Name: Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryos en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Leer micro-injectie van DNA in oogknoppen van Xenopus laevis embryo's voor neurobiologisch onderzoek. Deze methode maakt GFP-visualisatie van optische axonale arborisatie in levende kikkervisjes mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Touro University California College voor osteopathische geneeskunde voor het ondersteunen van ons onderzoek. We erkennen eerdere studenten in het laboratorium (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) die geholpen hebben bij de implementatie van deze micro Injection-techniek in ons laboratorium. We zijn dankbaar voor Dr. Christine Holt, in wiens laboratorium deze DNA-Microinjection/lipofection-techniek in Xenopus -embryo's voor het eerst werd ontwikkeld.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Touro University California (protocol # TUCA003TE01X).
1. het verkrijgen van embryo's van X. laevis
<ol><li>Verkrijgen van X. laevis embryo's door natuurlijke paring van paren van mannelijke en vrouwelijke volwassen kikkers gevuld met humaan choriongonadotrofine (HCG), door in vitro fertilisatie van eieren schuur van vrouwelijke volwassen kikkers die met hCG zijn gevuld, of door direct te bestellen (tabel van Materialen).</li>
	<li>
Dejelly embryo's verkregen met een 2% cysteïne-oplossing bij kamertemperatuur (tabel van de materialen)16.
	<ol>
<li>Verzamel 50 − 100 embryo's in een grote Petri schaal. Verwijder de oplossing waarin de embryo's zich bevinden door het decanteren of het gebruik van een plastic pipet. Voeg 25 mL 2% cysteïne-oplossing (0,5 g cysteïne in 25 mL ddH2O, pH tot 8,0) toe aan het schaaltje dat de embryo's bevat.</li>
		<li>Zwenk de Petri schaal met de embryo's in de cysteïne-oplossing zachtjes totdat de Jelly Coats van de embryo's vallen en de embryo's in een klomp in het midden van het gerecht worden verzameld (5 − 10 min). Op dit punt, langzaam en voorzichtig giet de cysteïne oplossing in een afval beker. Zorg er niet voor te veel van de embryo's in het afval bekerglas te gieten, samen met de cysteïne-oplossing.</li>
		<li>Spoel de embryo's in de Petri schaal 6x met 10% gemodificeerde Mark's beltoon oplossing (MMR) of een andere geschikte oplossing (bijv. gemodificeerde Barth-oplossing, MBS) en wervelende de schaal telkens wanneer de oplossing wordt vervangen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultuur de embryo's in 10% MMR totdat ze ontwikkelingsstadia bereiken 22 − 2417. De Xenopus embryo's kunnen worden geïnineerd bij een temperatuur tussen 15 − 25 °c. De mate van ontwikkeling van de embryo's hangt af van de temperatuur die ze op17worden geïnineerd. Opmerking: De in een catalogus bestelde Xenopus -embryo's komen meestal voor in het laboratorium in ontwikkelingsstadia 20 − 24, zodat ze meteen kunnen worden gedejelliseerd en microgeïnjecteerd.</li>
</ol>2. het bereiden van DNA plasmiden en het maken van een DNA/DOTAP mengsel
<ol><li>Subclone DNA expressie construteert in Xenopus Expression vectoren pCS2 + of pCS2 + MT of derivaten daarvan (oorspronkelijk gebouwd door D. Turner en R. Rupp)5,6,7. pCS2 + vectoren bevatten een gemodificeerde cytomegalovirus (CMV) promotor die genexpressie in kikkers vergemakkelijkt.</li>
	<li>Amplify pCS2 plasmiden die GFP en/of genen van belang met miniprep Kits (tabel van materialen) volgens de standaardprocedure. Voer in de laatste elutie-stap van het miniprep-protocol een sequentiële elutie van het DNA uit in DDH2O om een uiteindelijke concentratie van > 1 μg/μL te leveren.</li>
	<li>Bewaar alle pCS2 plasmiden bij-80 °C tot u klaar bent om een Microinjection/lipofection experiment uit te voeren, d.w.z. Wanneer embryo's zich in ontwikkelingsstadia 22 − 24 bevinden.</li>
	<li>Ontdooien van DNA plasmiden te lipogeffecteerd bij kamertemperatuur. Onmiddellijk voorafgaand aan lipofection, kort Centrifugeer DNA plasmiden. Dit voorkomt precipitaat vorming in het DNA/DOTAP mengsel dat de punt van de microcapillaire pipet kan verstoppen.</li>
	<li>Combineer DNA plasmiden met het dotap Liposomale transfectie-reagens (tabel met materialen) bij een 1:3 (w/v) verhouding9,10. Breng bijvoorbeeld 2 μg DNA over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL en voeg 6 μL DOTAP toe, of breng 3 μg DNA over in een micro centrifugebuis en voeg 9 μL DOTAP toe.</li>
	<li>Zodra het DNA en de DOTAP zijn gecombineerd, veegt u voorzichtig met de microcentrifuge buis om de oplossing te mengen. De DNA/DOTAP oplossing moet na het mengen licht ondoorzichtig worden.</li>
