Name: Het meten van de diurnale ritmes in autophagic en Proteasomale flux (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer diurnale ritmen meten in autophagic en proteasomale flux in muizenlever met dit in vivo protocol. Deze methode detecteert circadiane variaties in eiwitkatabolisme voor metabool onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door RO1HL135846 en een Children's Development Institute subsidie (PD-II-2016-529).

Het hier beschreven protocol werd goedgekeurd door de Washington University in St. Louis Animal Care and use Committee (IACUC).
1. muisbehuizing en experimenteel ontwerp
<ol><li>Om dagelijkse ritmes in eiwit omzet te detecteren, huis muizen (mannelijk of vrouwelijk C57BL/6J, 4 − 8 week oud, 20 − 25 g) onder standaard 12 h licht/donkere cycli met voedsel verstrekt ad libitum. Om te voorkomen dat de dieren te benadrukken, acclimatiseren muizen gedurende ten minste één week in de faciliteit voorafgaand aan gebruik en Vermijd één behuizing. Om te bewijzen dat ritmes in eiwit katabolisme echt circadiane zijn (d.w.z., gedreven door de interne biologische klok van het dier), huis muizen onder constante donkere omstandigheden, het verzorgen van het blootstellen van de muizen aan exogene licht. Opmerking: Voor meer informatie over de muisbehuizing voor circadiane ritme experimenten, zie de volgende verwijzing11.</li>
	<li>Wijs voor elk tijdspunt drie muizen toe als schijn controles en ten minste drie muizen voor elk type proteaseremmer (leupeptine voor autophagische flux en bortezomib voor proteasomale flux metingen). Plan voor zes tijdpunten gelijkmatig verdeeld over 4 h intervallen over de dag/nacht cyclus om weefselmonsters te verkrijgen. Opmerking: Een experiment van 24 uur, 6 tijdpunt met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), leupeptine en bortezomib vereisen in totaal 54 muizen (3 per behandeling x 3 behandelingen x 6 tijdpunten).</li>
</ol>2. bereiding van homogenisatie oplossing, remmers voorraadoplossingen, en flesjes voor muis lever collectie
<ol><li>Bereid verse homogenisatie buffer (HB) en blijf op ijs: 10 mM tris-HCl pH 7,5, 250 mM sucrose, 5 mM EDTA pH 8,0, en 1 proteaseremmer tablet per 100 mL. Opmerking: Per muis is ongeveer 10 mL HB nodig.</li>
	<li>Voor de downstream-verwerking van biologische monsters vereist elk monster een conische buis van 15 ml om het ruwe homogenaat vast te houden, een buis van 15 ml om de post-nucleaire supernatant te houden, twee 1,5 ml micro centrifugebuizen om de 3.000 x g en 20.000 x g gepileerde te houden materiaal, respectievelijk, en een 1,5 mL microcentrifuge buis te houden van de cytoplasmische Fractie. Voeg 7 mL koude HB toe aan elke buis die bestemd is voor ruw homogenaat en blijf op ijs.</li>
	<li>Bereid een 2 mg/mL stamoplossing van leupeptine Hemi-sulfaat in steriel PBS. Bereid ook een 50 mg/mL oplossing van bortezomib in dimethylsulfoxide (DMSO). Aliquot en bewaar de oplossingen bij-80 °C.</li>
</ol>3. toediening van proteaseremmers
<ol><li>Ontdooien van leupeptine (2 mg/mL) en bortezomib (50 mg/mL) stockoplossingen op kamertemperatuur 15 min voorafgaand aan elk tijdpunt. De leupeptin kolf is klaar voor injectie. Verdun de bortezomib in steriele PBS om een werkoplossing van 50 μg/mL te leveren. Opmerking: Bortezomib is lichtgevoelig, dus Bescherm de werkvoorraad tegen licht tot gebruik.</li>
	<li>Weeg muizen en voer intraperitoneale injecties met "Sham" PBS (0,5 mL), leupeptine (40 mg/kg) of bortezomib (1,6 μg/kg) uit. Retourneer muizen naar naar behoren gemarkeerde kooien gegroepeerd op het type injectie dat ze ontvingen. Noteer de tijd waarop de muizen worden behandeld of gemanipuleerd in een gestandaardiseerde tabel (Zie aanvullende bestand "Voorbeeldgegevens"). Opmerking: Een dosis Calculator is opgenomen als een hulpmiddel in het aanvullende bestand "Sample Data". Het is belangrijk om de injecties met spoed en in dezelfde volgorde uit te voeren van tijdpunt tot tijdpunt om variabiliteit te minimaliseren.</li>
</ol>4. weefsel verwerving en-opslag
