Zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA

elektronisch chiming Omdat macrofagen gespecialiseerd zijn in het detecteren van moleculen van niet-zelfoorsprong, zijn ze bijzonder moeilijk te transfecteren. We beschrijven een protocol dat een zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen mogelijk maakt met mRNA gegenereerd uit DNA-sjablonen zoals plasmiden. Het belangrijkste voordeel van onze methode is dat hoge transfectiepercentages worden bereikt bij afwezigheid van detecteerbare cytotoxiciteit of immunogeniciteit.

Het aantonen van de procedure zal Marc Herb een postdoc uit mijn laboratorium. Begin met het ontdooien van alle onderdelen van de RNA transcriptie kit. Vortex de reagentia voor vijf seconden en draai ze naar beneden voor twee seconden op 2,000 keer g, dan houd ze op ijs tot gebruik.

Bereid de in vitro RNA transcriptiereactie voor in een 0,5-microliter microcentrifugebuis volgens de aanwijzingen van het manuscript. Draai de buis en draai hem naar beneden. Dan incubeer het op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten tijdens het mengen bij 400 rpm op een thermische mixer.

Voeg na de incubatie twee microliters van DNase I direct toe aan de reactiemix. Vortex en draai de buis naar beneden, en incubeer het in de thermische mixer voor nog eens 15 minuten. Reserveer een twee-microliter aliquot van het met Dnase behandelde product voor de controlegel en bewaar het bij min 80 graden Celsius.

Voeg voor polyA-tailing vijf microliters 10X polyA polymerasereactiebuffer en vijf microliters polyA polymerase toe aan de met Dnase behandelde reactie. Vortex en draai de mix. Vervolgens incubeer het in de thermische mixer gedurende 30 minuten.

Wanneer de reactie is voltooid, neem een twee-microliter aliquot voor de controle gel en bewaar het op min 80 graden Celsius. Voeg 5-prime dephosphorylation reagentia direct toe aan het polyA tailed product volgens de handschriftrichtingen. Vortex en spin in de buis, en incubeer het in de thermische mixer voor nog eens 30 minuten.

Volg de dephosfosfosfoïnatiereactie met een incubatie van twee minuten bij 80 graden Celsius om de Antarctische fosforfosfatase te verwarmen. Zuiver vervolgens de in vitro getranscribeerd mRNA met behulp van een speciale RNA zuiveringskit. Meet de concentratie en zuiverheid van het eluted mRNA met een microvolume spectrofotometer.

Voer een deaturturing agarose gel met de eerder verzamelde aliquots om de aanwezigheid van een enkel product te controleren, juiste transcript lengte, en polyA tailing. Bereid u voor op transfectie door het vooraf berekende volume van mRNA-transfectiebuffer minus de volumes van mRNA-transfectiereageage en het mRNA toe te voegen aan een reactiebuis. Ontdooi de mRNA-bouillon en meng het voorzichtig door de buis om te draaien.

Voeg vervolgens het vooraf berekende volume van mRNA toe aan de reactiebuis. Vortex en spin vaststelling van de reactie mix en de mRNA transfectie reagens, voeg dan de juiste volume van de mRNA transfectie reagens aan de reactie mix buis. Draai de buis en draai hem naar beneden.

Dan uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Vervang ondertussen het cultuurmedium van de macrofagen door een fris warm cultuurmedium. Zodra de incubatie van de transfectiemix is voltooid, voeg de mix toe aan de plaatputten met de macrofagen dropwise en in een cirkel van buiten naar het midden van de put.

Om een uniforme verdeling van de transfectie mix voorzichtig rock de plaat in een verticale en horizontale richting. Dan incubeer de plaat op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide voor ten minste zes uur. Na de incubatie, analyseren transfectie efficiëntie met fluorescentie microscopie, flow cytometrie of immunoblot.

Het belangrijkste onderdeel van deze procedure is het waarborgen van een uniforme verdeling van de transfectiemix, zodat alle macrofagen in contact komen met dezelfde hoeveelheid mRNA. Dit protocol werd met succes gebruikt om mRNA-coderings-tagged NEMO en IKK-bèta varianten voor transfectie van primaire macrofagen te genereren. Juiste grootte en polyA tailing van mRNA werd gecontroleerd door agarose gel elektroforese.

Transfectie-efficiëntie werd bevestigd door het genereren van mRNA-codering van GFP en het uitvoeren van flow cytometrieanalyse. De transfectie steeg samen met de hoeveelheid transfected mRNA, tot 50 tot 65% voor PM en 80 tot 85%voor BMDM. Zowel in PM als in BMDM steeg het expressieniveau van EGFP in transfected cells op een tijd- en dosisafhankelijke manier.

Belangrijk is dat de analyse van propidium jodide-positieve of annex V-positieve macrofagen bevestigde dat de transfectieprocedure geen lytische of apoptotische celsterfte heeft veroorzaakt. Transfectie efficiëntie van mRNAs coderen FLAG-tagged Nemo of IKK-beta varianten werden geanalyseerd met immunofluorescentie microscopie. De tarieven waren ongeveer 60% voor Nemo mRNAs en 55% voor IKK-beta mRNAs.

Dit protocol werd ook gebruikt om mRNA-codering Cre recombinase te genereren. Transfectie van 400.000 BMDM met 400 nanogram Cre recombinase mRNA resulteerde in bijna volledige uitputting van Nemo-eiwit na 48 uur, wat duidt op zeer efficiënte transfectie. Het ontbreken van detecteerbare hoeveelheden Interleukine 1 beta, Interleukine-6 en tumor necrose factor geeft aan dat de transfectie procedure niet pro-inflammatoire signalering activeert.

Onze relatief eenvoudige methode maakt het eindelijk mogelijk om gemuteerde of gelabelde eiwitten efficiënt uit te drukken in primaire macrofagen. Dit zou de analyse van macrofaagfuncties op moleculair niveau aanzienlijk bevorderen.