	<li>Als twee plasmiden samen moeten worden geliposinfecteerd (bijvoorbeeld pCS2-GFP met een tweede pCS2 plasmide met een afgeknotte of volledige versie van een gen) in optische neuronen, combineren eerst de twee plasmiden (na het kort centrifugeren) bij een verhouding van 1:1 en voeg vervolgens DOTAP bij een 1:3 (w/v) verhouding. Combineer bijvoorbeeld 1 μg pCS2-GFP met 1 μg van een tweede pCS2 plasmide en voeg vervolgens 6 μL DOTAP toe. Opmerking: Studies hebben aangetoond dat lipofectie van twee plasmiden in de oogtoppen van Xenopus -embryo's in deze ontwikkelingsstadia zal resulteren in hun co-expressie in individuele optische neuronen9,10.</li>
</ol>3. het laden van een micro injectienaald met DNA/DOTAP
<ol><li>Knip voorzichtig de punt van een getrokken glazen microcapillaire pipet met fijne Tang (tabel van materialen).</li>
	<li>Vul de glazen microcapillaire pipet met minerale olie met behulp van een microfil zodanig dat een kleine druppel minerale olie wordt weergegeven op de geknipte punt van de micro pipet. Vul de microcapillaire pipet halverwege met minerale olie.</li>
	<li>Plaats de getrokken glazen microcapillaire pipet die nu is gevuld met minerale olie in een geschikte injectie houder die is aangesloten op een injector. Als u een injector (tabel met materialen) gebruikt, moet u de zuiger halverwege uitwerpen voordat u de microcapillaire pipet erop laadt. Zodra de microcapillaire pipet stevig aan de injector is bevestigd, breidt u de zuiger volledig uit om te bevestigen dat de microcapillaire pipet sterk aan de injector is bevestigd en niet beweegt met de verlenging van de zuiger.</li>
	<li>Breng een druppel van 3 μL van het DNA/DOTAP mengsel over op een snij vierkant (1 inch vierkant) blad van paraffine papier.</li>
	<li>Onder een stereo-ontdubbelende Microscoop beweegt u de punt van de glazen microcapillaire pipet in de druppel DNA/DOTAP.</li>
	<li>Zuig langzaam het DNA/DOTAP in de glazen microcapillaire pipet met behulp van de vuloptie op het injectie apparaat. Naarmate de vloeistof in de microcapillaire pipet wordt geladen, wordt de druppel kleiner. Vanwege de geringe dekking van de DNA/DOTAP-oplossing moet de grens tussen de minerale olie en de DNA/DOTAP-oplossing zichtbaar zijn in de glazen microcapillaire Pipet (Figuur 1). Indien nodig, stop dan regelmatig met het vullen van de microcapillaire pipet om de druk in de glazen microcapillaire pipet te laten kalibreren.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60123/60123fig01v2.jpg"> Figuur 1: afbeeldingen van microcapillaire pipet. Afbeeldingen tonen een microcapillaire pipet op het injectie apparaat, vóór (a) en na (B) vullen met DNA/dotap. Open pijlen, uiteinde van de zuiger in de microcapillaire Pipet (A, B). Gesloten pijl, lijn tussen minerale olie en DNA/DOTAP in de gevulde microcapillaire Pipet (B). Schaalbalk = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60123/60123fig01v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
4. microinjecterend DNA/DOTAP in Eyebuds van 1 dag oude Xenopus -embryo's
<ol><li>Handmatig devitellinize tien fase 20 − 24 Xenopus embryo's met fijne Tang in een 10 mm Petri schaaltje gevuld met 0,1 x MMR. Pak de vitelline envelop in de taille om de embryo's niet te verwonden. Met een tang in zowel de linker-als de rechterhand van de experiteerder, pop de bubbel van de vitelline envelop en laat het embryo los uit de vitelline envelop. Wees voorzichtig om de embryo's niet te verwonden bij het verwijderen van de vitelline envelop. Opmerking: Vanaf stadium 20 ontwikkelen de Xenopus -embryo's een inkeping of ' taille ' tussen de voorste en achterste helft van het embryo. Deze taille zorgt voor een kloof tussen de vitelline envelop en het embryo op deze positie.</li>
	<li>Gebruik een plastic Transfer pipet met een snijpunt om 5 − 10 devitellinized stage 22 − 24 embryo's over te brengen tot een 10 mm Petri schaaltje gevuld met 1x MMR. Opmerking: De hogere zoutoplossing in 1x MMR vergemakkelijkt de genezing van prikwonden die het gevolg zijn van de micro injectie.</li>
	<li>Onder de stereomicroscoop, pak een van de devitellinized embryo's in de Petri schaal met een tang in elke hand, en regelen het embryo zodat de voorste paal wordt gewezen in het gezichtsveld. Oriënteer het embryo zodat het zijdelings liggend is en een van de oogtoppen (links of rechts) naar boven is gericht.</li>