<ol><li>Twee uur na de injectie, euthanitering van muizen een voor een volgens het institutioneel goedgekeurde IACUC-protocol. Bijvoorbeeld, verdoven muizen dan euthanaseren door cervicale dislocatie. Ga naar de dissectie stap onmiddellijk na euthanasie. Opmerking: Zorg voor volledige anesthesie vóór cervicale dislocatie door knijpen voorpoten zonder een waarneembare reflex.</li>
	<li>Verwijder de linker LOB van de lever door het maken van een 1,5 tot 2,0 cm incisie met Metzenbaum schaar op de buik van de muis. Externalize de linker kwal van de lever en accijns met een chirurgische schaar. Dompel het lever monster in 7 mL ijskoude HB in een met de juiste label 15 mL conische buis. Houd het monster op ijs tijdens de verwerking. Opmerking: De monsters kunnen worden bewaard op ijs of bij 4 °C 's nachts alvorens verder te gaan. Als standaard markers van macroautophagie en proteasomale activiteit de enige beoogde uitlezingen zijn, kunnen lever monsters in vloeibare stikstof worden bevroren en bij-80 °C worden opgeslagen voor latere verwerking. Om andere doelen van afbraak te onderzoeken (bijvoorbeeld via Proteomics), de monsters te verwerken zonder bevriezing.</li>
	<li>Ga door met het euthaniëren en ontleden van de volgende muis totdat alle monsters zijn verworven. Proces muizen in dezelfde groeps volgorde ze werden geïnjecteerd en noteer de duur van deze stap (Zie aanvullend bestand "voorbeeldgegevens"). Elke muis moet in minder dan 5 minuten worden verwerkt om het verschil in de blootstellings tijden voor de geïnjecteerde remmers te beperken.</li>
</ol>5. biochemische fractionering van lever monsters
Opmerking: Afbeelding 1B toont het fractionering-schema.
<ol><li>Breng elk lever monster en 7 mL HB over in een 15 mL-homogenisator. Homogeniseren het monster met 10 slagen van de losse zuiger en 15 slagen van de strakke zuiger. Retourneer het resulterende ruwe homogenaat in de conische buis van 15 mL waaruit het afkomstig is. Herhaal dit totdat alle lever monsters zijn gehomogeniseerd.</li>
	<li>Spin ruw homogenaat monsters bij 700 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c tot pellet kernen en puin. Breng de bovenste 4 mL post-nucleaire supernatant (S1) over in een nieuwe conische buis van 15 ml.</li>
	<li>Bepaal de eiwitconcentratie van Fractie S1 met behulp van Bradford of bicinchoninic acid (BCA) assays volgens de instructies van de fabrikant. Volgende Egaliseer de concentraties van alle monsters tot 2,1 mg/mL of naar de gewenste concentratie door toevoeging van verse HB aan S1 waar nodig. De genormaliseerde monsters zijn de "totale proteïne" (tot) breuk. Voor downstreamanalytische doeleinden en kwaliteitsverbetering, aliquot 500 μL van de tot -Fractie en opslag bij-80 °c.</li>
	<li>Breng 1,5 mL van de overblijvende tot -Fractie over in een microcentrifuge buis en spin bij 3.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Breng 1 mL van het resulterende supernatant (S2) over in een nieuwe micro centrifugebuis en stel op ijs.</li>
	<li>Aspireren de overgebleven supernatant en was de 3.000 x g pellet (3kp) tweemaal met 1,5 ml koude HB. De 3Kp -pellet kan droog worden bewaard bij-80 °c als de downstream proteomica wordt verwacht. Als alleen westerse blotting wordt verwacht, respendeer de 3Kp -pellet in 200 μL natriumdodecylsulfaat Polyacrylamide-elektroforese (SDS-page) monster buffer (tabel met materialen) en kook gedurende 5 minuten bij 95 °c.</li>
	<li>Draai de S2 -fractie op 20.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c. Breng de resulterende supernatant (S3) over naar een nieuwe micro centrifugebuis. S3 is de cytoplasmatische (cyto) Fractie. Combineer voor SDS-PAGE 150 μL cyto -breuk met 50 μL van 4x SDS-page sample buffer en kook bij 95 °c gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Aspireren de overgebleven supernatant van de 20.000 x g pellet (20kp) en was tweemaal met 1,5 ml koude HB. De 20Kp -pellet kan droog worden bewaard bij-80 °c als de downstream proteomica wordt verwacht. Als alleen westerse blotting wordt verwacht, respendeer de 20Kp -pellet in 100 μL SDS-page sample buffer en kook bij 95 °c gedurende 5 minuten.</li>
