Name: Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Leer een 3D-spheroïdmodel voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten in een tumorachtige omgeving. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van celmatrix-interacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We erkennen de hulp van Barbara Schedding bij het voorbereiden van de BM2 en lebein-1. We erkennen Àgnes Noel voor het delen van haar expertise in spheroid-assays. We danken Sonja Schelhaas en Michael Schäfers voor hun hulp bij het hanteren van linvirale transfectie onder S2-condities. We erkennen Sabine von Rüden's assistentie in het bereiden van CAFs van pancreaskanker weefsel.
Het onderzoek dat tot deze resultaten leidt, heeft financiering ontvangen van het people-programma (Marie Curie-acties) van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie KP7/2007-2013/onder de REA subsidieovereenkomst n ◦ (316610) tot en met J.A.E. Bovendien werd J.A.E. en A.C.M.C. financieel gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) binnen de cellen-in-Motion cluster of Excellence (EXC 1003-CiM). Dit project werd ook gesteund door Wilhelm Sander Stiftung (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).

1.3D-sferoïden als een in vitro model voor fibroblast/CAF-differentiatie met behulp van verschillende TGF-β1 remmende verbindingen van celmatrix interactie
<ol><li>Meng 1 deel van 6 mg/mL methylcellulose-oplossing en 3 delen celkweek media, MEM aangevuld met 1% van het warmtegeïnactiveerde foetale runderserum (FBS) en 1% penicillaire/streptomycine om de spheroid-formatie oplossing te verkrijgen.</li>
	<li>Resubreng vers ontdooide vereeuwigd normale fibroblasten (iNFs), vereeuwigd CAF (iCAFs) of integrine α3β1 KO iCAF (passage tot 25) in de spheroid-formatie oplossing. Bij de bereiding van 1 96 goed plaat, bereid een overmaat van spheroid formatie oplossing, 10 mL en voeg 75.000 cellen, rekening houdend met het bestaan van elke spheroid is samengesteld door 750 cellen, en dat 100 μL worden verdeeld per put van de plaat.</li>
	<li>Als cytokines of integrineremmers in de studie zijn opgenomen, voeg deze verbindingen toe aan de celsuspensie om ze tijdens hun vorming in de spheroïden te verankeren. Merk op dat iNFs worden gestimuleerd met 10 ng/mL TGF-β1 om differentiatie te triggeren. Voeg in voorkomend geval remmer-verbindingen toe samen met TGF-β1, zoals 20 μg/mL BM2 of 10 μg/mL lebein 1.</li>
	<li>Bereid CAF homospheroids op dezelfde manier, maar zonder de TGF-β1 stimulus, omdat ze zijn al gedifferentieerd. Bereid de integrine α3 KO CAF homospheroids zonder toevoeging van een compound.</li>
	<li>Verdeel de spheroid-formatie oplossing op een ronde bodem 96 multi-well plaat door 100 μL van de oplossing in elke put toe te voegen. Elke keer dat de spheroid-oplossing in de putjes wordt verdeeld, meng je goed door meerdere malen op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Plaats de plaat in de celkweek incubator voor 24 uur zodat één spheroid in elke put kan worden gevormd.</li>
	<li>Verzamel de spheroïden na ongeveer 24 uur en gebruik ze voor verschillende downstream-doeleinden: immunofluorescentie kleuring, real-time (RT) q-PCR en flow cytometrie. Om de expressie van intra-en extracellulaire antigenen te detecteren, met inbegrip van de afzetting van ECM-eiwitten binnen de spheroid, gebruikt u immunofluorescentie kleuring. Na desintegratie van sferoïden in afzonderlijke cellen, kwantificeren membraan-verankerde receptor doorstroming cytometrie. Om genactivatie en transcriptionele veranderingen te detecteren, gebruikt u RT q-PCR van mRNA geïsoleerd uit de spheroid-cellen.</li>
</ol>2. immunofluorescentie kleuring van sferoïden
<ol><li>Verzamel de spheroïden na ongeveer 24 uur in één 1,5 mL-reactie buis per experimentele aandoening of per te analyseren eiwit. Bijvoorbeeld, plaats de sferoïden van INFS gestimuleerd met TGF-β1 in een buis verschillend van de controle-INFS, die niet werden behandeld. Snijd het uiteinde van de pipetpunt om de opening te vergroten om te voorkomen dat de spheroïden scheuren vanwege te sterke afschuifkrachten. Omvatten ten minste 5-10 sferoïden in één reactie buis, om replicaten toe te staan en rekening te houden met de mogelijke verliezen tijdens de wasstappen.</li>
	<li>Centrifugeer de sferoïden met een bench top centrifuge voor ongeveer 30-60 s bij 1.000 x g. Verwijder voorzichtig de methylcellulose-bevattende supernatant door pipetteren, zonder de gepileerde spheroids te verstoren.</li>
	<li>Wassen met 50 μL 1x PBS. Herhaal de Centrifugeer stap en verwijder de PBS voorzichtig door pipetteren, zoals beschreven in 2,2.</li>
