Name: Immunohistochemische test voor de detectie van het lyssavirusantigeen uit formaline-gefixeerde weefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Leer een immunohistochemische test voor detectie van lyssavirusantigeen in formaline-gefixeerde weefsels. Deze methode biedt gevoelige en specifieke diagnostiek met behoud van weefselmorfologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken de laboratoria, epidemiologen en gelieerde ondernemingen met volksgezondheidsafdelingen voor het indienen van monsters bij de Centers for Disease Control and Prevention. De bevindingen en conclusies in dit rapport zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de Centers for Disease Control and Prevention. Het gebruik van handelsnamen en commerciële bronnen is alleen voor identificatie en impliceert geen goedkeuring door de Centers for Disease Control and Prevention.

Hoewel het IHC-protocol werd uitgevoerd op formaline-gefixeerde weefsels, die RABV inactiveren indien aanwezig, moeten de juiste bioveiligheidsprotocollen correct worden gevolgd. Alle bioveiligheidsprocedures worden beschreven in de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), inclusief het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en vaccinatieplicht zoals beschreven12. Bovendien moet de juiste insluiting en behandeling van gevaarlijke chemicaliën (zoals formaline, AEC en xyleen) worden gevolgd (bijv. zuurkasten).
1. Formaline fixatie van weefsels
<ol><li>Plaats 3-5 mm hersenweefsel verzameld na obductie13 in 10% fosfaat gebufferde formaline-oplossing (1:20 tot 1:50 weefsel/formaline verhouding) gedurende 24-72 uur. LET OP: Formaline is een toxisch fixatief.</li>
	<li>Noteer het geschatte weefselgewicht (grootte), weefseltype (hersengebieden) en volume formaline. Het is belangrijk voor laboratoria om fixatietijden te documenteren en bij te houden.</li>
	<li>Voor langere weefselopslag na formalinefixatie en voorafgaand aan de verwerking, plaatst u het weefsel in 70% ethanol.</li>
</ol>2. Weefselbewerking
<ol><li>Na de fixatie van het monster, ontleedt u het weefsel om de belangrijke hersengebieden op te nemen, bijvoorbeeld doorsneden van de hersenstam, het cerebellum (3 lobben) of de hippocampus (beide hippocampi) die elk 3 tot 5 mm dik snijden en in verwerkingscassettes worden geplaatst.</li>
	<li>Verwerk de weefselcassettes voor paraffine-infiltratie, ingebed in paraffineblokken en gesegmenteerd (3 tot 6 μm) op een microtoom.</li>
</ol>3. Bereiding van materialen / vlekken op gerechten
<ol><li>Stel de kleurschaal14 (Materialentabel) inzoals weergegeven in figuur 1. Vul elke schaal met 250 ml van de oplossing.</li>
	<li>Bereiding van de 3-Amino-9-ethylcarbizole (AEC) substraat stock oplossing<ol>
<li>Los een tablet van 20 mg 3-amino 9-ethylcarbazol (AEC) op in 5 ml N,N, dimethylformamide met behulp van een glazen pipet. LET OP: AEC is kankerverwekkend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van de protease (bijv. Pronase) stamoplossing voor het ophalen van antigeen<ol>
<li>Los 7 mg van het protease op in 200 ml PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van de spoelbuffer PBS-T<ol>
<li>Voeg 10 ml Tween 80 tot 990 ml PBS toe. Meng het goed om een homogene oplossing te vormen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Deparaffinisatie en weefselrehydratatie
<ol><li>Maak een paraffinesectie van 5 μm met behulp van een microtoom, drijf het op een waterbad bij 38 °C en verzamel op glazen dia's. Label de dia's met een reagensbestendige pen/marker.</li>
