Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Het kweken van fibroblasten in sferoïde recapituleren tumorweefsel veel beter dan het veelgebruikte 2D-systeem op stijf plastic. Het maakt het mogelijk om fibroblasten differentiatie in een tumor-achtige omgeving te bestuderen. In deze methode heeft de stijfheid van het plastic werk van de celcultuur geen artefactuele invloed op fibroblastdifferentiatie.

In plaats daarvan kan de invloed van celmatrix interactie op tumor geïnduceerde differentiatie van fibroblast in vitro worden geanalyseerd. Om deze procedure te beginnen, verkrijg de celkweekmedia, die MEM wordt aangevuld met 1%warmte geïnactiveerde FBS en 1%penicilline streptomycine. Verkrijg ook een oplossing van zes milligram per milliliter methylcellulose.

Meng een deel van de methylcellulose met drie delen van de celkweekmedia om de sferoïde vormingsoplossing voor te bereiden. Resuspend vers ontdooid vereeuwigde normale fibroblasten of andere celtypes zoals vermeld in het tekstprotocol in de sferoïde vormingsoplossing. Als cytokinen of integrin-remmers in de studie zijn opgenomen, voeg deze verbindingen toe aan de celsuspensie om ze tijdens hun vorming in de sferoïden te steken.

Voeg in voorkomend geval remmerverbindingen toe samen met 10 nanogram per milliliter TGF-bèta om differentiatie in vereeuwigde normale fibroblasten te activeren. Verdeel 100 microliter van de sferoïde formatie oplossing in elke put van een ronde bodem 96 multi-well plaat. Pipette de oplossing in elke put op en neer meerdere malen te mengen.

Vervolgens, incubeer de plaat in de cel cultuur incubator op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide voor 24 uur om een sferoïde te vormen in elke put. Snijd eerst het uiteinde van een pipetpunt af om de opening te vergroten. Nadat de incubatie is voltooid, gebruik deze gesneden pipet om de sferoïden te verzamelen in één 1,5 milliliter reactiebuis per experimentele aandoening of per eiwit dat moet worden geanalyseerd.

Centrifuge de sferoïden op 1000 keer G voor ongeveer 30 tot 60 seconden. Verwijder voorzichtig de methylcellulose die supernatant bevat door pipetting om ervoor te zorgen dat de pelleted sferoïden niet storen. Speciale zorg moet worden genomen bij het overbrengen van de sferoïden naar de reactiebuizen.

Zorg ervoor dat je geen scharen drift krachten door het snijden van de tip. Het is ook belangrijk dat je alle sferoïden verzamelt. Tijdens de wasstap, zorg ervoor dat je niet de sferoïden te verliezen door aspiratie.

Om de sferoïden te wassen voeg je 50 microliter van één X PBS toe. Centrifuge op 1000 keer G gedurende 30 tot 60 seconden. Verwijder vervolgens voorzichtig de PBS door pipetten.

Afhankelijk van het eiwit te worden gekleurd, bevestig de sferoïden, hetzij met 50 microliters van 4%paraformaldehyde en PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de sferoïden met PBS zoals eerder beschreven. Doordring de cellen met 0,1% triton X en PBS gedurende vier minuten bij kamertemperatuur.

Was vervolgens de sferoïden in PBS drie keer zoals eerder beschreven. Voeg PBS met 5%FBS en 2%BSA toe aan de sferoïden en broed een uur lang bij kamertemperatuur om niet-specifieke eiwitinteractieplaatsen te blokkeren. Nu, incubeer de sferoïden met 30 microliter van primaire antilichamen en PBS met 2.5%FBS en 1%BSA bij vier graden Celsius 's nachts.

De volgende dag, was de sferoïden in PBS drie keer zoals eerder beschreven. Daarna de sferoïden inbroed met 30 microliter secundaire antilichamen en PBS met 2,5%FBS en 1%BSA bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Was de sferoïden in PBS drie keer zoals eerder beschreven.

Vervolgens, incubeer de cellen met 30 microliters van Dappy kleuroplossing gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Was de sferoïden een keer in PBS zoals eerder beschreven. Plaats met behulp van een glazen Pasteur pipet de sferoïden op een glazen glijbaan en een druppel PBS.

Gebruik een laser scanning microscoop om de sferoïden beeld door fluorescentie microscopie op een vergroting van 10 keer. Neem verschillende optische dwarsdoorsnede van de sferoïde op verschillende optische vlakten van de Z-stack. Een representatief beeld van de immunofluorescente kleuring van de homo sferoïden van normale pancreasfibroblasten in vergelijking met de homo sferoïden van vereeuwde kanker geassocieerd fibroblasten toont een verhoogd signaal voor de alfa drie subeenheden in de gedifferentieerde cellen.

Het fluorescentiesignaal van de cellen in de sferoïde wordt vervolgens gekwantificeerd met de Z-stackbeelden van de 3D-sferoïde en de transcriptieniveaus van het integrin alfa drie subunit-gen worden bepaald door qPCR. Al deze resultaten tonen aan dat integrin alfa drie is upregulated in vereeuwigde kanker geassocieerd fibroblasten in vergelijking met de normale tegenhanger. Dit bewijst dat integrin alpha drie bèta één als een teller voor pancreasfibroblastendifferentiatie kan worden beschouwd.

Deze methode is bij uitstek geschikt om zelfweefsel te capituleren in het algemeen gevonden in organen en kankermassa's waar de extra cel matrix stijfheid bepaalt cel lot. Sferoïden cultuur is een veelzijdig model dat kan worden gecombineerd met andere analytische testen na sferoïde dissociatie, zoals kwantiteit real-time PCR en volledige cytometrie. Paraformaldehyde gebruikt voor fixatie van de sferoïden is een gevaarlijk chemisch middel.

Handschoenen en oogslijtage moeten worden gedragen voor bescherming.