	<li>Afhankelijk van het te bevlekt eiwit, fixeert u met 50 μL van 4% Paraformaldehyde in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (voor αSMA, NG2 en integrine α3β1) of met 50 μL methanol gedurende 10 min bij-20 °C (voor laminine-332 subeenheden).</li>
	<li>Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3.</li>
	<li>Permeabiliseer de cellen met 0,1% Triton-X in PBS gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3 drie keer.</li>
	<li>Inbroed de spheroïden in PBS met 5% FBS en 2% BSA, gedurende 1 uur bij RT om niet-specifieke proteïne-interactie sites te blokkeren.</li>
	<li>Incuberen de spheroïden met 30 μL primaire antilichamen in PBS, 2,5% FBS en 1% BSA bij 4 °C 's nachts. De volgende primaire antilichamen werden gebruikt: anti-αSMA CY-3 geconjugeerd en anti-NG2 bij 5 μg/mL; BM2 anti-laminin α3, 6F12 anti-laminin β3 en anti-laminin γ 2 20 μg/mL.</li>
	<li>Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3 drie keer.</li>
	<li>Inbroed de spheroïden met 30 μL secundaire antilichamen in PBS, 2,5% FBS en 1% BSA bij RT gedurende 90 min. De volgende secundaire antilichamen werden gebruikt: Alexa 488 anti-Rabbit en anti-Mouse (5 μg/mL).</li>
	<li>Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3 drie keer.</li>
	<li>Incuberen de cellen met 30 μL DAPI-kleurings oplossing gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stappen 2.2-2.3.</li>
	<li>Plaats de sferoïden op een glazen glijbaan, in een druppel PBS, met een glazen Pasteur pipet.</li>
	<li>Beeld de sferoïden door fluorescentiemicroscopie in een laser scanning microscoop met een vergroting van 10x. Neem verschillende optische dwarsdoorsnede van de spheroid op verschillende optische vlakken van een z-stack (15-20 stapel vlakken). Om de laser instellingen in de Microscoop vast te stellen, gebruikt u een spheroid die bestaat uit cellen die negatief zijn voor het antigeen of een spheroid die alleen met het secundaire antilichaam wordt gebeitst. Hergebruik dezelfde instellingen voor alle samples die worden vergeleken.</li>
	<li>Analyseer de microscopische beelden met ImageJ-software zoals eerder gepubliceerd14. De stappen worden samengevat in aanvullend figuur 1. Bepaal als achtergrond de geïntegreerde signaal dichtheid van een cel-vrije regio van belang (ROI). Bereken de totale gecorrigeerde celfluorescentie (TCCF) als: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60122/60122eq1.jpg">
</li>
	<li>Bepaal de totale gecorrigeerde fluorescentie (TCF) van de spheroïden als de TCCF genormaliseerd naar het gebied van de spheroid en het aantal stapels. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60122/60122eq2.jpg">
</li>
</ol>3. RT q-PCR van homospheroïden
<ol><li>Om Rt-qPCR uit te voeren, verzamelt u ten minste 288 sferoïden (overeenkomend met 3 96-well-platen) in een reactie buis van 50 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 x g en verwijder voorzichtig de methylcellulose bevattende supernatant door pipetteren zonder de gepileerde spheroids te verstoren.</li>
	<li>Was met 1 mL 1x PBS en breng de sferioïden over naar een reactie buis van 1,5 mL. Centrifugeer de sferoïden met een bench top centrifuge voor ongeveer 30-60 s bij 1.000 x g. Verwijder de PBS voorzichtig met pipetteren, zonder de gepileerde-spheroids te storen.</li>
	<li>Dissociate de sferoïden met 250 μL van 4 mg/ml Collagenase B, 50 μg/ml DNase I, 2% BSA, 1 mm CACL2 in PBS bij 37 °c gedurende ongeveer 30-45 min door het zachtjes vortexen en pulseren met tussenpozen gedurende een paar seconden elke 5 min.</li>
	<li>Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stap 3,2.</li>
	<li>Isoleer het totale RNA van de cellen van uiteenvallen sferoïden met behulp van een commerciële RNA Isolation Kit, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Reverse transcriberen de geïsoleerde mRNA in cDNA met een commerciële Kit, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Kwantificeer de transcriptie niveaus in replicaten door real-time PCR. De gebruikte primers waren: α-SMA: FW 5 ′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3 ′, Rev 5 ′ ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3 ′15; Laminin α3 keten: FW 5 ′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3 ′, Rev 5 ′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3 ′16; Laminin β3 keten: FW 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ′ Rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 ′17; Laminin γ2-keten: FW 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ′ Rev 5 ′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 ′ 16; NG2: FW 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ′ Rev 5 ′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 ′18; integrine α3 subeenheid: FW 5 '-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3 ' Rev 5 '-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3 '19; TOP-1: FW 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ′ Rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 ′20.</li>