	<li>Plaats de glaasjes op een schaal en smelt gedurende 1 uur in een oven van 55-60 °C. Verhoog de temperatuur niet boven de 60 °C, omdat dit het virale antigeen kan vernietigen.</li>
	<li>Haal de glaasjes uit de oven en deparaffiniseer onmiddellijk in 3 opeenvolgende xyleenspoelingen van elk 5 min in de vaat 1, 2 en 3.</li>
	<li>Rehydrateer de secties op de dia door sequentiële onderdompelingen in afnemende verdunning van ethanol tot gedeïoniseerd water: (4 tot en met 11 is een duikspoeling) schotel 4: xyleen / 100% ethanol (1: 1); schotel 5: 100% ethanol; schotel 6: 100% ethanol; schotel 7: 95% ethanol; schotel 8: 95% ethanol; schotel 9: 80% ethanol; schotel 10: 70% ethanol; schotel 11: gedeoniseerd water (Figuur 1. Schotelopstelling). LET OP: Xyleen is een gevaarlijke chemische stof en het werk moet worden uitgevoerd in een zuurkast.</li>
</ol>5. Proteolytisch antigeen ophalen
<ol><li>Behandel dia's met het protease (2,5 μg/ml PBS) gedurende 30 minuten voor het ophalen van proteolytische antigeen in schotel 12.</li>
	<li>Daarna 10 min afspoelen in PBS-T (schaal 13).</li>
	<li>Behandel met 3% waterstofperoxide gedurende 10 min (schotel 14).</li>
	<li>Nogmaals, wassen met PBS-T gedurende 10 minuten (schotel 15).</li>
</ol>6. Kleuringsprocedure
<ol><li>Behandel dia's één voor één en houd de resterende dia's ondergedompeld in de buffer (verwijder niet de hele diahouder - houd dia's nat). Verwijder één dia en dep overtollige buffer (met behulp van een papieren handdoek) van rond het tissuegedeelte, zorg ervoor dat u het tissuegedeelte niet verstoort. Incubeer glijden in een vochtigheidskamer, gemaakt door het plaatsen van bevochtigde papieren handdoeken, op de labbank top14 bij kamertemperatuur met normaal geitenserum (blokkeren) gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Incubeer met de optimale vooraf bepaalde verdunning primair anti-rabiës antilichaam (1:250 verdunning van muizen anti-rabiës serum, ongepubliceerd) (positieve controle) en negatieve controle antilichamen bij kamertemperatuur hetzelfde als hierboven (stap 6.1.) gedurende 60 minuten zonder wasbeurten ertussen.</li>
	<li>Na 60 min, wassen met PBS-T gedurende 10 min (schotel 16).</li>
	<li>Incubeer met het gebiotinyleerde antilichaam (soortspecifiek) in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten (behandeling hetzelfde als stap 6.1.).</li>
	<li>Wassen met PBS-T gedurende 10 min (schotel 16).</li>
	<li>Incubeer met Streptavidin-HRP-complex in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten (behandeling hetzelfde als 6.1.).</li>
	<li>Wassen met PBS-T gedurende 10 min (schotel 16).</li>
	<li>Incubeer met peroxidasesubstraat, amino-ethylcarbazol (AEC), in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Maak AEC vlak voor gebruik. Voeg hiervoor 1 ml AEC-voorraadoplossing toe aan 14 ml acetaatbuffer van 0,1 m, pH 5,2. Voeg 0,15 ml van 3% H2O2toe. Filtreer het mengsel vlak voor gebruik (0,45 μm filter). OPMERKING: De werkoplossing van AEC is slechts 2-3 uur stabiel. De AEC-voorraadoplossing kan langer in de koelkast worden bewaard.</li>
	<li>Wassen in gedeïoniseerd water 10 min (schotel 17)</li>
	<li>Counterstained met Gill's Hematoxyline verdund 1:2 met gedeïoniseerd water gedurende 2 min (schotel 18).</li>
	<li>Spoel overtollige Hematoxyline af met gedeioniseerde waterspoeling (schaal 19 en 20).</li>
	<li>Spoel af in Scott's Kraanwater 30 s (blusoplossing) schaal 21.</li>
	<li>Wassen in gedeïoniseerd water 10 min (schotel 22)</li>
	<li>Verwijder dia's één voor één - monteer met in water oplosbaar montagemedium.</li>
	<li>Lees dia's op een lichtmicroscoop.</li>
</ol>