</ol>6. Western blotting uitlezen
<ol><li>Om macroautophagische en proteasomale flux via Western blotting te kwantificeren, componeren we een stamoplossing van gezuiverde GST-LC3b (2 μg/mL), P62-zijn6 (2 μg/ml), en Lys48 gekoppeld Polyubiquitine (K48-UB, 50 μg/ml) in 1x SDS-page sample buffer. Na koken bij 95 °C gedurende 5 min, aliquot en bewaren bij-80 °C voor toekomstig gebruik.</li>
	<li>Op het moment van SDS-PAGE genereert u een 6-punts standaard curve van het standaard proteïne mengsel door de 1:3 in 1x SDS-PAGE sample buffer te verdunen. Laad 10 μL van elk standaard curve monster op een 26 well 4 − 12% SDS-PAGE Midi-gel, gevolgd door voorgebeitst eiwit normen (tabel van materialen), een commerciële molecuulgewicht standaard.</li>
	<li>Voor het meten van de autophagische flux, laadt u 12 μL 3Kp -monster in elke put. Opmerking: Uitgaande van schijnvertoning, bortezomib en leupeptine behandelingen en uitgaande van 3 muizen per behandeling, moet elk tijdspunt uit 9 monsters bestaan. Daarom is elke MIDI-gel geschikt voor 2 tijdpunten plus de standaard curve en een typische time series experiment zal 3 Midi-gels voor uitlezen vereisen.</li>
	<li>Voor het meten van de proteasomale flux, laadt u 12 μL cyto -breuk in elke put.</li>
	<li>Afzonderlijke eiwit monsters door SDS-PAGE en overbrengen naar Polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen met behulp van standaardprotocollen. Als Western blotting voor LC3b wordt verwacht, Transfer gels met behulp van 20% methanol-bevattende overdrachts buffer. Gebruik anders 10% methanol-bevattende overdrachts buffer, omdat dit een efficiëntere overdracht van eiwit soorten met hoog moleculair gewicht mogelijk maakt.</li>
	<li>Voer Western blotting uit met standaardprotocollen. Voor het analyseren van macroautophagische flux, bevatten DEP-membranen met 3Kp -monsters met anti-P62-of anti-LC3b antilichamen (1:1000) een nacht bij 4 °c. Voor het analyseren van proteasomale flux, DEP membranen met cyto monsters met anti-Lys48 specifieke polyubiquitine (1:1000) 's nachts bij 4 °c.</li>
	<li>Afbeelding Western blots met behulp van standaard secundaire antilichamen en imaging apparaten. Afbeelding alle membranen die een bepaalde tijd serie experiment samen vormen.</li>
</ol>7. gegevensanalyse
Opmerking: Zie aanvullende bestand "voorbeeldgegevens".
<ol><li>Voor het uitvoeren van densitometrie op Western Blot samples, gebruik van standaard grafische software, image Studio, of als alternatief imagej.</li>
	<li>Het uitvoeren van densitometrische metingen op de banden van belang voor zowel de standaard curve en de experimentele monsters. In image Studio, met behulp van P62 als voorbeeld, teken een lange rechthoek met eiwit monomeer aan de onderkant en uitbreiden naar de bovenkant van het membraan. Kopieer, plak en verplaats de rechthoek naar de resterende voorbeelden. Het is belangrijk om de rechthoek te houden die wordt gebruikt voor kwantificering consistent tussen monsters.</li>
	<li>Sla de kwantificering op in een werkblad door rechtsonder in het analyse venster op rapport en Start spreadsheet te drukken.</li>
	<li>Genereer een densitometrische standaard curve met spreadsheet met behulp van het seriematig verdunde standaardmonster en gebruik lineaire of polynomiale regressie om een standaard curve vergelijking te verkrijgen. Gebruik deze vergelijking om de hoeveelheid P62, LC3b-II of Lys48-poly UB in de experimentele monsters te extrapoleren.</li>
	<li>Om flux metingen te verkrijgen, trekt u de geëxtregeerde eiwit hoeveelheid van elk met een remmer behandeld monster af van de gemiddelde waarde van de PBS-monsters vanaf hetzelfde tijdspunt (Zie aanvullende bestand "voorbeeldgegevens").</li>
	<li>Evalueer de statistische significantie van temporele variatie in eiwit omzet met behulp van 1-weg ANOVA. Dit kan worden gedaan met behulp van standaard spreadsheet software.</li>
</ol>

