Isolatie van specifieke neuron populaties van Roundworm Caenorhabditis elegans
6 augustus 2019
Hier presenteren we een protocol voor eenvoudige isolatie van specifieke groepen van levende neuronale cellen die groen fluorescerende eiwitten uit transgene Caenorhabditis elegans lijnen uitdrukken. Deze methode maakt een verscheidenheid van ex vivo studies gericht op specifieke neuronen en heeft de capaciteit om cellen te isoleren voor verdere korte termijn culturing.
Dit protocol zorgt voor de naadloze isolatie, culturing, en ondervraging van transcriptie reacties in een specifieke cel lijn van C.elegans. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het hoge niveau van aanpassingsvermogen aan verschillende levensfasen van wormen of specifieke celtypen die moeten worden geïsoleerd. Het aantonen van de procedure zal ik zijn en Nataliya Zahayko, een technicus uit ons laboratorium.
Na het verzamelen van de dieren, centrifugeren ze op 1600 keer g gedurende vijf minuten. Verwijder alle supernatant en resuspend de wormen in een milliliter van M9 media. Breng de suspensie over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.
Centrifuge op 1600 keer g gedurende vijf minuten om de wormen pellet. Voeg vervolgens 200 microliter SDS-DTT buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. De wormen moeten nu lijken te zijn gerimpeld langs het lichaam als bekeken onder een lichte microscoop.
Voeg vervolgens 800 microliters van ijskoude isolatiebuffer toe en meng door zachtjes met de buis te vegen. Centrifuge op 13.000 keer g en bij vier graden Celsius gedurende een minuut om de wormen te pelleteren. Verwijder de supernatant en was met een milliliter isolatiebuffer.
Herhaal het centrifugatie- en wasproces in totaal vijf keer, zodat u de isolatiebuffer telkens zorgvuldig verwijdert. Voeg hierna 100 microliter proteasemengsel van Streptomyces griseus, opgelost in isolatiebuffer, toe aan de pellet. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten, zorg ervoor dat mechanische verstoring toe te passen door pipetten op en neer 60 tot 70 keer met een 200-microliter micropipet tip tegen de onderkant van de buis.
Om het stadium van de spijsvertering te bepalen, verwijder een tot vijf microliters van het spijsverteringsmengsel, laat het op een glazen glijbaan vallen en inspecteer het met behulp van een weefselkweekmicroscoop. Na vijf tot zeven minuten moeten wormfragmenten een zichtbaar verminderde cuticula hebben en een drijfmest van cellen zal gemakkelijk zichtbaar zijn. Stop de reactie door 900 microliters van commercieel verkrijgbare Leibovitz's L-15 medium toe te voegen, aangevuld met 10%FBS en penicilline-streptomycine.
Centrifuge op 10.000 keer g en bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten om geïsoleerde fragmenten en cellen te pelleteren. Was de pelleted cellen twee keer meer met koude L-15 aangevuld media met behulp van een milliliter van de media per wasbeurt. Resuspend de pelleted cellen in een milliliter van L-15 aangevuld media, en laat op ijs gedurende 30 minuten.
Neem vervolgens de bovenste laag, die ongeveer 700 tot 800 microliters is, en breng deze over naar een microcentrifugebuis. Gebruik een geautomatiseerde celteller of hemacytometer om de celdichtheid van 10 tot 25 microliter van geïsoleerde cellen te meten. Centrifugecellen uit de geïsoleerde celsuspensie bij 10.000 keer g en vijf minuten bij vier graden Celsius.
Gooi de supernatant weg en stel de gepelde cellen in L-15-aangevuld medium opnieuw op tot een celdichtheid van niet meer dan zes miljoen cellen per milliliter om overbelasting van de stroomcytometer te voorkomen. Sorteer vervolgens cellen op GFP-positieve expressie met behulp van een stroomcytometer die monsters kan sorteren. GFP-negatieve cellen kunnen worden gebruikt als een controle voor niet-cel-type-specifieke analyse.
Na deze, plaat de geïsoleerde cellen in de putten van een steriele zes-put plaat, plaats de plaat in een plastic container, voeg een vochtige doekje of zacht weefsel papier om vocht toe te voegen aan de cellen, en uitbroeden op 20 graden Celsius. Centrifugecellen uit de geïsoleerde celsuspensie in een 1,5 milliliter RNase-vrije microcentrifugebuis bij 10.000 keer g en vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder met behulp van een micropipet het supernatant en voeg 100 microliter M9-medium toe om het L-15-medium weg te wassen.
Vervolgens centrifugeren de cellen op 10,000 keer g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten en verwijder de supernatant. Herhaal dit was- en centrifugatieproces drie keer in totaal om ervoor te zorgen dat alle media worden verwijderd, om ervoor te zorgen dat de supernatant elke keer zorgvuldig wordt verwijderd. Voeg vervolgens een milliliter fenol en guanidine isothiocyanaat oplossing aan de cellen en pipette de suspensie op en neer zorgvuldig.