	<li>Onder de stereomicroscoop, houd het embryo met de Tang in de niet-dominante hand van de experimenteerder, en met de dominante hand van de experimenteerder introduceren de punt van de glazen micro pipet in het oogdopje (van de ventrale of de rugzijde, afhankelijk van de helft van het embryo dat momenteel wordt geïnjecteerd), net onder de epidermis (Figuur 2). Injecteer tussen 70 − 210 nL van de DNA/DOTAP oplossing. Dit kan worden gedaan in verschillende pulsen, afhankelijk van de grootte van de puls de injector is ingesteld op (meestal 70 nL). Opmerking: De verdichtigheid van de injectie is zeer belangrijk voor lipofectie in optische neuronen. Als de positie van de punt van de microcapillaire correct zeer oppervlakkig in het oogdopje wordt ingebracht, dan zal na micro injectie de grijze epidermis die de oogknop oversteekt, zwellen. Als de positie te diep is, zal de grijze oogknop geen veranderingen vertonen, en de frequentie van de expressie van het DNA in optische neuronen zal lager zijn.</li>
	<li>Draai het embryo om en voer dezelfde micro injectie uit in de oogdopje op de contralaterale kant van het embryo.</li>
	<li>Injecteer beide oogtoppen van 6 − 10 (of meer) embryo's in elk experiment.</li>
	<li>Na micro injectie, bewaar embryo's in een Petri schaaltje met 1x MMR gedurende ongeveer 30 minuten om de wondgenezing te vergemakkelijken.</li>
	<li>Na 30 minuten, overdracht van geïnjecteerde embryo's in een 0,1 x MMR oplossing met 0,001% bleekmiddel (fenylthiocarbamide) om pigmentatie te verminderen. Kweek de embryo's ongeveer vijf dagen, totdat de embryo's zijn uitgebouwd tot kikkers in stadia 46 − 4716.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60123/60123fig02v2.jpg"> Figuur 2: afbakening van de eyebud-regio voor micro injectie. Schematische (a) en photomicrograph (B) van X. laevis embryo in ontwikkelingsstadia 22/23 Toon eyebud Region die moet worden gericht op micro Injection (rode Highlights). Schaalbalk = 1 mm. panel A is gewijzigd van Zahn et al.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60123/60123fig02v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
5. beeldvorming van GFP uitdrukken van optische axonale Arbors in intact, levende tadpoles
Opmerking: Wanneer kikkers die waren lipoffecteerd met DNA bereiken ontwikkelingsstadia 46 − 47, ze zijn klaar voorbeeld vorming.
<ol><li>Voorafgaand aan de beeldvorming moeten kikkers verdoiliseerd worden. Om kikkers te verdoven, overdracht van de lipogeffecteerde kikkers in een 0,02% tricaïne oplossing in DDH2O in een 10 mm Petri schaal. Wacht 5 − 10 min totdat kikkers immobiel worden. Controleer of kikkers nog in leven zijn door het observeren van hun kloppend hart onder een stereo ontleed Microscoop.</li>
	<li>Plaats een verdoving Tadpole in een op maat gemaakte siliconen kamer op een glazen glijbaan en afdichting met een dekglaasje. De Tadpole moet lichtjes kantelen, zodat de ene kant (links of rechts) van zijn hoofd naar boven is gekanteld en net de Afdekstrook raakt.</li>
	<li>Zeef de helft van de dorsale tectale veroorzaakt van de Tadpole die naar boven gekanteld wordt bij lage vergroting voor GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt. Opmerking: Een Widefield staande Microscoop uitgerust met een epilfuorescentie verlichting en een apochromatische objectief lens (tafel van materialen) kan worden gebruikt om te schermen voor fluorescerende Arbors.</li>
	<li>Als de tectale hemisfeer tussen één tot drie GFP uitdrukt, waarbij optische axonale Arbors worden uitgesproken, legt u een z-serie beelden van deze Arbors vast met behulp van een hoog contrast 40x lucht lange werkafstand doel (tabel van materialen). Leg voor elke axonale Arbor 10 − 20 z-serie segmenten vast met intervallen van 1,5 μm.</li>
	<li>Om axon-Arbors aan de andere kant van de tectal-middenhersenen te bekijken, laadt u de Tadpole in de silicium kamer zodanig dat deze naar de andere zijde en afdichting met een afdekplaat kankeert. Herhaal vervolgens de stappen 5,3 en 5,4.</li>
</ol>6. reconstructie en kwantificering van optische axonale Arbor morfologie
<ol><li>Selecteer een afbeeldingsstapel die bestaat uit één tot drie GFP die optische axonale Arbors uitdrukt.</li>
	<li>Gebruik de FreeHand drawing tool in grafische bewerkingssoftware (tabel met materialen) om het gedeelte van elke optische axonale Arbor te traceren dat zichtbaar is in elke z-slice. Tracing door de stukken van elk prieel duidelijk in elke z-Slice zal een nauwkeurige 2D projectie van het prieel te creëren. Verschillende kleuren kunnen worden gebruikt voor het traceren van afzonderlijke GFP uitdrukken optische axonale Arbors.</li>
	<li>Maak alle morphometrische metingen op 2D reconstructies van de axonale Arbors, met verwijzing naar de originele z-serie beelden indien nodig7. Met behulp van afbeelding J software (tabel van de materialen), het meten van morfologische parameters zoals het aantal takken (dat wil zeggen, aantal tak tips of tak punten), totale Arbor tak lengte, lengte per tak, lengte en breedte van Arbor, algemene vorm van Arbor (L/W verhouding, circulariteit) en hoek van takken7.</li>
</ol>