<ol><li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meter+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li>
<li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li>
<li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li>
<li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li>
<li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li>
<li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+protein+degradation%3A+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li>
<li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Logic+of+the+26S+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li>
<li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
<li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li>
<li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Ons protocol beschrijft een technisch eenvoudig middel voor het meten van biologische ritmes in eiwit omzet bij muizen die gebruikmaken van algemeen verkrijgbare moleculaire biologie apparatuur. Vanwege de duur van de tijdreeksen experimenten en het aantal betrokken biologische monsters, is het belangrijk om consistent te zijn over het hele experiment met betrekking tot hoe de muizen worden geïnjecteerd, de timing van weefsel verwerving en de biochemische verwerking van Monsters. De injectie, euthanasie en cervicale disl...

Circadiane ritmes verwijzen naar dagelijkse, voorspelbare variaties in biologische functie die zichtbaar zijn in de hele natuur. Ze bestaan op elke biologische schaal, van macroscopisch gedrag zoals slaap-waak cycli, tot moleculaire fenomenen zoals de ritmische overvloed van biomoleules. In de afgelopen jaren is het onderzoek naar circadiane ritmes getransformeerd door de ontdekking van "klok genen" die van cruciaal belang zijn voor de circadiane ritme generatie. Studies in de klok Gene knock-out muizen hebben een centrale rol voor circadiane ritmes onthuld in het tijdelijk organiseren van kern cellulaire processen zoals metabolisme1. Onder de manieren die circadiane ritmes maken dit gebeurt door het doorvoeren van een temporele structuur aan eiwit katabolisme.
Verschillende groepen, waaronder de onze, hebben aangetoond dat de twee belangrijkste wegen voor cellulaire eiwit katabolisme, autophagie en het ubiquitin-proteasome-systeem, onderhevig zijn aan de diurnale ritmes2,3,4,5. Autophagy vertegenwoordigt de lysosome-afhankelijke arm van eiwit katabolisme waarbij eiwitten van belang worden geleverd aan deze degradatieve organel hetzij door de bouw van een roman blaasje (macroautophagy) of via directe translocatie hoewel een kanaal (Chaperone gemedieerde autophagy)6. Het ubiquitin-proteasome-systeem is het belangrijkste niet-lysosomale traject, waar eiwitten poly-alomtegenwoordig zijn en vervolgens in het proteasoom worden gevoerd, een macromoleculaire degradatieve machine die wordt gevonden in het cytoplasma en Nucleus7,8. Ritmes in autophagic en proteasomale activiteit zijn belangrijk omdat ze waarschijnlijk een rol spelen in de cellulaire huishouding. Als gevolg hiervan is het waardevol om een gestandaardiseerde procedure te hebben die dagelijkse oscillaties in eiwit katabolisme kan detecteren die compatibel is met preklinische ziekte modellen.
Hier bieden we ons protocol voor het kwantificeren van de diurnale variaties in autophagic flux in muis lever, die als basis voor het werk in ons laboratorium3,9heeft gediend. Onze methode is geclassificeerd als een "omzet assay"10, een benadering die door tal van groepen wordt gebruikt om Proteolytische activiteit (of flux) te meten. In deze benadering worden proteaseremmers die specifiek zijn voor lysosomen of Proteasomen toegediend aan muizen en vervolgens worden weefselmonsters verkregen na een vast tijdsinterval. Parallel, weefselmonsters worden verkregen van muizen onderworpen aan schijn injecties. De weefselmonsters worden gehomogeniseerd en vervolgens biochemisch gescheiden om de lysosome-verrijkt en cytoplasmische fracties te verkrijgen. Deze fracties worden vervolgens parallel geanalyseerd via Western blotting met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor macroautophagy markers (LC3b en P62) of proteasomale substraten (poly-alomtegenwoordige eiwitten). Na verloop van tijd verzamelen dieren die met proteaseremmers zijn geïnjecteerd eiwitten die normaalgesproken zijn gerecycled. Dientengevolge wordt het percentage van de omzet afgeleid door de overvloed aan marker proteïnen in de behandelde monsters van de protease-remmer te vergelijken met de met placebo behandelde monsters. Door deze methode op vaste tijdstippen gedurende de dag te herhalen, is het mogelijk om circadiane variaties in proteolyse te reconstrueren (Figuur 1a).

