapsen uitdrukken van een snelle glutamaat sensor maakt een detectie van lokale mismatch tussen zender release en opname. In het geval van ziekte kan deze methode worden gebruikt om disfunctionele synapsen te identificeren. Voor autofluorescentie correctie, ten eerste, plaats een hersenschijf van de muis van belang in de opnamekamer van een one-photon microscoop.

Dompel het plakje onder in zuurstofrijk, kunstmatig hersenvocht en gebruik de 20x wateronderdompeling doelstelling om het dorsale striatum te lokaliseren. Bevestig de plakjes met een nylon rooster op een platina harp om de weefselbeweging te minimaliseren en schakel over naar de 63x wateronderdompelingsdoelstelling. Met behulp van een high pass filter op 510 nanometer, het verwerven van een beeld van de autofluorescentie en glutamaat sensor positieve structuren samen.

Met behulp van een high pass filter op 600 nanometer, het verwerven van een tweede beeld van de autofluorescent structuren alleen. Als u het bereik wilt definiëren, gebruikt u de gemiddelde intensiteiten van de 10 helderste en 10 donkerste pixels om de rode en gele afbeeldingen te schalen. Voer vervolgens een aftrekking uit van de gele minrode afbeelding en schaal de afgetrokken afbeelding opnieuw om een standaard 8-bits TIFF-bestand te genereren voor een handige visualisatie van de bouton van belang.

Om een zoektocht uit te voeren naar responsieve boutons, heb je een geschikte glazen micropipet nodig voor elektrische stimulatie. Gebruik een micropipette trekker om stimulatie pipetten te produceren van borosilicaat glazen haarvaten met interne tipdiameters van ongeveer een micrometer. Als u wilt onderzoeken naar mogelijke afhankelijke afgifte van glutamaat uit een reeks kandidaat-boutons, selecteert u een 63x-vergroting en een emissiefilter van 510 nanometer.

Laad de afgetrokken afbeelding om de plaatsing van een glazen stimulatieelektrode naast een fluorescerende spataderen toe te staan, waardoor de nabijheid van extra axonen wordt vermeden. In welke spaties geassocieerd met een maximale splitsing of toewijzing binnen een dieper deel van het segment. Plaats de stimulatieelektrode in de buurt van de bouton van belang en schakel het licht uit, omdat de opnames in volledige duisternis moeten worden uitgevoerd.

Schakel vervolgens het multi-channel badtoepassingssysteem in, waarbij het ene kanaal de standaardbadoplossing levert en de andere kanalen die de nodige blokkers van de ionenkanalen, transporters of membraanreceptoren leveren, inclusief tetrototoxine om de potentiële productie van actie te blokkeren. Controleer de stroom op de plaats van opname en zet de stimulator aan om depolariserende stroompulsen van twee tot 10 microamps aan de stimulatiepipet te leveren. De release wordt nu geactiveerd door directe calcium instroom via spanning gated kanalen.

Om glutamaat release visualiseren in klaring, met behulp van de microscoop X, Y drives, plaats de geteste glutamaat sensor positieve bouton dicht bij het viewfield center. Na het stoppen van de acquisitie klikt u op de afbeelding met de linkermuisknop om de X- Y-positie van het rustende bouton-centrum te bepalen. De X, Y coördinaten van de ingestelde cursor worden weergegeven.

Bereken met behulp van de kalibratiegegevens de coördinaten van de plaats waar de laserstraal moet worden verzonden voor de excitatie van de glutamaatsensorfluorescentie met behulp van de aangegeven formules. Als u een reeks van één punt in de laserbesturingssoftware wilt maken, selecteert u punt in het vak Toevoegen aan volgorde op de sequentiepagina van de laserbesturingssoftware en stelt u de runs en run delay in op nul en de volgorde die op TLL moet worden uitgevoerd. Klik vervolgens op startvolgorde.

Selecteer in de camerabesturingssoftware de juiste beeldvormingsparameters en selecteer extern startscherm voor de triggermodus. Klik op het signaal in de camerabesturingssoftware. Start vervolgens het experimentele protocol dat is vastgelegd voor het triggerapparaat en implementeer de experimentele protocolstudie met de juiste tijdlijn, zodat de camera 400 frames met een frequentie van 2,48 kilohertz krijgt tijdens één proef, met een 0,1 hertz of lagere herhalingsfrequentie.

Als u pathologische synapsen wilt identificeren, schakelt u de hoogteroutines in en berekent u de fluorescentieintensiteit, gemiddelde en standaarddeviatie voor het geselecteerde gebied van belang in rust. Bepaal en box het gebied bezet door pixels met een fluorescentie intensiteit in rust groter dan het gemiddelde plus drie standaarddeviaties, en bepalen van een virtuele diameter in micron uitgaande van een cirkelvormige vorm van de supra drempel gebied. Plot de fluorescentieintensiteit tegen de tijd, als het verschil tussen de werkelijke fluorescentieintensiteit en de fluorescentieintensiteit in rust gedeeld door de fluorescentieintensiteit in rust.

Bepaal de piekamplitude van de fluorescentierespons. Voer een monoexponentiële fitting uit voor het verval vanaf de piek van de fluorescentierespons en bepaal de tijdconstante van verval, TauD. Als u de maximale amplitude bij een bepaalde synaps wilt schatten, selecteert u de pixel met de hoogste verandering in fluorescentieintensiteit, wat de beste indicator is van de glutamaatbelasting die wordt gepresenteerd aan de klaringsmachines van de synaps.

Enkele synaps imaging kan worden gebruikt om twee klassen corticostriatale synapsen te identificeren met behulp van de grootte en gepaarde pulsverhouding criteria. Met stimulusintervallen van 20 tot 50 milliseconden zijn de kleinere interenterochephalic terminals gevoelig voor gepaarde pulsdepressie, terwijl de grotere piramidale tractterminals gepaarde pulsfacilitering vertoonden. Tests op motorisch gedrag uitgevoerd op wild-type muizen en muizen die een Huntington fenotype uitdrukken, onthullen een significante positieve coorelation tussen de resultaten verkregen voor het totale pad in het open veld, en de stap over latentie.

Verder toont enkele synapse glutamaatbeeldvorming aan dat symptomatische Huntington muizen een tekort vertoonden in de snelheid van juxtasynpatische glutamaatverval zoals weerspiegeld in de TauD-waarden van de glutamaatreacties op enkele synapstimulatie. Bij dieren van het wildtype werd een dergelijke verlenging pas waargenomen na de toepassing van een selectieve, niet-vervoerbare remmer van glutamaatopname. Evaluatie van de waarschijnlijkheid van het optreden van een bepaalde TauD-waarde in plakjes van wild-type muizen, en muizen die de symptomen van de ZvH uitdrukken, toonden aan dat taud bij wilde dieren nooit meer dan 15 milliseconden bedraagt.

Bij symptomatische ZvH vertonen echter 40% van de synapsen TauD-waarden tussen 16 en 58 milliseconden, ondanks een neiging tot een vermindering van de hoeveelheid vrijgegeven glutamaat. TauD kan daarom worden beschouwd als een biomarker voor disfunctionele synapsen bij de ZvH, en kan verder worden gebruikt om functioneel herstel te verifiëren in experimenten gericht op astrocytisch glutamaattransport. Dit protocol voor glutamaat monitoring bij individuele corticostriatale synapsen kan helpen om de rol van glutamaat opnametekort bij de pathogenese van neurodegeneratieve ziekte te verduidelijken.

Enkele synaps imaging is vooral handig voor het verkennen van pre-synaptische sites van excitatory synapsen.