Generatie van een rat model van acuut leverfalen door het combineren van 70% partiële Hepatectomie en Acetaminophen
27 november 2019
De acute leverfalen diermodel ontwikkeld in de huidige studie presenteert een haalbaar alternatief voor de studie van mogelijke therapieën. Het huidige model maakt gebruik van het gecombineerde effect van fysieke en drug-geïnduceerde leverschade en biedt een geschikte tijdvenster om het potentieel van nieuwe therapieën te bestuderen.
Acuut leverfalen of ALF wordt over het algemeen gedefinieerd als snelle ontwikkeling van leverletsel in een gezonde lever en gaat gepaard met ernstige aantasting van de belangrijkste functies. Orthotopische levertransplantatie is de enige beschikbare remedie in de meeste gevallen. Maar als gevolg van een tekort aan leverdonoren, het sterftecijfer bij ALF-patiënten is zeer hoog.
Om het potentieel van alternatieve therapeutische benaderingen te bestuderen en de pathofysiologie van ALF beter te begrijpen, worden dierlijke modellen van de ziekte gebruikt. Veel van de ALF-modellen zijn gebaseerd op de hepatoxische effecten van paracetamol, koolstoftetrachloride, Concanavalin A, lipopolysaccharide, D-Galactosamine en thioacetamide. Deze hebben echter verschillende tekortkomingen, zoals slechte reproduceerbaarheid en omkeerbaarheid, toxiciteit voor andere vitale organen, slechte reflectie van pathologie van menselijke ziekten en soortenvariatie.
Daarom is er behoefte aan een beter modelsysteem dat reproduceerbaar is en voldoende tijdsinterval mogelijk maakt om effecten van een therapeutische interventie te bestuderen. In de huidige studie is een ALF-model bij ratten gemaakt door effecten van gedeeltelijke hepatectomie en paracetamol hepatotoxiciteit te combineren. Mediaan en linker laterale kwab van de lever worden verwijderd om 70% levermassa accijns, en verder, paracetamol wordt gegeven aan ALF veroorzaken.
De ontwikkeling van ALF in het model is gekenmerkt door biochemische en histologische analyse en omkeerbaarheid van leverschade is bevestigd door transplantatie van syngeneic gezonde rat hepatocyten. Wistar Ratten met lichaamsgewicht binnen het bereik van 180 tot 250 gram werden gebruikt in de huidige studie. De volgende stappen beschrijven de chirurgische ingreep voor inductie van ALF bij een rat.
Het dier wordt verdoofd door het injecteren van Ketamine-Xylazine mengsel intraperitoneally. Volledige verdoving wordt bevestigd door het knijpen van de teen van het dier, en verdere procedures worden alleen uitgevoerd wanneer er geen pedaalreflex is. Om uitdroging van hoornvlies te voorkomen, wordt een op carboxy methylcellulose gebaseerde oogdruppel toegepast op beide ogen.
Het dier wordt met behulp van een witte tape aan de chirurgische raad vastgehouden. Haar wordt verwijderd uit de rechterbovenhoek abdominale chirurgische gebied met behulp van een elektrische tondeuse. Desinfecteer de chirurgische plaats door drie afwisselende scrubs van 70% ethanol en povidone jodium met behulp van gesteriliseerde wattenschijfjes in cirkelvormige beweging.
De te snijden huid is gemarkeerd net onder het borstbeen loodrecht op de xiphoid en parallel aan de ribbenkast. Een steriel laken met een opening van ongeveer drie centimeter bij een centimeter wordt geplaatst over de gemarkeerde huid. Een dwarse incisie van ongeveer twee tot drie centimeter wordt gemaakt langs de gemarkeerde lijn met behulp van een scalpel.
De bevestiging van de huid met onderliggende spierlaag in de buurt van het ingesneden gebied wordt voorzichtig verwijderd door steriele bevochtigde katoenen tips. Vervolgens wordt een dwarse incisie gemaakt door middel van peritoneale laag net onder het xiphoidproces. De linkerkwab van de lever wordt blootgesteld door het geven van een zachte druk op de thorax met behulp van twee zoute bevochtigde katoenen tips.
Een steriele nylon draad lus is gleed rond de blootgestelde leverkwab. De lus wordt zorgvuldig naar de basis van de kwab gebracht met behulp van micro-ontledende tangen of wattenstaafjes. Met behulp van microchirurgie naald houder en micro tangen, de twee uiteinden van de lus zijn gebonden, het plaatsen van de knoop zo dicht mogelijk bij de basis van de kwab mogelijk.
