Immunohistochemische test voor de detectie van het lyssavirusantigeen uit formaline-gefixeerde weefsels

Weefsels die worden gebruikt voor immunohistochemie en voor diagnostische histopathologie worden routinematig gefixeerd in 10% fosfaatbufferformine. De detectie van rabiësvirusantigeen in hersenweefsel dat is gefixeerd in formaline vormt een unieke uitdaging en de IHC-test is een gevoelige en specifieke methode gebleken voor de detectie van rabiësvirusantigeen. Het belangrijkste voordeel van biopsie of andere detectiemethoden is dat antigenen kunnen worden gedetecteerd in relatie tot weefsel en cellulaire morfologie.

Met IHC, lokalisatie van rabiës antigeen in de hersenen en niet-hersenweefsels, bieden aanvullende informatie die niet kon worden verkregen door routinematige Hematoxyline en Eosine vlek secties. Diagnostische rabiëstests zijn belangrijk voor het starten van profylaxe na blootstelling bij mensen die zijn blootgesteld aan het rabiësvirus. IHC is een van de meest uitgevoerde testen op formaline-gefixeerde weefsels.

Met specifieke antilichamen kan het worden gebruikt voor de detectie van respectieve pathogenen. Om deze procedure te starten, plaatst u drie tot vijf millimeter stukjes hersenweefsel, verzameld na obductie, gedurende 24 tot 72 uur in een 10% gebufferde formaline-oplossing. Noteer het geschatte weefselgewicht, weefseltype en het volume formaline.

Plaats de weefsels in 70% ethanol voor langere weefselopslag na formalinefixatie en voorafgaand aan de verwerking. Na de fixatie van het monster, ontleed het weefsel om de belangrijke hersengebieden op te nemen, zoals doorsneden van de hersenstam, het cerebellum of de hippocampus. Elk, gesneden tot een dikte tussen de drie en vijf millimeter.

Plaats de weefsels in verwerkingscassettes. Verwerk de weefselcassettes voor paraffine-infiltratie. Integreer ze in paraffineblokken en sectie ze op een microtoom.

Stel eerst de kleuringsschaal in zoals beschreven in figuur 1 van het tekstprotocol. Vul elk gerecht met 250 milliliter van de bereide oplossing. Om de AEC-substraatvoorraadoplossing te bereiden, gebruikt u een glazen pipet om één tablet AEC van 20 milligram op te lossen in 5 milliliter N, N-dimethylformamide.

Om de protease-stamoplossing te bereiden, lost u 7 milligram van het protease op in 200 milliliter PBS. Voeg om de spoelbuffer voor te bereiden 100 milliliter Tween 80 tot 990 milliliter PBS toe en meng goed tot een homogene oplossing van PBT-T. Maak met behulp van een microtoom een paraffinesectie van vijf micrometer.

Laad het gedeelte op een waterbad bij 38 graden Celsius en verzamel het op glazen glijbanen. Label de dia's met een reagensbestendige pen. Leg de glaasjes op een schaal en smelt een uur in een oven op 55 tot 60 graden Celsius.

Verwijder vervolgens de dia's uit de oven en deparaffineer ze onmiddellijk, met behulp van 3 opeenvolgende xyleenspoelingen van elk 5 minuten. Rehydrateer hierna de secties op de dia door sequentiële onderdompelingen in afnemende verdunningen van ethanol tot gedeioniseerd water, zoals beschreven in het tekstprotocol. Behandel de dia's gedurende 30 minuten met het protease voor het ophalen van proteolytisch antigeen, spoel de dia's vervolgens gedurende 10 minuten in PBS-T en behandel ze gedurende 10 minuten met 3% waterstofperoxide.

Was hierna de dia's opnieuw met PBS-T gedurende 10 minuten. Verwijder om te beginnen één dia uit de buffer, zorg ervoor dat u slechts één dia tegelijk verwerkt, terwijl de andere onder water blijven en gebruik een papieren handdoek om overtollige buffer rond het tissuegedeelte af te vlekken. Plaats de glaasjes in een vochtkamer en incubeer met normaal geitenserum bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.

Incubeer vervolgens de dia's in de vochtigheidskamer met het optimale vooraf bepaalde verdunning primaire anti-rabiës antilichaam en negatieve controle antilichamen, bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten zonder wasbeurten ertussen. Was hierna de glaasjes gedurende 10 minuten met PBS-T en incubeer gedurende 15 minuten in een vochtigheidskamer met het gebiotinyleerde antilichaam bij kamertemperatuur. Was de dia's opnieuw met PBS-T gedurende 10 minuten.

Incubeer de dia's en de vochtigheidskamer met stripscheiding en HRB-complex op kamertemperatuur gedurende 15 minuten en was de PBS-T gedurende 10 minuten. Incubeer vervolgens met AEC in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Was de glaasjes gedurende 10 minuten in gedeoniseerd water en counterstain met Gill's Hematoxilyn, één tot twee verdund met gedeoniseerd water gedurende twee minuten.

Spoel hierna het overtollige hematoxyline af door de glaasjes in gedeioniseerd water te spoelen. Spoel de glaasjes 30 seconden in Scott's Tap Water en was ze gedurende 10 minuten in gedeoniseerd water. Verwijder de dia's één voor één en monteer ze met in water oplosbaar montagemedium.

Gebruik vervolgens een lichtmicroscoop om de dia's te lezen. In deze studie wordt een immunocytische chemietest aangetoond voor de detectie van rabiësvirusantigeen als een alternatieve diagnostische test voor formaline-gefixeerde weefsels. Een representatief immunocytisch chemisch kleuringsresultaat van positieve en negatieve controlemonsters in verschillende hersenweefsels wordt hier getoond, inclusief de hersenstam, het cerebellum en purkinje cellen en de hippocampus.

De magenta rode kleuring, die de kleurontwikkeling aangeeft door AEC-substraat te gebruiken tegen de blauwe tellerskleurde achtergrond, is te wijten aan de reactiviteit van antilichamen tegen het rabiësantigeen. Een positief resultaat in immunohistochemie komt overeen met de magenta rode kleuring in de weefselsecties. De kleuring van cytoplasmatische insluitsels en korrelige insluitsels van verschillende grootte zijn indicatief voor monsters die positief zijn voor RABV-infecties.

Monsters worden als negatief beschouwd als er geen specifieke rode kleuring of alleen de blauwe achtergrond, als gevolg van hematoxyline, werd waargenomen. Naast de positieve kleuring zou de verdeling van insluitsels kunnen zorgen voor een indirecte kwantificering van de niveaus van rabiësantigeen in het monster, die kunnen overeenkomen met de virale lading van het weefselmonster. Ongeacht de distributieniveaus zal elke specifieke kleuring het monster classificeren als positief voor RABV-antigeendetectie.

Weefsels moeten voldoende worden gefixeerd in formaline en voorkomen dat de weefsels tijdens dit proces bevriezen. Rabiësantigeen wordt gedetecteerd door IHC, waarna moleculaire technieken kunnen worden uitgevoerd op paraffinesecties om de Lyssavirusvariant te bepalen op basis van RNA-sequentie-informatie. Reagentia zoals xyleen en formaline moeten worden behandeld in zuurkasten.

Voorzichtigheid is mogelijk bij het hanteren van AEC, omdat het kankerverwekkend is.