<ol><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-195 (2011).</li>
<li>Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synapse+formation+in+arborizing+optic+axons+in+vivo%3A+dynamics+and+modulation+by+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).</li>
<li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axons+with+and+without+their+somata%2C+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos%3A+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li>
<li>Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Map+formation+in+the+developing+Xenopus+retinotectal+system%3A+an+examination+of+ganglion+cell+terminal+arborizations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations.</a> Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).</li>
<li>Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-and+C-terminal+domains+of+%CE%B2-catenin%2C+respectively%2C+are+required+to+initiate+and+shape+axon+arbors+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).</li>
<li>Wiley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK-3%CE%B2+and+%CE%B1-catenin+binding+regions+of+%CE%B2-catenin+exert+opposing+effects+on+the+terminal+ventral+optic+axonal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection.</a> Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).</li>
<li>Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+and+central+domains+of+APC+function+to+regulate+branch+number%2C+length+and+angle+in+developing+optic+axonal+arbors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo.</a> Brain research. 1697, 34-44 (2018).</li>
<li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li>
<li>Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection+of+cDNAs+in+the+Embryonic+Vertebrate+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System.</a> Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).</li>
<li>Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection+strategy+for+the+study+of+Xenopus+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development.</a> Methods. 28 (4), 411-419 (2002).</li>
<li>Joesch, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+circuit+for+colour+vision+based+on+rod-cone+opponency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency.</a> Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).</li>
<li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li>
<li>Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+transcription+factor+AP-2%CE%B4+in+developing+retina%3A+effect+on+PSA-NCAM+and+axon+routing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing.</a> Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li>
<li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Developmental Biology. 7, 107(2007).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2000).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , North Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).</li>
<li>Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zahn+drawings%3A+new+illustrations+of+Xenopus+embryo+and+tadpole+stages+for+studies+of+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development.</a> Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).</li>
<li>Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-protocadherin+and+TAF1+regulate+retinal+axon+initiation+and+elongation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).</li>
<li>Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ena%2FVASP+function+in+retinal+axons+is+required+for+terminal+arborization+but+not+pathway+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation.</a> Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).</li>
<li>Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-Protocadherin+Regulates+Retinal+Ganglion+Cell+Axon+Behaviour+in+the+Developing+Visual+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System.</a> PLOS One. 10 (10), e0141290(2015).</li>
<li>Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+aided+alignment+and+quantitative+4D+structural+plasticity+analysis+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons.</a> Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel laten we zien hoe u exogene DNA-constructies in enkele of kleine aantallen optische neuronen uitdrukt en hoe u afzonderlijke GFP-uitbeeldende optische axonale Arbors met normale en veranderde moleculaire signalering in intact, levende kikkers van de kikker X . laevis. We leggen ook uit hoe we de morfologie van GFP, die optische axonale Arbors uitdrukt, van beelden die in vivo zijn vastgelegd, kunnen reconstrueren en kwantificeren. Om exogene DNA-plasmiden uit te drukken in een klein aantal optisch...

Tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel navigeren axonen van presynaptische neuronen door verschillende hersengebieden om hun doelgebieden te bereiken. Wanneer axonen hun doelweefsels binnendringen, vestigen ze synaptische verbindingen met postsynaptische doel neuronen. In vele soorten neuronen, axonen verhogen het aantal en ruimtelijke omvang van synaptische verbindingen die ze kunnen maken door het uitwerken van netwerken van Terminal takken of Arbors1. De retino-tectal projectie van kikkers van de aquatische kikker Xenopus laevis is een krachtig gewervelde model voor het onderzoeken van mechanismen onderliggende terminale axon-arboriisatie en synaptische connectiviteit2,3,4 . Individuele GFP uitdrukken optische axonale Arbors met normale en veranderde moleculaire signalering kan direct worden waargenomen in intact, levende Xenopus kikkers5,6,7,8. Om GFP alleen of in combinatie met volledige of afgeknotte versies van genen in een klein aantal optische neuronen uit te drukken, gebruiken we een techniek waarbij Microinjection/lipofectie van DNA wordt gebruikt in eyebuds van een dag oude Xenopus -embryo's9, 10. deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld om mechanismen van optische axon padvinden te bestuderen in jonge Xenopus tadpoles, en is sindsdien door ons en anderen toegepast om cel-autonome moleculaire mechanismen onderliggende optische axon te bepalen arborisatie in Xenopus kikkers5,6,7,8,9,10.
Alternatieve technieken om exogene genen in een klein aantal optische neuronen uit te drukken zijn ontwikkeld in andere model soorten, evenals in X. laevis. Echter, elk van deze benaderingen presenteert uitdagingen en beperkingen in vergelijking met micro injectie van DNA/lipofection reagens in de oogtoppen van Xenopus embryo's. Bij muizen kan Transgenese worden gebruikt om genen in een klein aantal optische neuronen uit te drukken, maar de generatie van transgene muizen is duur en tijdrovend en transgene muizen zijn vaak aanwezig met ongewenste neveneffecten11. Transgene zebravis die exogene genen in optische neuronen uitdrukken, kan ook worden gecreëerd door plasmiden te injecteren in vroeg splijter stadium embryo's12. Dit proces vereist echter klonen van een specifieke promotor om genen uit te drukken in een mozaïek patroon in oogzenuw cellen in larven van zebravis12. De frequentie van expressie van exogeen DNA in optische neuronen in transgene zebravis is ook iets lager (< 30%) vergeleken met Xenopus kikkers die microgeïnjecteerd waren met DNA/liposomaal reagens (30 − 60%)12. In OVO is elektroporation ook gebruikt om genen in kleine aantallen optische neuronen in kuikens13uit te drukken. Echter, deze procedure is niet volledig karakteriseren mechanismen die optische projecties vast te stellen, omdat optiek axon arborization niet kan worden afgebeeld in intact, levende Chick embryo's. Tot slot hebben verschillende laboratoria elektroporation gebruikt om genen te transfect in een klein aantal optische neuronen in Xenopus kikkers14,15. Toch vereist elektroporation optimalisatie van apparatuur en protocollen (stimulator, elektroden, ruimtelijke en temporele patronen van Golf pulsen) dan die gebruikt voor micro injectie van DNA/lipofection reagens in de oogtoppen van Xenopus embryo's.
Wij en anderen gebruikten eerder de techniek van Microinjection/lipofectie van DNA in de eyebuds van Xenopus -embryo's om cel autonome signalerings mechanismen te bepalen die optische axon-arborization5,6, 7 , 8. in eerste instantie gebruikten we deze aanpak om de functies van de cadherin en WNT adaptor proteïne β-bovenarm in de optische axonale arboriisatie in Xenopus kikkers5,6te ontleden. In een studie toonden we aan dat β-bovendeel binding aan α-bovendeel en aan PDZ respectievelijk vereist is voor het initiëren en vorm geven van optische axonale Arbors in vivo5. In een tweede rapport lieten we zien dat de β-Bovenkabel in bindings gebieden voor α-bovendeel en GSK-3β-tegengesteld moduleren projectie patronen van ventrale optische axonale Arbors6. Meer recentelijk, we geïdentificeerd rollen voor de Wnt factor, adenomateuze poliposis coli (APC), bij het reguleren van de morfologische kenmerken van optische axonale Arbors in Xenopus kikkers7. Door de N-Terminal en de centrale domeinen van de APC, die β-bovenlijnen in stabiliteit en microtubulus samen met GFP in individuele optiek neuronen moduleren, gezamenlijk uit te drukken, hebben we gedeelde en duidelijke rollen vastgesteld voor deze APC-interactie domeinen op het filiaalnummer, lengte en hoek in optische axonale Arbors in vivo7. Een ander laboratorium gebruikt de Microinjection/lipofection-techniek om cel autonome rollen te bepalen voor signalering door de BDNF-receptor, trkb, in optische axonale Arbors in Xenopus kikkers8. Deze groep toonde aan dat expressie van een dominante-negatieve trkb verontrust vertakkingen en synaptische rijping in individuele optische axon Arbors in vivo8. Over het algemeen heeft de lipofection-techniek in Xenopus al de specifieke rollen van verschillende genen in optiek axon vertakkingen in de inheemse omgeving verlicht.