<ol><li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+rabies%3A+current+conundrums%2C+concerns%2C+contradictions+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184(2017).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li>
<li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus%3A+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Expert+Consulation+on+Rabies%2C+Third+Report%5BTitle%5D)+AND+%22WHO+Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).</li>
<li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li>
<li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+direct%2C+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li>
<li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li>
<li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+five+year+%281985-1989%29+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Pathology%22%5BJournal%5D)">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li>
<li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Zentralblatt+fur+Veterinarmedizin+Reihe+B%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li>
<li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+rabies+prevention--United+States%2C+2008%3A+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Reports+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. 1, 5th ed, 67-72 (2018).</li>
<li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li>
<li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diagnostic+procedures+for+antigen+detection%22">Diagnostic procedures for antigen detection</a>. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).</li>
<li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vanwege het hoge sterftecijfer van hondsdolheid na het begin van de symptomen, is de diagnose van verdachte dieren voor RABV-infectie uiterst kritisch voor een geschikte profylactische behandeling na blootstelling. De diagnose van hondsdolheid hangt voornamelijk af van DFA-, DRIT- en PCR-gebaseerde technieken met behulp van verse of bevroren weefsels. Voor het testen van formaline-gefixeerde weefsels biedt de IHC-test een alternatieve methode voor de gevoelige en specifieke detectie van RABV-antigeen. Terwijl de weefsels...

Rabiës is een acute progressieve encefalitis veroorzaakt door de negatieve zin RNA-virussen die behoren tot het geslacht lyssavirus1. Bijna 99% van alle menselijke sterfgevallen veroorzaakt door de infectie met rabiësvirus (RABV), het type lid van het geslacht, wordt overgedragen door honden2. Rabiësdiagnose van verdachte dieren is gebaseerd op de detectie van antigeen (voornamelijk viraal gecodeerd nucleoproteïne, N-eiwit) in complex met genomisch RNA (ribonucleoproteïnecomplex, RNP) in het hersenweefsel3. De antigeendetectie door de direct fluorescerende antilichaam (DFA) -test wordt beschouwd als de gouden standaard voor de diagnose van hondsdolheid4. De methode maakt gebruik van vers of vers bevroren hersenmateriaal, een aanraakimpressie op een dia, fixatie in aceton, kleuring met behulp van in de handel verkrijgbare fluorescerende isothiocyanaat (FITC) gelabelde monoklonale of polyklonale antilichamen (mAbs / pAbs) en gelezen door de fluorescentiemicroscopie5. De DFA-test is snel, gevoelig en specifiek voor rabiës-antigeendetectie in vers hersenweefsel. Onlangs werd aangetoond dat een directe snelle immunohistochemische test (DRIT), gemodificeerde immunohistochemie (IHC) -techniek, een vergelijkbare gevoeligheid vertoont voor DFA, maar biedt het voordeel van lichtmicroscopie voor visualisatie6. Hoewel de detectiemethode die in DRIT wordt gebruikt, vergelijkbaar is met IHC, maakt de eerste stap gebruik van verse of bevroren weefsels om aanraakafdrukken van het monster te genereren, gevolgd door fixatie in formaline.
IHC is een veelgebruikte techniek om histologische veranderingen en detectie van eiwitten te bepalen met behulp van specifieke antilichamen in formaline-gefixeerde weefsels ingebed in paraffineblokken. IHC is een gevestigde alternatieve test voor de detectie van rabiësantigeen in de weefselsecties7. IHC is met name gebruikt voor de diagnose van retrospectieve gevallen die neurologische ziekten vertoonden om de last van hondsdolheid te bepalen8. Paraffine-ingebedde formaline-gefixeerde weefsels behouden de eiwitten voor de detectie, zelfs na enkele jaren wanneer ze bij omgevingstemperatuur worden bewaard9. Formalinebehandeling wijzigt eiwitten door de aminozuurzijketens te verknopen en te veranderen, waardoor de epitopen mogelijk niet langer reactief zijn tegen antilichamen10. Hoewel de IHC-test voor rabiës-antigeendetectie mAbs of pAbs omvat, is de laatste voordelig omdat meerdere epitopen en divergente lyssavirussen kunnen worden gedetecteerd11.
De standaardstappen die betrokken zijn bij IHC zijn formalinefixatie van weefsels, inbedding in paraffineblokken, sectie van weefsels, deparaffinisatie en hydratatie, epitoopherstel, reactiviteit tegen primaire en secundaire antilichamen en de ontwikkeling met behulp van chromogene substraten. Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd verslag van het protocol voor de diagnose van hondsdolheid. Voor de detectie van rabiësantigeen worden muizenserum geïmmuniseerd met RABV (pAbs) gegenereerd bij de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, in combinatie met gebiotinyleerde antimuis secundaire antilichamen gebruikt. Gebiotinyleerde abs worden gedetecteerd door de toevoeging van streptavidin-mierikswortelperoxidase (HRP) -complex gevolgd door de kleurontwikkeling met amino-ethylcarbazolsubstraat.