Broed het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg hierna 250 microliter chloroform toe en draai de buis voorzichtig 15 tot 20 keer om. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden.
Centrifuge op 10.000 keer g en bij 25 graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik een micropipet om zorgvuldig te verwijderen zo veel van de bovenste waterige laag mogelijk, zorg ervoor dat de onderste organische lagen niet verstoren. Breng de onderste laag over op een nieuwe 1,5 milliliter RNase-vrije microcentrifugebuis.
Voeg aan de nieuwe buis 500 microliter isopropanol toe en meng door de buis om te keren. Broed deze oplossing vijf minuten lang op kamertemperatuur uit. Vercentrifugeren de buis vervolgens op 14.000 keer g en 25 graden Celsius gedurende 20 minuten.
Plaats de monsters op ijs en gebruik een micropipet om zoveel mogelijk isopropanol te verwijderen. Voeg voorzichtig een milliliter van 70% ethanol in RNase-vrij dubbelgedestilleerd water aan de buis door het aan te brengen op de zijkant van de buis. Centrifuge op 10.000 keer g en bij 25 graden Celsius gedurende vijf minuten.
Verwijder het grootste deel van de ethanol en laat de buis drie tot vijf minuten drogen op ijs. Voeg hierna 15 tot 20 microliter RNase-vrij dubbelgedestilleerd water toe. Gebruik een spectrofotometer op 260 nanometer om de RNA-concentratie en zuiverheid te meten.
In deze studie worden unc-17:GFP-positieve cholinerge neuronen geëxtraheerd en geïsoleerd uit de rondworm C.elegans voor latere ex vivo-studies. Het unc-17 gen wordt uitgedrukt in het hele lichaam van de C.elegans, en codes voor een vesiculaire acetylcholine transmembrane transporter. De expressie van dit gen kan worden waargenomen in hoofd, midbody, en staart neuronen, en neuron projecties.
Representatieve fluorescentiemicrografen van unc-17:GFP-positieve neuronen na isolatie, evenals een respectieve negatieve controle van ongewijzigde N2 wilde type dieren, worden hier getoond. Geïsoleerde cellen kunnen tot drie dagen in leven blijven wanneer ze worden aangevuld met Leibovitz's L-15 medium en 10%FBS. Representatieve gegevens van qPCR van GFP-uitdrukkende cholinerge neuronen, evenals GFP-uitdrukkende spiercellen, wordt hier getoond.
Na het succesvol sorteren van cellen wordt RNA geïsoleerd via een fenol- en guanidine isothiocyanaatmethode, waarna cDNA werd geproduceerd met behulp van een synthesekit. Expressie van cholinerge neuron-specifieke genen, tph-1, een tryptofaan hydroxylase, en snb-1, een synaptische vesicle transporter, is verhoogd in unc-17:GFP geïsoleerde cellen. Deze expressie is echter niet aanwezig in myo-3:GFP geïsoleerde cellen.
Het omgekeerde is waar met de expressie van de spierspecifieke myosine-zware kettingtranscriptie van myo-2, omdat de expressie van dit gen beperkt is tot geïsoleerde spiercellen, maar niet tot de geïsoleerde cholinerge cellen. Het is belangrijk om de wormen volledig uit te broeden. Uitgebreide incubatie van de wormschuin kan echter leiden tot wormdood of extra stress voor het dier.
Na de isolatie kunnen de cellen gedurende een bepaalde periode worden gekweekt of worden gebruikt voor RNA-isolatie en qRT-PCR-analyse. Gekweekte neuronen kunnen verder worden geanalyseerd door patch klem elektroforese metingen. Deze techniek kan de analyse van specifieke groepen cellen vergemakkelijken, waardoor ons begrip van celspecifieke reacties in de context van meercellige organismen in verschillende stadia van de levenscyclus wordt verbeterd.
Aangezien chemische stoffen zoals SDS en DTT worden gebruikt tijdens dit experiment, moeten algemene laboratoriumveiligheidsprocedures worden gevolgd tijdens het maken en gebruiken van buffers.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol maakt de naadloze isolatie, kweek en analyse van transcriptionele responsen in een specifieke cellijn van C.elegans mogelijk. De methode is aanpasbaar aan verschillende levensstadia van de wormen of specifieke celtypen die geïsoleerd moeten worden.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Transgene organismen
Achtergrond
- De isolatie van specifieke neurale cellen is cruciaal voor het bestuderen van hun functies.
- Transgene Caenorhabditis elegans-lijnen die groen fluorescent proteïne tot expressie brengen, vergemakkelijken dit proces.
- Ex vivo-studies op geïsoleerde neuronen kunnen inzicht bieden in hun gedrag en eigenschappen.