	<li>Corrigeer de CT-waarden voor de CT-waarde van een endogeen referentie-gen zoals TOP-1 met behulp van de vergelijking: 2-δδct. ΔΔCt = ΔCt (doel monster) – ΔCt (referentiemonster) en ΔCt = CT van het doel gen of referentie-gen – TOP-I.</li>
</ol>4. Flowcytometrie analyse van integrine expressie
<ol><li>Voor Flow cytometrische analyse, verzamelen ten minste 288 sferoïden (overeenkomend met 3 96-well platen) in een 50 ml reactie buis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 x g en verwijder de supernatant van methylcellulose met pipetteren voorzichtig.</li>
	<li>Was met 1 mL 1x PBS en breng de sferioïden over naar een reactie buis van 1,5 mL. Herhaal de Centrifugeer stap en verwijder de PBS voorzichtig door pipetteren.</li>
	<li>Dissociëren van de sferoïden zoals beschreven in stap 3,3.</li>
	<li>Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stap 4,2.</li>
	<li>Om niet-specifieke binding sites te blokkeren en te voorkomen dat detectie-relevante antilichamen tegen Fcγ-receptoren (CD16, CD32 en CD64) worden gebonden, inbroed de cellen in 100 μL PBS met 2% paarden serum (of serum van een andere diersoort, waarvan de antilichamen niet zullen worden gebruikt in het experiment) en 0,1% BSA gedurende 20 minuten bij 4 °C met rotatie.</li>
	<li>In geval van kleuring intracellulaire markers, Fix/permeabilize de cellen zoals beschreven in stap 2.2-2.5.</li>
	<li>Inincuberen de cellen met de primaire antilichamen in 100 μL PBS met 2% paarden serum en 0,1% BSA gedurende 30 minuten bij 4 °C met rotatie. Verdun het primaire antilichaam tot 10 μg/mL.</li>
	<li>Wassen met 100 μL PBS + 0,1% BSA driemaal, met centrifugeren stappen in de bovenste bank centrifuge bij 1.000 x g daartussenin.</li>
	<li>Inincuberen de cellen met de secundaire antilichamen in 100 μL PBS met 2% paarden serum en 0,1% BSA gedurende 30 minuten bij 4 °C met rotatie. Verdun secundair antilichaam tot 10 μg/mL.</li>
	<li>Herhaal de wasstap zoals uitgelegd in stap 4,7.</li>
	<li>Analyseer 2,0 x 104 bevlekt cellen in een flow cytometer. Poort voor enkele levende cellen via de FSC-SSC dot plot en analyseer de fluorescentie van de gated cellen op het kanaal dat geschikt is voor de geselecteerde fluorophore.</li>
</ol>5. invasie test met heterospheroids
<ol><li>Bereid de spheroid-formatie oplossing voor heterospheroïden, die de verschillende celtypen en bijbehorende mediums bevat, zoals samengevat in tabel 1. De cellen waren eerder met lentivirus met vectoren voor mCherry of GFP expressie.</li>
	<li>Vul 100 μL van de spheroid-formatie oplossing in elke put van de plaat en bebroed de plaat in de celkweek incubator voor 24 uur, zodat één spheroid in elke put kan worden gevormd.</li>
	<li>Bereid 60 μL gelatineuze matrix mengsel met 2 mg/mL rat tail collageen I, 30% van de commerciële gelifying matrix en 2,5 μg/mL laminin-332 in een 1,5 mL reactie buis. Verdeel 15 μL snel in 3 putjes van de μ-Slide angiogenese kamer. Sluit één spheroid in elke put die al de gel bevat.</li>
	<li>Pas indien nodig de locatie van de spheroid snel aan het midden van de put aan met een pipet onder de Microscoop.</li>
	<li>Herhaal stap 5.2-5.3 voor de volgende heterospheroids en herhaal opnieuw voor de homospheroïden.</li>
	<li>Inculeer de gels in de incubator voor 1 uur om te stollen en de gels vervolgens zachtjes met celkweekmedium te bedekken.</li>
	<li>Beeld de sferoïden door fluorescentiemicroscopie in een laser scanning microscoop. Neem verschillende optische dwarsdoorsnede van de spheroid op verschillende optische vlakken van een z-stack en op verschillende tijdstippen van invasie (bijvoorbeeld 0 h, 24 h, 48 h en 72 h).</li>
	<li>Analyseer de beelden door het aantal binnenvallende kankercellen te tellen. Binnenvallende cellen zijn degene die de spheroid hebben verlaten en het invasieve gebied binnenkwamen. Het invasieve gebied wordt gedefinieerd als het ring gebied tussen de buitenste en binnenste perimeters die worden gegeven door de verste binnenvallende cel en door de spheroid-grens van de spheroid aan het begin van de invasie-experimenten, respectievelijk, zoals uiteengezet in aanvullende figuur 2 .</li>
</ol>