<table><tbody><tr><td>3% waterstofperoxide</td><td>Pharamacy merken</td><td></td><td>Off the shelf 3% H2O2</td></tr><tr><td>3-Amino-9-ethylcarbazool (AEC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6926</td><td></td></tr><tr><td>Acetaat Buffer pH 5,2</td><td>Poly Scientific R&amp;D Corp.</td><td>s140</td><td></td></tr><tr><td>Buffered Formaline 10% Fosfaat Buffered</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>Gecertificeerd</td></tr><tr><td>Dekglazen Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-471</td><td>24 X 50 mm</td></tr><tr><td>Ethanol 190 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Gill's hematoxylinen formule #2</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit</td><td>seracare</td><td>71-00-18</td><td>Muis Primair Antilichaam&nbsp;</td></tr><tr><td>ImmunoHistoMount</td><td>Millipore Sigma</td><td>i1161</td><td>Montage media</td></tr><tr><td>N,N, Dimethyl formamide GR</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>RR14440.01</td><td>01M, pH 7,2 (pH 7,2-7,6)</td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objectief</td><td>Meerdere leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objectief</td><td>Meerdere leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millipore Sigma</td><td>53702</td><td>Protease, Streptomyces griseus</td></tr><tr><td>Scott's Tap Water&nbsp;</td><td>Poly Scientific R&amp;D Corp.</td><td>s1887</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Slide kleuren set</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-80&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Histologisch Grade</td></tr><tr><td>Zeiss Axioplan 2 beeldvorming - microscoop</td><td>Meerdere leveranciers</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemische test voor de detectie van het lyssavirusantigeen uit formaline-gefixeerde weefsels

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Een van de primaire diagnostische modaliteiten voor hondsdolheid is de detectie van viraal ribonucleoproteïne (RNP) complex (antigeen) in de geïnfecteerde weefselmonsters. Hoewel de direct fluorescerende antilichaam (DFA) -test of de directe snelle immunohistochemische test (DRIT) het meest worden gebruikt voor de antigeendetectie, vereisen beide tests verse en / of bevroren weefsels voor afdrukken op dia's voorafgaand aan de antigeendetectie met behulp van antilichamen. Als monsters worden verzameld en gefixeerd in formaline, is geen van beide tests optimaal voor de antigeendetectie, maar testen kunnen worden uitgevoerd door conventionele immunohistochemie (IHC) na inbedding in paraffineblokken en secties. Met deze IHC-methode worden weefsels gekleurd met anti-rabiësantistoffen, secties worden gedeparaffineerd, antigeen opgehaald door gedeeltelijke proteolyse of andere methoden en geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen. Antigenen worden gekleurd met mierikswortelperoxidase / amino-ethylcarbide en counterstained met hematoxyline voor de visualisatie met behulp van een lichtmicroscoop. Naast de specifieke antigeendetectie biedt formalinefixatie andere voordelen, zoals de bepaling van histologische veranderingen, ontspannen omstandigheden voor monsteropslag en -transport (onder omgevingstemperaturen), de mogelijkheid om retrospectieve gevallen te testen en verbeterde biologische veiligheid door de inactivatie van infectieuze agentia.