- Dit protocol verbetert de mogelijkheid om specifieke neuronale populaties te bestuderen.
Doel van de studie
- Een betrouwbare methode presenteren voor het isoleren van levende neuronale cellen.
- Het mogelijk maken van verdere kortstondige kweek van geïsoleerde cellen.
- Diverse ex vivo studies faciliteren die gericht zijn op specifieke neuronen.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van transgene C.elegans die GFP tot expressie brengen.
- Centrifugeren van de verzamelde dieren bij 1600 ×g gedurende vijf minuten.
- Resuspenderen van de wormen in M9-medium.
- Overbrengen van de suspensie naar microcentrifugebuisjes voor verdere verwerking.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van specifieke neuronale populaties.
- Aanpasbaarheid van het protocol aan diverse levensstadia en celtypen.
- Potentieel voor gedetailleerde transcriptionele analyse van de geïsoleerde cellen.
- Verbeterd begrip van de neuronale functie door ex vivo studies.
Conclusies
- Het protocol biedt een eenvoudige methode voor het isoleren van neuronale cellen.
- Het opent mogelijkheden voor verder onderzoek naar het gedrag en de eigenschappen van neuronen.
- De aanpasbaarheid maakt het geschikt voor een breed scala aan studies binnen de neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het isoleren van specifieke neuronale populaties uit modelorganismen maakt mechanistische risicoreductie bij targetvalidatie mogelijk door genetische perturbaties te koppelen aan functionele fenotypes. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door kwantitatieve, celtype-specifieke transcriptionele gegevens te leveren die kunnen bijdragen aan de triage van hypothesen. De aanpasbaarheid van de methode over verschillende levensstadia en celtypen heen verbetert de translationele continuïteit in de preklinische modellering van neurodegeneratieve processen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar cel-specifieke transcriptionele responsen mogelijk om target-interactie en padmodulatie in gedefinieerde neuronpopulaties te beoordelen.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare workflow voor het isoleren van levende cholinerge neuronen uit C. elegans voor daaropvolgende functionele assays.
Screening en assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gezuiverde neuronale lysaten die geschikt zijn voor qPCR-gebaseerde read-outs, waardoor kwantitatieve screening van genetische of farmacologische perturbaties mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Standaardiseert celisolatie via FACS of magnetische kraalscheiding, waardoor de variabiliteit in ex vivo-analyses tussen experimenten wordt verminderd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt het modelleren van ziekterelateerde systemen door neuronen te isoleren die betrokken zijn bij dysfunctie gerelateerd aan veroudering, wat de ontdekking van biomarkers faciliteert.
- Operationele waarde: Maakt kortstondige kweek van geïsoleerde neuronen mogelijk, waardoor tijdreeksstudies naar transcriptionele of elektrofysiologische veranderingen kunnen worden uitgevoerd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelhypothesen tot lead-identificatie, door mechanistische read-outs te bieden van genetisch gedefinieerde neuronale populaties.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetesten mogelijk via isolatie van GFP-gelabelde neuronen om veranderingen in genexpressie na perturbatie te meten.
- Screening: Levert gestandaardiseerde neuronale monsters op die geschikt zijn voor transcriptionele assays met een hoge gevoeligheid.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van RNA-opbrengst en zuiverheid via spectrofotometrie, ter ondersteuning van datanormalisatie en vergelijking.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door neuronen te isoleren uit verouderingsmodellen om geconserveerde paden van neuronale achteruitgang te bestuderen.
- Enterprise Reuse: Aanpasbare promoter-GFP-systemen maken hergebruik mogelijk over meerdere neurontypes en levensfasen, wat de bruikbaarheid van het platform vergroot.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door transcriptionele veranderingen te koppelen aan specifieke neuronpopulaties, waardoor het vertrouwen in het target wordt vergroot.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde isolatie van levende cellen mogelijk met behulp van gevestigde scheidingstechnieken, wat de reproduceerbaarheid verhoogt.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door vroegtijdige, celtype-specifieke functionele gegevens te verschaffen die target-hypotheses ontrisken.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van validatie van neurale paden in een genetisch hanteerbaar systeem.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het omgaan met transgene modellen, fluorescence-activated cell sorting en RNA-isolatietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot flowcytometers of magnetische separatiesystemen die compatibel zijn met neuronale monsters met een klein volume.
- Vereist standaardisatie van digestie- en wasprotocollen om een consistente celopbrengst en levensvatbaarheid tussen batches te garanderen.
- Aanpassing aan andere neurontypen is afhankelijk van de beschikbaarheid van specifieke promoter-GFP-lijnen en optimalisatie van de dissociatiecondities.
- Praktische beperkingen omvatten een kort venster van levensvatbaarheid na isolatie en potentiële stress door mechanische en enzymatische dissociatiestappen.