<ol><li>Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whom+to+blame+for+metastasis%2C+the+epithelial-mesenchymal+transition+or+the+tumor+microenvironment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment?</a> Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).</li>
<li>Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).</li>
<li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+carcinomas+deposit+laminin-5%2C+preferably+adhere+to+laminin-5%2C+and+migrate+on+the+newly+deposited+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane.</a> The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).</li>
<li>Eble, J. A., Niland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+in+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix in tumor progression and metastasis.</a> Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).</li>
<li>Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts+and+mechano-regulation+of+connective+tissue+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).</li>
<li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+%28Baltimore%2C+Md.%29%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).</li>
<li>Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+Damage+Intended-Cancer-Associated+Fibroblasts+and+Vasculature+Are+Potential+Targets+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355(2017).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalinin%3A+an+epithelium-specific+basement+membrane+adhesion+molecule+that+is+a+component+of+anchoring+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).</li>
<li>Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipera+lebetina+venom+contains+two+disintegrins+inhibiting+laminin-binding+beta1+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).</li>
<li>Kusuma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+response+to+laminin-511+regulates+breast+tumor+cell+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis.</a> International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).</li>
<li>Martins Cavaco,, C, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interaction+between+Laminin-332+and+%CE%B13%CE%B21+Integrin+Determines+Differentiation+and+Maintenance+of+CAFs%2C+and+Supports+Invasion+of+Pancreatic+Duct+Adenocarcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells.</a> Cancers. 11 (1), 14(2019).</li>
<li>Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+cell-based+assay+performed+with+cellular+spheroids+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).</li>
<li>Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+suppresses+alpha-smooth+muscle+actin+expression+in+human+dermal+fibroblasts%3A+an+implication+for+abnormal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).</li>
<li>Kim, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin-332-Rich+Tumor+Microenvironment+for+Tumor+Invasion+in+the+Interface+Zone+of+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+%CE%B23+Chains+of+Laminin-332+is+Associated+With+Clinicopathologic+Features+and+Decreased+Survival+in+Patients+With+Pancreatic+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).</li>
<li>Huang, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+therapeutic+neovascularization+in+a+mouse+model+of+an+ischemic+limb+using+cell+aggregates+composed+of+HUVECs+and+cbMSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs.</a> Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).</li>
<li>Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+%CE%B16high+Cell+Population+Functions+as+an+Initiator+in+Tumorigenesis+and+Relapse+of+Human+Liposarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).</li>
<li>Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+Drug+Sensitivity+in+Human+Colon+Cancer+Cells+after+Exposure+to+Heat%3A+Implications+for+Liver+Metastasis+Therapy+using+RFA+and+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).</li>
<li>Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+endothelial+cells+on+human+mesenchymal+stem+cell+activity+in+a+three-dimensional+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model.</a> European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).</li>
<li>Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+system+using+on-chip+probe+with+wide+range+actuation%5BTitle%5D)+AND+%222016+International+Symposium+on+Micro-NanoMechatronics+and+Human+Science+%28MHS%29%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation.</a> 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).</li>
<li>Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).</li>
<li>Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Nowicki, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+inhibits+invasion+of+glioma+cells%3B+possible+involvement+of+glycogen+synthase+kinase-3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3.</a> Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict. Dit materiaal weerspiegelt alleen de standpunten van de auteur en de Europese Unie is niet aansprakelijk voor enig gebruik dat kan worden gemaakt van de daarin vervatte informatie.