<table><tbody><tr><td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>EMD Millipore</td><td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LICOR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF membrane 0.45 micron</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>Cat# IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td><td></td></tr><tr><td>LC3a</td><td>Boston Biochem</td><td>Cat# UL-430</td><td></td></tr><tr><td>LC3b antibody</td><td>Novus</td><td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td><td></td></tr><tr><td>LC3b antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# WG1403BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# NP0007</td><td></td></tr><tr><td>P62-his</td><td>Novus</td><td>Cat# NBP1-44490</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# 1610373</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-p62/SQSTM1</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td><td></td></tr><tr><td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td><td>Boston Biochem</td><td>Cat# UC-230</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Midi-size Gels</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# WG1403</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST Protease Inhibitor Tablets</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Cat# S8830</td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van de diurnale ritmes in autophagic en proteasomale flux

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cellen maken gebruik van verschillende methoden voor het recyclen van ongewenste eiwitten en ander materiaal, waaronder lysosomale en niet-lysosomale trajecten. Het belangrijkste lysosome-afhankelijke traject wordt autophagie genoemd, terwijl de primaire niet-lysosomale methode voor eiwit katabolisme het ubiquitin-proteasome systeem is. Recente studies in model organismen suggereren dat de activiteit van zowel autophagie als het ubiquitin-proteasome systeem niet constant is gedurende de dag, maar in plaats daarvan varieert volgens een dagelijks (circadiane) ritme. Het vermogen om biologische ritmes in eiwit omzet te meten is belangrijk om te begrijpen hoe cellulaire kwaliteitscontrole wordt bereikt en om de dynamiek van specifieke eiwitten van belang te begrijpen. Hier presenteren we een gestandaardiseerd protocol voor het kwantificeren van autophagische en proteasomale flux in vivo die de circadiane component van eiwit omzet vangt. Ons protocol bevat Details voor muis afhandeling, weefsel verwerking, fractionering en autophagische flux kwantificering met behulp van de muis lever als uitgangsmateriaal.

Representatieve gegevens worden weergegeven in Figuur 2A, B, en de kwantificering van deze gegevens vindt u in Figuur 2C, D (Zie ook aanvullend bestand "voorbeeldgegevens"). Voor het gemak hebben we geen laad regelaars afgebeeld in Figuur 2 , maar deze moeten parallel worden verkregen. Typisch, westerse blots tegen β-actin worden gebruikt voor dit doel, maar een totale proteïne vlek...

We beschrijven ons protocol voor het meten van biologische ritmes in eiwit katabolisme via autophagy en het proteasoom in muis lever.