Figuur 2 toont representatieve IHC-kleuringsresultaten van positieve en negatieve controlemonsters in verschillende geteste hersenweefsels. Figuur 2A,D,G vertegenwoordigt positieve monsters bij 200x, terwijl figuur 2B,E,H overeenkomt met respectievelijk 400x vergroting. Figuur 2A-C komt overeen met de hersenstam; <strong...

Hier presenteren we een immunohistochemisch testprotocol voor de detectie van rabiësvirusantigeen als een alternatieve diagnostische test voor formaline-gefixeerde weefsels.

Immunohistochemische test voor de detectie van het lyssavirusantigeen uit formaline-gefixeerde weefsels

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Weefsels die worden gebruikt voor immunohistochemie en voor diagnostische histopathologie worden routinematig gefixeerd in 10% fosfaatbufferformine. De detectie van rabiësvirusantigeen in hersenweefsel dat is gefixeerd in formaline vormt een unieke uitdaging en de IHC-test is een gevoelige en specifieke methode gebleken voor de detectie van rabiësvirusantigeen. Het belangrijkste voordeel van biopsie of andere detectiemethoden is dat antigenen kunnen worden gedetecteerd in relatie tot weefsel en cellulaire morfologie.Met IHC, lokalisatie van rabiës antigeen in de hersenen en niet-hersenweefsels, bieden aanvullende informatie die niet kon worden verkregen door routinematige Hematoxyline en Eosine vlek secties. Diagnostische rabiëstests zijn belangrijk voor het starten van profylaxe na blootstelling bij mensen die zijn blootgesteld aan het rabiësvirus. IHC is een van de meest uitgevoerde testen op formaline-gefixeerde weefsels.Met specifieke antilichamen kan het worden gebruikt voor de detectie van respectieve pathogenen. Om deze procedure te starten, plaatst u drie tot vijf millimeter stukjes hersenweefsel, verzameld na obductie, gedurende 24 tot 72 uur in een 10% gebufferde formaline-oplossing. Noteer het geschatte weefselgewicht, weefseltype en het volume formaline.Plaats de weefsels in 70% ethanol voor langere weefselopslag na formalinefixatie en voorafgaand aan de verwerking. Na de fixatie van het monster, ontleed het weefsel om de belangrijke hersengebieden op te nemen, zoals doorsneden van de hersenstam, het cerebellum of de hippocampus. Elk, gesneden tot een dikte tussen de drie en vijf millimeter.Plaats de weefsels in verwerkingscassettes. Verwerk de weefselcassettes voor paraffine-infiltratie. Integreer ze in paraffineblokken en sectie ze op een microtoom.Stel eerst de kleuringsschaal in zoals beschreven in figuur 1 van het tekstprotocol. Vul elk gerecht met 250 milliliter van de bereide oplossing. Om de AEC-substraatvoorraadoplossing te bereiden, gebruikt u een glazen pipet om één tablet AEC van 20 milligram op te lossen in 5 milliliter N, N-dimethylformamide.Om de protease-stamoplossing te bereiden, lost u 7 milligram van het protease op in 200 milliliter PBS. Voeg om de spoelbuffer voor te bereiden 100 milliliter Tween 80 tot 990 milliliter PBS toe en meng goed tot een homogene oplossing van PBT-T. Maak met behulp van een microtoom een paraffinesectie van vijf micrometer.Laad het gedeelte op een waterbad bij 38 graden Celsius en verzamel het op glazen glijbanen. Label de dia's met een reagensbestendige pen. Leg de glaasjes op een schaal en smelt een uur in een oven op 55 tot 60 graden Celsius.Verwijder vervolgens de dia's uit de oven en deparaffineer ze onmiddellijk, met behulp van 3 opeenvolgende xyleenspoelingen van elk 5 minuten. Rehydrateer hierna de secties op de dia door sequentiële onderdompelingen in afnemende verdunningen van ethanol tot gedeioniseerd water, zoals beschreven in het tekstprotocol. Behandel de dia's gedurende 30 minuten met het protease voor het ophalen van proteolytisch antigeen, spoel de dia's vervolgens gedurende 10 minuten in PBS-T en behandel ze gedurende 10 minuten met 3% waterstofperoxide.Was hierna de dia's opnieuw met PBS-T gedurende 10 minuten. Verwijder