<table><tbody><tr><td>3.5" Micropipettes</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 - G/X</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-manager software (Version 1.4)</td><td>Vale Lab</td><td></td><td>www.micro-manager.org</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Scion Corporation</td><td>CFW-1312 M</td><td></td></tr><tr><td>Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin)</td><td>AtoZ Vet Supply</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149-100G</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11202375001</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11250-10</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800 epifluoresence microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Objectieven: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75</td></tr><tr><td>GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10)</td><td>GIMP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator (2017 Creative Cloud)</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Version 1.46r)</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF 34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator met universele adapter en steunbasis</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-024-R</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>3-000-025-SB</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>3-000-024-A</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Gemotoriseerde z-stage</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MFC-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II injector</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Powerpoint (Version 15.31)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis embryo's</td><td>Nasco</td><td>LM00490</td><td></td></tr></tbody></table>

micro injectie van dna in de oogtoppen van xenopus laevis embryo's en beeldvorming van gfp dat optische axonale arbors uitdrukt in intact, levend xenopus tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

De primaire visuele projectie van kikkers van de aquatische kikker Xenopus laevis fungeert als een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van mechanismen die de ontwikkeling van neuronale connectiviteit reguleren. Tijdens de oprichting van de retino-tectal projectie, strekken de optische axonen zich uit het oog en navigeren door verschillende hersengebieden om hun doelweefsel, de optiek Tectum, te bereiken. Zodra de optiek axonen het Tectum betreden, werken ze met Terminal Arbors die functioneren om het aantal synaptische verbindingen te verhogen dat ze kunnen maken met doel-interneuronen in het Tectum. Hier beschrijven we een methode voor het uitdrukken van DNA-codering groene fluorescerende eiwitten (GFP), en winst-en verlies-van-functie-genconstructies, in optische neuronen (retinale ganglioncellen) in Xenopus -embryo's. We leggen uit hoe een gecombineerd DNA/lipofection-reagens microinjecteert in de oogtoppen van een dag oude embryo's, zodat exogene genen worden uitgedrukt in enkele of kleine aantallen optische neuronen. Door genen te taggen met GFP of co-injecteren met een GFP plasmide, kunnen terminale axonale Arbors van individuele optische neuronen met veranderde moleculaire signalering direct worden afgebeeld in de hersenen van intact, levende Xenopus kikkers enkele dagen later, en hun morfologie kunnen worden gekwantificeerd. Dit protocol maakt het mogelijk om cel-autonome moleculaire mechanismen te bepalen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van optische axon-arboriisatie in vivo.