Het ontwikkelen van een geschikt in vitro model om CAF-differentiatie te bestuderen is een uitdagende taak. Na het gebruik van verschillende benaderingen concludeerden we dat een 3D-spheroid-model het praktischer, fysiologisch en klinisch relevant model is, waarin het samenspel tussen pancreas carcinoom cellen met vereeuwigd CAFs kan worden bestudeerd. Dit model voorkwam spontane differentiatie van fibroblasten, als gevolg van artefeitelijke stressoren zoals de stijfheid van de celcultuur kunststof, althans in korte-term...

De tumor micro Environment is een zeer complexe niche en uiterst belangrijk voor het onderhoud en de progressie van de tumorcellen1. Het wordt niet alleen gevormd door de kankercellen, maar ook door stromale fibroblasten. De tumorcellen zijn omgeven door een stroma die specifiek is en verschillend van de stroma van normale weefsels2. Laminine-332 is een extracellulair matrix eiwit ectopisch uitgedrukt in de stroma van verschillende tumoren, zoals pancreas adenocarcinoom3. Bovendien, de biochemische samenstelling van de ECM en ook haar biofysische eigenschappen, zoals stijfheid en spanning, verandering binnen de tumor bulk4. Deze tumor stroma, of "reactieve stroma", wordt veroorzaakt door een aanpassing van fibroblasten aan de naburige kankercellen en door de werving van andere zeer belangrijke spelers die een gunstige en ondersteunende omgeving voor tumorprogressie ontwikkelen. De differentiatie van stromale fibroblasten resulteert in kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF). Deze cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van verschillende markers zoals α-gladde spier actine (αsma)5 of neurale/glial antigeen 2 (ng2)6.
Het meest geschikte in vitro model om de tumor micro Environment (TME) met CAFS te recapituleren is moeilijk te selecteren. De methode voor het nabootsen van fysiologische parameters van de TME op een kostenefficiënte en reproduceerbare manier moet worden overwogen voor een dergelijk modelsysteem. Binnen de TME, verschillende processen, zoals proliferatie, differentiatie, migratie en invasie van de verschillende celtypen optreden. Deze cellulaire processen kunnen individueel worden uitgevoerd met verschillende methoden. Echter, de experimentele omstandigheden moeten rekening houden met de cellulaire interacties met de tumor stroma ECM, aangezien de stijfheid van de substratum invloed op de CAF differentiatieproces. R.G. Wells becommentarieerde de impact van matrix stijfheid op Celgedrag en benadrukte dat cytoskelet organisatie en differentiatie status waargenomen in in vitro gekweekte cellen mogelijk artefeitelijk7. Verschillende stimuli lijken te worden betrokken bij CAF differentiatie, met inbegrip van mechanische spanning5,7. Om dit te voorkomen, kunnen 2D zachte substraten mogelijk benaderingen voor differentiatie studies, als ze het probleem van de stijve cultuur schotel plastic omzeilen. Een zacht 2D-oppervlak, waarop fibroblasten kunnen worden geteeld, kan collageen-I gecoate polyacrylamidegels zijn, waarbij de gelstijfheid kan worden gemanipuleerd door de concentratie van polyacrylamide en de gel cross-linker. De hechting en vorming van αSMA-rijke stress vezels worden versterkt in fibroblasten samen met de gel stijfheid8. Deze resultaten benadrukken het belang van zachte substraat steigers voor meer fysiologische in vitro differentiatie modellen. Echter, in onze handen waren de experimentele reproduceerbaarheid en beeldvorming van deze gels uitdagend. Om deze tekortkomingen te overwinnen, veranderden we het 2D zachte substraat systeem voor een 3D-spheroid-model voor differentiatie en invasie studies. Dit model is meer klinisch relevant en, vergelijkbaar met een in vitro organoïde, aan in vivo celcelinteracties, ECM productie en depositie, evenals Celgedrag9.
Spheroids worden gevormd wanneer cellen een substraat missen om zich aan te houden. Wanneer de cellen worden gelaten zonder een lijm oppervlak, ze aggregeren om een meer of minder sferische structuur te vormen. Als de sferoïden zijn samengesteld uit één type cel, worden ze homo-spheroïden genoemd; Als het bestaat uit twee of meer verschillende celtypen, vormen ze heterospheroids.
Onder de verschillende methoden voor het bereiden van spheroid voeren we het protocol uit met niet-aanhandige ronde bodem 96-well Plates. Het is zeer effectief met betrekking tot de kosten. Hier produceren we zowel homospheroïden van fibroblasten, CAF of CAFs zonder de integrine α3-subeenheid om het differentiatieproces te onderzoeken en heterospheroïden van CAFs of integrine α3 KO CAFs en pancreas cellen van de alvleesklier (AsPC-I en PANC-I) om de invasie te bestuderen in de omringende matrix.
Het doel voor deze studies was het gebruik van primaire CAFs geïsoleerd van menselijke alvleesklier carcinoom biopsies. Echter, de biopsieën om de cellen te verkrijgen zijn schaars en om deze reden, de CAFs gebruikt in deze studies zijn vereeuwigd met behulp van lentivirus met HTERT. Ze heten icafs, en hun normale tegenhangers, primaire menselijke alvleesklier fibroblasten, worden genoemd INFS. De humane alvleesklier fibroblasten en de tumorcellen van de alvleesklier, AsPC-I en PANC-I, zijn in de handel verkrijgbaar.
Dit protocol werd gebruikt om het effect van de interactie laminin-332-integrin in het CAF-differentiatieproces te bestuderen. Om de specificiteit van deze interactie en zijn functie te bewijzen, werden remmer-verbindingen gebruikt: BM2, een monoklonaal antilichaam dat de integrine bindingsplaats de laminin-332 α3 keten10, of lebein 1, een slang Venom afgeleide stof blokkeert die de laminine binding Integrins α3β1, α6β1 en α7β111,12.
Voor de invasie test waren cellen met lentivirus, die cDNA-codering bevatten, ofwel mCherry (iCAFs en integrine α3 KO iCAFs) of GFP (AsPC-I en PANC-I) om de verschillende celtypen in de heterospheroïden te onderscheiden. De transductie van de cellen om ze te vereeuwigen en/of om ze te labelen met een fluorescerende proteïne (mCherry en GFP) expressie wordt beschreven in een eerdere studie13, die moet worden geraadpleegd voor meer informatie.