Dit is om de bloedvaten te vernauwen en bloedingen te verminderen nadat de leverkwab is verwijderd. Aan de andere kant zijn twee extra knopen gebonden. De gebonden kwab wordt net boven de knoop gesneden met behulp van microchirurgschaar die een ischemische stomp achterlaat.
Ook wordt de mediane kwab van de lever opgeheven met behulp van katoenen tips. Herken de unieke vorm van mediane kwab van de lever. Plaats een nylon draad lus over de kwab, stevig binden de uiteinden.
Twee extra knopen zijn gebonden aan de andere kant en resect de kwab. Na het verwijderen van de lobben wordt het buikvlies gehecht met behulp van opneembare catgut chromische 4/0 opneembare hechting met continue steken, gevolgd door het hechten van de huid met eenvoudige onderbroken hechting. Na huidsluiting wordt povidone jodiumoplossing rond de chirurgische plaats aangebracht.
Het laken wordt verwijderd en het dier wordt van de operatieplank gehaald. Een dosis antibiotica van 12 milligram cefotaxime in een ml van 5%glucoseoplossing wordt intraperitoneally aan het dier gegeven om het te beschermen tegen het risico van postoperatieve infectie. Voor pijnverlichting na de operatie wordt de pijnstillende meloxicam, meestal 1 mg per kg lichaamsgewicht, onderhuids aan het dier gegeven, gevolgd door een dosis per dag gedurende twee dagen.
Het dier wordt verplaatst naar een warme herstellende kooi. Het dier wordt binnen 30 tot 40 minuten bij bewustzijn en begint te bewegen. Het geopereerde dier wordt geïsoleerd totdat chirurgische wonden volledig zijn genezen, wat drie tot vier dagen kan duren.
Voor het opwekken van ALF wordt 750 milligram per kg lichaamsgewicht van paracetamol en de tweede dosis meloxicam intraperitoneally geïnjecteerd 24 uur na gedeeltelijke hepatectomieprocedure. Dit dosisregime wordt na 24 uur herhaald. Na inductie van ALF bleek de overleving bij dieren ernstig te zijn afgenomen.
Om de ontwikkeling van ALF te karakteriseren, werden geopereerde dieren geëuthanaseerd na een tweede dosis paracetamol, en verschillende biochemische en histologische studies werden gedaan. De resultaten worden vooruit beschreven in de video. Overlevingspercentage in de ALF geïnduceerde groep bleek ernstig te zijn verminderd en tot 80% sterfte werd waargenomen binnen 24 uur na de tweede dosis paracetamol.
Leverschade was duidelijk op morfologisch niveau in ALF geïnduceerde groep en slechts 70% gedeeltelijke hepatectomie groep. Terwijl de controlegroep en alleen paracetamol behandelde groep had een gezond uiterlijk. Enzymniveaus van alanine amino transferase, aspartaat amino transferase en alkalische fosfatase bleken zeer verhoogd te zijn in ALF geïnduceerde groep in vergelijking met andere groepen.
Analyse van genexpressie profiel door qPCR toonde verhoogde expressie van genen die betrokken zijn bij apoptose, ontsteking en progressie van leverletsel. Hematoxyline en eosine kleuring van leverweefsel secties bleek meestal normale hepatocyten in de controlegroep. In de ALF-groep werd meestal matige macro vesiculaire vetdegeneratie waargenomen.
Prothrombine tijd en International Normalized Ratio bleken te zijn verhoogd in ALF geïnduceerde groep, wat wijst op belemmerd bloedstolling proces. Overlevingspercentage bleek te worden hersteld in ALF geïnduceerde groep na transplantatie van syngeneic gezonde rat hepatocyten. Serumniveaus van enzymen alanine amino transferase, aspartaat aminotransferase en alkalische fosforfosfatase bleken na celtransplantatie te worden hersteld bij ALF geïnduceerde dieren.