Het meten van de diurnale ritmes in autophagic en Proteasomale flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Ons protocol maakt het mogelijk om de snelheid van autofagie en proteasomale activiteit in muisweefsels te meten en is gevoelig genoeg om circadiane variaties binnen deze activiteiten te detecteren. Deze techniek kan in vivo worden gebruikt om eiwitkatabolisme in cellen en weefsels te evalueren en de benodigde materialen zijn relatief low-tech en toegankelijk voor elk moleculair biologielab. Het aantonen van de procedure zal Mikhail Ryzhikov zijn, een post-doc van mijn laboratorium.Verwarm de leupeptine- en bortezomib-voorraadoplossingen gedurende een kwartier voor elk timepoint om kamertemperatuur te krijgen en verdun de ontdooide bortezomib in steriele PBS om een 50 milligram per milliliter werkoplossing op te leveren. Voor proteaseremmer toediening injecteer intraperitoneally 40 milligram per kilogram leupeptine of 1,6 microgram per kilogram bortezomib in elk proefdier. Voor een negatieve controle, injecteer muizen met 0,5 milliliter PBS.Breng elke muis terug naar kooien gegroepeerd door het type behandeling dat wordt ontvangen terwijl ze worden geïnjecteerd en noteren de tijd dat de muizen worden behandeld of gemanipuleerd in een gestandaardiseerde tabel. Twee uur na de injecti

measuring-diurnal-rhythms-in-autophagic-and-proteasomal-flux

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates how to measure proteasome activity in different subcellular compartments of the lateral amygdala from fear-conditioned and control rat brains using a fluorogenic peptide assay. The proteasome cleaves the fluorogenic peptide substrate, releasing fluorescent molecules, which are quantified using a plate reader to assess proteasome activity in the nuclear and synaptic protein fractions. Increased nuclear activity suggests changes in gene expression, while reduced synaptic...

Measuring Proteasome Activity in Different Subcellular Compartments of the Rat Brain

Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Hier, multispectrale beeldvormende flowcytometrie met een analytische functie die heldere detailafbeeldingen van 3 autofagie markers vergelijkt en kwantificeert hun co-lokalisatie, samen met LC3 spot counting, werd gebruikt om autofagie op objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze te meten.

Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry

Hier is een eenvoudig en goed gevalideerde protocol voor het meten van de bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen wordt beschreven. De methode is gebaseerd op het kwantificeren van het aandeel van lactaat dehydrogenase (LDH) in sedimentable cel breuken in vergelijking met de totale cellulaire LDH niveaus.

De lactaat Dehydrogenase Sequestration test — Een eenvoudige en betrouwbare methode om te bepalen van de Bulk Autophagic Sequestration activiteit in zoogdiercellen

Mitophagy, de selectieve afbraak van mitochondriën, heeft betrokken bij mitochondriale homeostase en in verschillende ziekten bij de mens is gedereguleerd. Handige experimentele methoden voor het meten van de activiteit van de mitophagy zijn echter zeer beperkt. Hier bieden we een gevoelige test voor het meten van de activiteit van de mitophagy met behulp van stroom cytometry.

Gevoelige meting van Mitophagy door Stroom Cytometry met behulp van de pH-afhankelijke fluorescerende verslaggever mt-Keima

Dit protocol is ontworpen om de activiteit van ubiquitin-proteasome System (UPS) in verschillende cellulaire compartimenten van de knaagdieren hersenen efficiënt te kwantificeren. Gebruikers zijn in staat om de werking van UPS in nucleaire, cytoplasmatische en synaptische fracties in hetzelfde dier te onderzoeken, waardoor de hoeveelheid tijd en het aantal dieren dat nodig is om deze complexe analyses uit te voeren, wordt verminderd.

Kwantificerende Subcellulaire Ubiquitin-proteasome activiteit in het knaagdier hersenen

Dit protocol beschrijft de workflow voor metabole etikettering van senescente en niet-delende cellen met gepulste SILAC, ongerichte massaspectrometrie-analyse en een gestroomlijnde berekening van eiwithalfwaardetijden.

Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Stabiel isotopische profilering door middel van gaschromatografie massaspectrometrische analyse van intermediaire metabole flux wordt beschreven in de...

Stabiele Isotopen Profilering van Intermediair metabole flux in het ontwikkelen en volwassen stadium Caenorhabditis elegans</em

Leer diurnale ritmen meten in autophagic en proteasomale flux in muizenlever met dit in vivo protocol. Deze methode detecteert circadiane variaties in eiwitkatabolisme voor metabool onderzoek.

Het meten van de diurnale ritmes in autophagic en Proteasomale flux

Meer video's verkennen