<table><tbody><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D9542-10</td><td></td></tr><tr><td>6F12 anti-Laminin &beta;3 subunit Mouse (monoclonal)</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>A3IIF5 Anti-&alpha;3 integrin subunit Mouse (monoclonal)</td><td></td><td></td><td>Vriendelijk verstrekt door Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>Albumine Fraction V - BSA</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Anti-laminin &gamma;2 subunit Mouse (monoclonal)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-28330</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1 cel lijn</td><td>ATCC</td><td></td><td>Vriendelijk gegeven door prof. Jorg Haier's Lab</td></tr><tr><td>Bench centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-589-620</td><td>Sprout</td></tr><tr><td>BM2 anti-laminin &alpha;3 subunit Mouse (monoclonal)</td><td></td><td></td><td>Vriendelijk verstrekt door Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon</td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl2)</td><td>Fluka</td><td>21074</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Multifuge 1S-R</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>Collagen-I, rat tail</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 and 800</td></tr><tr><td>DMEM (Hoge glucose 4,5 g/L)</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSCaliburTM</td></tr><tr><td>Geleefde matrix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1413202</td><td>Matrigel, Geltrex</td></tr><tr><td>Goat IgG, isotype</td><td>DAKO</td><td>X 0907</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>12449-C</td><td></td></tr><tr><td>Human Primary Pancreatic Fibroblasts</td><td>PELOBiotech</td><td>PB-H-6201</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Heraeus</td><td>B6060</td><td></td></tr><tr><td>Laminine-332</td><td>Biolamina</td><td>LN332</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Microplate, 96 wells, U-bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG, isotype</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>Multi as draaiende mixer</td><td>CAT</td><td>RM5 80V</td><td></td></tr><tr><td>PANC-I</td><td>ATCC</td><td></td><td>Vriendelijk gegeven door Prof. Jorg Haier's Lab</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Riedel-de Haën</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Transcription Kit</td><td>Qiagen</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG, isotype</td><td>Invitrogen</td><td>10700</td><td></td></tr><tr><td>Reactiebuisjes, 1,5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR cycler</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Rotor-Gene Q</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Gene SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Voeg glucose toe aan 4,5 g (0,2 um filter) en 1% natriumpyruvaat</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X100RS</td><td></td></tr><tr><td>V&oacute;rtex</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td>Vortex-Genie 2</td></tr><tr><td>&mu;-Slide Angiogenesis, ongecoat</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td></td></tr></tbody></table>