Het in dit artikel beschreven protocol levert een slagingspercentage op van 30 − 60% van de geïnjecteerde Xenopus -embryo's die GFP (alleen of samen met een extra DNA-constructie) in één tot tien optische axonale Arbors uitdrukken. In Figuur 3tonen we representatieve confocale beelden van GFP uitdrukken van controle en Mutant optische axonale Arbors in intact Xenopus kikkers uit onze onlangs gepubliceerde studie7. Voor deze studie hebben we twee dome...

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

In deze video laten we zien hoe exogene DNA-constructies kunnen worden uit te drukken in optische neuronen en hoe individuele GFP-uitdrukkende axonale arbors in intacte, levende Xenopus laevis kikkervisjes kunnen worden afgebeeld. Dit is een goedkope, eenvoudige procedure voor voorbijgaande celspecifieke transgenese die het mogelijk maakt celautonoome genfunctie in individuele optische axonale prieel arbors, ontwikkelen in een levend gewerveld modelsysteem. Het demonstreren van de procedure zal ik zijn, Sophia Dao, Research Assistant, en Dr. Tamira Elul, Lab Principal Investigator.Om te beginnen, voorzichtig clip de punt van een getrokken glazen micro capillaire pipet met fijne tangen. Vul de glazen micro capillaire pipet met minerale olie met behulp van een MICROFIL zodanig dat een kleine druppel minerale olie verschijnt op de afgeknipte punt van de micro pipet. Vul de glazen micro capillaire pipet halverwege met minerale olie.In een injector, uitwerpen van de zuiger halverwege en laad de getrokken glazen micro capillaire pipet in de injectiehouder. Breid vervolgens de zuiger volledig uit om te bevestigen dat de micro capillaire pipet sterk aan de injector is bevestigd en niet beweegt met de uitbreiding van de zuiger. Breng een drie microliter druppel van het DNA / DOTAP mengsel op een een centimeter vierkant vel paraffine papier.Onder een stereo ontleden microscoop, verplaats de punt van de glazen micro capillaire pipet in de DNA / DOTAP drop. Gebruik de vuloptie op het injectieapparaat, zuig langzaam de DNA/DOTAP-druppel in de glazen micro capillaire pipet. De grens tussen de minerale olie en de DNA/DOTAP-oplossing is zichtbaar in de glazen micro capillaire pipet door de lichte dekking van de DNA/DOTAP-oplossing.Stop indien nodig met het periodiek vullen van de micro capillaire pipet om de druk in de glazen micro capillaire pipet opnieuw te kunnen kalibreren. Ten eerste, in een 10 milliliter petrischaal gevuld met 0,1X MMR, handmatig de-vitellinize 10 fase 20 tot 24 Xenopus embryo's met fijne tangen. Pak de vitelline envelop in de taille om te voorkomen dat het verwonden van de embryo's.Met tangen in zowel de linker- als rechterhand van de onderzoeker, pop de bel van de vitelline envelop en laat het embryo uit de vitelline envelop. Zorg ervoor dat u de embryo's niet verwondt bij het verwijderen van de vitelline envelop. Gebruik vervolgens een plastic transfer pipet met een cut tip om vijf tot 10 gede-vitellinized fase 22 tot 24 embryo's over te brengen naar een 10 milliliter petrischaal gevuld met 1X MMR.Grijp onder een stereomicroscoop een van de gede-vitellinized embryo's in de Petrischaal met tangen en schik het embryo zo dat de voorste paal in het gezichtsveld wordt gericht. Oriënteer het embryo dan zodat het zijwaarts ligt en een van de oogknoppen van links naar rechts naar boven kijkt. Houd het embryo met de tang in de niet-dominante hand van de experimentator en met de dominante hand van de onderzoeker, introduceer de punt van de glazen micropipet van de ventrale of dorsale kant net onder de opperhuid in de oogknop.Injecteer tussen de 70 en 210 nanoliters van de DNA/DOTAP oplossing. Draai vervolgens het embryo om en voer dezelfde micro-injectie uit in de andere oogknop aan de contralaterale kant van het embryo. Injecteer beide oogknoppen van zes tot tien embryo's in elk experiment.Na micro-injectie, bewaar embryo's in een petrischaaltje met 1X MMR gedurende ongeveer 30 minuten om wondgenezing te vergemakkelijken. Breng na 30 minuten de geïnjecteerde embryo's met een plastic transferpipet over in een 0,1X MMR-oplossing met 0,001% bleekmiddel fenylthiocarbamide om pigmentatie te verminderen. Bedek de petrischaal met een deksel om de embryo's ongeveer vijf dagen te verkassen totdat de embryo's zich in de stadia 46 tot 47 tot kikkervisjes hebben ontwikkeld.Dit protocol levert een slagingspercentage op van 30 tot 60% van de geïnjecteerde Xenopus embryo's die GFP uitdrukken in één tot 10 optische axonale prieel arbors. Representatieve confocale beelden van GFP tonen de uitdrukkende controle en gemuteerde axonale prieel arbors in de intacte Xenopus kikkervisjes. Twee domeinmutanten van APC, APCNTERM en APBbeta-cat werden gekloond tot pCS2 plasmiden.Z-serie beelden van GFP controle en APC mutant axonale prieel arbors werden gereconstrueerd. Percelen van het aantal takken, de totale duur van de prieeltak en de gemiddelde taklengte bevestigen waargenomen verschillen tussen controle en APC-mutant die axonale prieelverbramen uitdrukken. Extra spreidingspercelen van het aantal vertakkingen versus gemiddelde taklengte met regressielijnen vertonen omgekeerde correlatie tussen deze parameters en optische axonale prieel arbors die APC-domeinen uitdrukken.De punt van de micro capillaire pipet moet correct zeer oppervlakkig in de oogknop worden ingebracht, zodat de grijze opperhuid die de oogknop boven de oogknop opzwelt tijdens elke micro-injectie. Deze procedure kan worden gebruikt om zowel label en verandering specifieke genetische functie in optische neuronen, terwijl de beoordeling van de groeiende, targeting, en vertakking van axonen van deze optische neuronen. Deze DNA micro-injectie en lipofection techniek heeft onderzoekers in ontwikkelingsneurobiologie toegestaan om cel autonome moleculaire mechanismen die optische axon arborization reguleren in intacte, levende Xenopus laevis kikkervisjes te bestuderen.