om te beginnen één dia uit de buffer, zorg ervoor dat u slechts één dia tegelijk verwerkt, terwijl de andere onder water blijven en gebruik een papieren handdoek om overtollige buffer rond het tissuegedeelte af te vlekken. Plaats de glaasjes in een vochtkamer en incubeer met normaal geitenserum bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.Incubeer vervolgens de dia's in de vochtigheidskamer met het optimale vooraf bepaalde verdunning primaire anti-rabiës antilichaam en negatieve controle antilichamen, bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten zonder wasbeurten ertussen. Was hierna de glaasjes gedurende 10 minuten met PBS-T en incubeer gedurende 15 minuten in een vochtigheidskamer met het gebiotinyleerde antilichaam bij kamertemperatuur. Was de dia's opnieuw met PBS-T gedurende 10 minuten.Incubeer de dia's en de vochtigheidskamer met stripscheiding en HRB-complex op kamertemperatuur gedurende 15 minuten en was de PBS-T gedurende 10 minuten. Incubeer vervolgens met AEC in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Was de glaasjes gedurende 10 minuten in gedeoniseerd water en counterstain met Gill's Hematoxilyn, één tot twee verdund met gedeoniseerd water gedurende twee minuten.Spoel hierna het overtollige hematoxyline af door de glaasjes in gedeioniseerd water te spoelen. Spoel de glaasjes 30 seconden in Scott's Tap Water en was ze gedurende 10 minuten in gedeoniseerd water. Verwijder de dia's één voor één en monteer ze met in water oplosbaar montagemedium.Gebruik vervolgens een lichtmicroscoop om de dia's te lezen. In deze studie wordt een immunocytische chemietest aangetoond voor de detectie van rabiësvirusantigeen als een alternatieve diagnostische test voor formaline-gefixeerde weefsels. Een representatief immunocytisch chemisch kleuringsresultaat van positieve en negatieve controlemonsters in verschillende hersenweefsels wordt hier getoond, inclusief de hersenstam, het cerebellum en purkinje cellen en de hippocampus.De magenta rode kleuring, die de kleurontwikkeling aangeeft door AEC-substraat te gebruiken tegen de blauwe tellerskleurde achtergrond, is te wijten aan de reactiviteit van antilichamen tegen het rabiësantigeen. Een positief resultaat in immunohistochemie komt overeen met de magenta rode kleuring in de weefselsecties. De kleuring van cytoplasmatische insluitsels en korrelige insluitsels van verschillende grootte zijn indicatief voor monsters die positief zijn voor RABV-infecties.Monsters worden als negatief beschouwd als er geen specifieke rode kleuring of alleen de blauwe achtergrond, als gevolg van hematoxyline, werd waargenomen. Naast de positieve kleuring zou de verdeling van insluitsels kunnen zorgen voor een indirecte kwantificering van de niveaus van rabiësantigeen in het monster, die kunnen overeenkomen met de virale lading van het weefselmonster. Ongeacht de distributieniveaus zal elke specifieke kleuring het monster classificeren als positief voor RABV-antigeendetectie.Weefsels moeten voldoende worden gefixeerd in formaline en voorkomen dat de weefsels tijdens dit proces bevriezen. Rabiësantigeen wordt gedetecteerd door IHC, waarna moleculaire technieken kunnen worden uitgevoerd op paraffinesecties om de Lyssavirusvariant te bepalen op basis van RNA-sequentie-informatie. Reagentia zoals xyleen en formaline moeten worden behandeld in zuurkasten.Voorzichtigheid is mogelijk bij het hanteren van AEC, omdat het kankerverwekkend is.

immunohistochemistry-test-for-lyssavirus-antigen-detection-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een techniek combineert in situ tetrameer vlekken en in situ hybridisatie (ISTH) maakt visualisatie, in kaart brengen en analyseren van de ruimtelijke nabijheid van virus-specifieke CD8 + T-cellen om hun virus-geïnfecteerde targets, en de bepaling van de kwantitatieve relaties tussen deze immuun-effectoren en doelstellingen voor infecties resultaten.

Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ</em

This video demonstrates immunohistochemistry staining for rabies virus antigen detection in infected mouse brain tissue. The process includes deparaffinization and alcohol treatment, followed by proteolytic treatment to enhance antigen accessibility. Immunohistochemistry staining reveals red precipitates, confirming the presence of rabies antigens in the tissue section.

An Immunohistochemistry Staining for the Detection of Rabies Virus Antigens

Wij presenteren hier een geoptimaliseerd, gedetailleerd protocol voor dubbele immunokleuring in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties van het centrale zenuwstelsel (CZS) en perifere lymfeklieren (LK) van ratten.

Immunohistochemische analyse in het Rat centrale zenuwstelsel en van perifere lymfeknopen Tissue Secties

We hebben een fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de detectie van een persistente DNA virusgenoom in weefselcoupes van diermodellen. Dit protocol maakt het bestuderen infectie proces codetection van het virale genoom, zijn RNA producten en virale of cellulaire eiwitten in enkele cellen.

Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

Roman, immunokleuring-compatibele weefsel clearing technieken zoals de ultieme 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen toestaan de 3D-visualisatie van rabiësvirus herseninfectie en zijn complexe cellulaire omgeving. Dikke, antilichaam gelabelde hersenweefsel segmenten zijn optisch transparant gemaakt om de beeld diepte te vergroten en 3D-analyse mogelijk te maken door confocale laser scanning microscopie.

Hoge-resolutie 3D-beeldvorming van rabiës virus infectie in solvent-geklaard hersenweefsel

Dit protocol introduceert een standaard laboratoriumprocedure voor diagnostische tests van Lyssavirus antigenen in vleermuizen in Taiwan.

Standaard werkings procedure voor Lyssavirus surveillance van de BBT-populatie in Taiwan

Deze real-time RT-PCR met behulp van dsDNA intercalating Dye is geschikt om Lyssavirus infecties te diagnosticeren. De methode begint met RNA geëxtraheerd uit rabiës verdachte ante-mortem-of postmortemmonsters, detaillering Master Mix preparaat, RNA toevoeging, installatie van de real-time machine en juiste interpretatie van de resultaten.

Pan-Lyssavirus real time RT-PCR voor rabiës diagnose

We presenteren een compleet protocol voor postmortem diagnose van dierlijke hondsdolheid onder veldomstandigheden met behulp van een snelle immunochromatografische diagnostische test (RIDT), van hersenbiopsie bemonstering tot uiteindelijke interpretatie. We beschrijven ook verdere toepassingen met behulp van het apparaat voor moleculaire analyse en virale genotypering.

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromagrafische Diagnostische Test voor Resource-Limited Settings met verdere moleculaire toepassingen

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

Dit protocol demonstreert de pan-lyssavirus LN34 real-time reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR)-assay van weefselverzameling tot resultaatinterpretatie, inclusief updates van primersequenties en formuleringen om de testprestaties voor sommige niet-rabiës, lyssavirussen en lagomorfen te verbeteren. We demonstreren ook de testopstelling voor een LN34 multiplexed (LN34M) formaat met één put.

Postmortale diagnose van hondsdolheid bij dieren door de bijgewerkte, gemultiplexte LN34 real-time reverse transcriptie-polymerasekettingreactietest

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer een immunohistochemische test voor detectie van lyssavirusantigeen in formaline-gefixeerde weefsels. Deze methode biedt gevoelige en specifieke diagnostiek met behoud van weefselmorfologie.

Immunohistochemische test voor de detectie van het lyssavirusantigeen uit formaline-gefixeerde weefsels

Meer video's verkennen