een 3d-spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Het definiëren van het ideale model voor een in vitro studie is essentieel, vooral als het bestuderen van fysiologische processen zoals differentiatie van cellen. In de tumor stroma, gastheer fibroblasten worden gestimuleerd door kankercellen te differentiëren. Dus, ze verwerven een fenotype dat bijdraagt aan de tumor micro omgeving en ondersteunt de progressie van de tumor. Door gebruik te maken van het spheroid-model hebben we zo'n 3D in vitro modelsysteem opgezet, waarin we de rol van laminin-332 en de receptor integrine α3β1 in dit differentiatieproces analyseerden. Dit spheroid-modelsysteem reproduceert niet alleen de omstandigheden van de tumor microomgeving op een nauwkeurigere manier, maar is ook een zeer veelzijdig model, omdat het verschillende downstreamonderzoeken mogelijk maakt, zoals immunofluorescentie kleuring van zowel intra-als extracellulaire markers, evenals gedeponeerde extracellulaire matrix eiwitten. Bovendien kunnen transcriptionele analyses van qPCR, flow cytometrie en cellulaire invasie met dit model worden bestudeerd. Hier beschrijven we een protocol van een spheroid-model om de rol van CAFs ' integrine α3β1 te beoordelen en zijn ectopisch gestorte ligand, laminin-332, in differentiatie en ter ondersteuning van de invasie van pancreaskanker cellen.