microinjection-dna-into-eyebuds-xenopus-laevis-embryos-imaging-gfp

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier laten we zien cytoplasmatische micro-injectie...

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Hier presenteren wij twee technieken voor het manipuleren van genexpressie in muriene retinale ganglioncellen (RGC)...

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

Deze video laat zien hoe axonale paden van genetisch bepaalde groepen neuronen te visualiseren in de embryonale kuiken ruggenmerg gebruik te maken...

Ontcijfering Axonale Pathways van genetisch bepaalde groepen van neuronen in de Chick Neural Tube Door gebruik te maken In ovo Elektroporatie

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

Xenopus embryonale ectoderm is uitgegroeid tot een aantrekkelijk model voor onderzoek van de cel polariteit. Een test wordt beschreven, waarin de subcellulaire distributie van fluorescerende eiwitten wordt beoordeeld in het ectoderm cellen. Dit protocol zal helpen met vragen met betrekking tot ruimtelijke controle van de signalering.

Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering

Een methode voor de integratie van plasmide DNA in het netvlies van muizen cellen voor het verrichten van een winst-of verlies van functie...

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

Neurale Explantatie Culturen van<em&gt; Xenopus laevis</em

Wij rapporteren hier de robuuste en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten na mRNA injectie in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek in deze basale chordate zal de weg voor vergaande technische innovaties in deze opkomende model systeem, met inbegrip van in vivo beeldvorming en gen-specifieke manipulaties effenen.

Expressie van fluorescerende eiwitten in Branchiostoma lanceolatum Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

Hier presenteren we een protocol om bestemmingskaarten en lijntracers te gebruiken om injecties in individuele blastomeren te richten die aanleiding geven tot de nier van Xenopus laevis embryo's.

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Leer micro-injectie van DNA in oogknoppen van Xenopus laevis embryo's voor neurobiologisch onderzoek. Deze methode maakt GFP-visualisatie van optische axonale arborisatie in levende kikkervisjes mogelijk.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryos en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles (Video) | JoVE Journal

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Meer video's verkennen