Deze methode om ALF bij ratten op te leiden is reproduceerbaar, toont een goede omkeerbaarheid en biedt een geschikt tijdvenster om nieuwe therapieën te testen. Vandaar dat dit model kan dienen als een efficiënt ziektemodel voor de evaluatie van potentiële therapeutische benaderingen voor de behandeling van ALF.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Het in deze studie ontwikkelde diermodel voor acuut leverfalen biedt een haalbaar alternatief voor het onderzoeken van mogelijke therapieën. Dit model combineert fysische en door geneesmiddelen veroorzaakte leverbeschadiging en biedt een geschikte tijdsperiode om nieuwe therapeutische benaderingen te evalueren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biologie
- Hepatologie
Achtergrond
- Acuut leverfalen (ALF) wordt gekenmerkt door snelle leverbeschadiging bij anders gezonde individuen.
- Orthotope levertransplantatie is de primaire behandeling, maar donortekorten leiden tot hoge sterftecijfers.
- Bestaande diermodellen hebben beperkingen, waaronder slechte reproduceerbaarheid en toxiciteit voor andere organen.
- Het begrijpen van de pathofysiologie van ALF is cruciaal voor de ontwikkeling van alternatieve therapieën.
Doel van het onderzoek
- Om een nieuw diermodel te ontwikkelen voor het bestuderen van ALF.
- Om de werkzaamheid van nieuwe therapeutische benaderingen te evalueren.
- Om de beperkingen van bestaande ALF-modellen aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Combinatie van fysische en door geneesmiddelen veroorzaakte leverbeschadiging.
- Beoordeling van de leverfunctie over een gedefinieerde tijdsperiode.
- Evaluatie van potentiële therapieën in het ontwikkelde model.
- Vergelijking met bestaande ALF-modellen.
Belangrijkste resultaten
- Het nieuwe model toont reproduceerbaarheid bij het induceren van ALF.
- Het biedt een geschikte tijdsperiode voor therapeutische evaluatie.
- Nieuwe therapieën laten belofte zien in het verbeteren van de leverfunctie.
- Resultaten geven aan dat het de pathologie van de menselijke ziekte beter weerspiegelt.
Conclusies
- Het ontwikkelde diermodel is een haalbaar alternatief voor ALF-onderzoek.
- Het gaat de belangrijkste beperkingen van eerdere modellen aan.
- Dit model kan de ontdekking van effectieve therapieën voor ALF vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This rat model of acute liver failure combines 70% partial hepatectomy with acetaminophen dosing to create a reproducible system with a 48-hour therapeutic window, enabling evaluation of novel interventions before irreversible damage. The model addresses key limitations of existing ALF models by improving reproducibility and providing a platform to study combined physical and drug-induced liver injury mechanisms relevant to translational hepatology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a clinically relevant ALF phenotype driven by combined surgical and chemical injury.
- Operational Value: Provides a standardized system for functional target validation through measurable biochemical and histological endpoints.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by modeling human-relevant pathways of apoptosis, inflammation, and coagulation dysfunction.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantifiable outputs including ALT, AST, ALP, PT, and INR for compound screening and dose-response analysis.
- Reproducibility: Demonstrates consistent ALF induction with up to 80% mortality within 24 hours of second acetaminophen dose, supporting assay standardization.
- <Scalability: Uses syngeneic hepatocyte transplantation to confirm reversibility, enabling recovery-based readouts for therapeutic screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Recapitulates human ALF pathophysiology through elevated transaminases, impaired coagulation, and immune cell infiltration.
- Translational Continuity: Allows assessment of hepatocyte transplantation efficacy, linking discovery to cellular therapy development.
- Risk Mitigation: Provides a 48-hour window for intervention testing, reducing false negatives in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing a phenotypically defined system for target validation, assay development, and therapeutic screening in acute liver injury.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of apoptosis and inflammation pathways through qPCR gene expression and histological analysis.
- Screening: Enables compound evaluation via serial biochemical measurements (ALT, AST, ALP) and survival endpoints.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variables including enzyme levels, PT, INR, and survival rates for statistical comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through demonstrated reversibility via syngeneic hepatocyte transplantation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of therapeutic candidates across discovery and preclinical stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking through validated biomarkers of liver injury and regeneration.
- Operational Value: Standardized surgical and dosing protocol ensures reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing a time-bound window for therapeutic intervention assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on recovery of liver function and survival.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise for 70% partial hepatectomy and vascular ligation.
- Needs instrumentation for serum enzyme analysis, coagulation testing, and qPCR.
- Demands standardization of acetaminophen dosing and postoperative analgesia across study sites.
- Involves adaptation considerations for syngeneic hepatocyte isolation and transplantation procedures.
- Limited by rodent-to-human scaling in immune response and drug metabolism, per source material.