De resultaten van dit experimentele ontwerp worden gepubliceerd in Martins Cavaco et al.13, die wordt aanbevolen voor verdere lezing van de conclusies die werden getrokken uit deze experimenten.
Figuur 1, een representatief beeld van een immunofluorescentie-spheroid, toont de immunokleuring van de integrine α3-subeenheid van beide vereeuwigd normale fibroblasten en vereeuwigd...

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Het kweken van fibroblasten in sferoïde recapituleren tumorweefsel veel beter dan het veelgebruikte 2D-systeem op stijf plastic. Het maakt het mogelijk om fibroblasten differentiatie in een tumor-achtige omgeving te bestuderen. In deze methode heeft de stijfheid van het plastic werk van de celcultuur geen artefactuele invloed op fibroblastdifferentiatie.In plaats daarvan kan de invloed van celmatrix interactie op tumor geïnduceerde differentiatie van fibroblast in vitro worden geanalyseerd. Om deze procedure te beginnen, verkrijg de celkweekmedia, die MEM wordt aangevuld met 1%warmte geïnactiveerde FBS en 1%penicilline streptomycine. Verkrijg ook een oplossing van zes milligram per milliliter methylcellulose.Meng een deel van de methylcellulose met drie delen van de celkweekmedia om de sferoïde vormingsoplossing voor te bereiden. Resuspend vers ontdooid vereeuwigde normale fibroblasten of andere celtypes zoals vermeld in het tekstprotocol in de sferoïde vormingsoplossing. Als cytokinen of integrin-remmers in de studie zijn opgenomen, voeg deze verbindingen toe aan de celsuspensie om ze tijdens hun vorming in de sferoïden te steken.Voeg in voorkomend geval remmerverbindingen toe sam

a-3d-spheroid-model-as-more-physiological-system-for-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Hier presenteren we een aantal eenvoudige methoden voor de evaluatie van de levensvatbaarheid en de dood in 3D kanker cel sferoïden, die de fysisch-chemische gradiënten van in vivo tumoren veel beter dan de 2D-cultuur na te bootsen. Het sferoïde model maakt het dus mogelijk om de effectiviteit van kanker medicijnen te evalueren met een verbeterde vertaling naar in vivo omstandigheden.

Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen

Een nieuwe drie-dimensionale sferoïde model gebaseerd op de heterotypische interactie van tumorcellen en stromal fibroblasten wordt vastgesteld. Hier presenteren we cocultuur van tumorcellen en stromalfibroblasten, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie om de vorming van sferoïden te visualiseren. Dit driedimensionale model biedt een relevant platform om tumor-stroma interacties te bestuderen en kankertherapieën te testen.

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijke invasietest voor glioblastoom. Deze test is geschikt voor glioblastoom stamcellen-achtige cellen. Een Fiji macro voor eenvoudige kwantificering van invasie, migratie en proliferatie wordt ook beschreven.

Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

Uitgebreide in vitro modellen die de relevante menselijke ziekte getrouw samenvatten, ontbreken. De huidige studie presenteert driedimensionale (3D) tumor sferoïde creatie en cultuur, een betrouwbaar in vitro hulpmiddel om de tumor-stromale interactie in humaan hepatocellulair carcinoom te bestuderen.

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

Meercellige 3D-tumorsferoïden werden bereid met longadenocarcinoomcellen, fibroblasten en monocyten, gevolgd door de isolatie van kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs) uit deze sferoïden. Geïsoleerde CAFs werden vergeleken met normale fibroblasten om de mitochondriale gezondheid te beoordelen door het mitochondriale transmembraanpotentieel, reactieve zuurstofsoorten en enzymatische activiteiten te bestuderen.

Beoordeling van mitochondriale gezondheid in kankergeassocieerde fibroblasten geïsoleerd uit 3D meercellige longtumorenferoïden

We presenteren een protocol voor het kweken van hoogreproduceerbare sferoïden en hun fenotypische karakterisering met behulp van beeldopname en proteomics.

Semi-geautomatiseerde fenotypische analyse van functionele 3D-sferoïde celculturen

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Leer een 3D-spheroïdmodel voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten in een tumorachtige omgeving. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van celmatrix-interacties mogelijk.

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies (Video) | JoVE Journal

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Meer video's verkennen