Single cell micro-aspiratie als alternatieve strategie voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering voor scheiding van gigantische virus mengsels

Single Cell Micro-Aspiration is een methode om de verschillende technieken die worden gebruikt op het gebied van microbiologie in het algemeen en in de virologie in het bijzonder aan te vullen. Het zou kunnen beantwoorden belangrijke vraag en problemen op te lossen ondervonden tijdens gigantische virussen isolatie door het scheiden van een virus van een virale mengsel presenteren een lage overvloed Virus zoals het geval was voor omzet virussen, clandisinal virus, en uzibati virus van een andere, dat is Faustovirus, aanwezig in hoge overvloed toch. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is het gebruik van een indirecte strategie.

Het bestaat uit het scheiden en klonen van de geïnfecteerde gastheer om een virale scheiding te verkrijgen. Deze methode bewaakt dus de verschillende stappen van het vastleggen tot het vrijkomen van cellen en bevestigt het sorteerproces door microscopische observatie. Ten slotte wordt moleculaire biologie gebruikt om de sorteer- en elektronische microscopie te bevestigen om de gescheiden virale deeltjes te observeren.

Deze aanpak zal het grootste probleem van virusscheiding oplossen. Het is een prospectieve voor het klonen van ameba of klonen protisten in het algemeen. De persoon die probeert om deze techniek te gebruiken voor de eerste keer moet rigoureus en nauwkeurig bij het beheersen van de druk.

De visuele controle is essentieel om de opname en het vrijkomen van slechts één cel te bevestigen. Gebruik Vermamoeba Vermiformis, stam CDC 19, als celondersteuning. Voeg 30 milliliter PYG-medium en drie milliliter van de amoebe toe bij een concentratie van één maal tien tot de zesde cellen per milliliter in een celkweek van 75 vierkante centimeter.

Houd de cultuur op 28 graden Celsius in een couveuse. Na 48 uur breng je 10 milliliter van de amoebecelcultuur over op een telplaat en leg je deze onder een microscoop om de amoebe te kwantificeren. Om te spoelen, oogst 30 milliliter van de celcultuur in een buis en pellet de amoebe door centrifugatie op 720 keer G gedurende 10 minuten.

Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in het juiste volume van de hongerdroom om de concentratie van een keer 10 tot de zesde cellen per milliliter te verkrijgen. Bereid de cellulaire ondersteuning voor met de toevoeging van antimicrobiële agent. Voeg in een bioveiligheidskast één keer 10 toe aan de zesde amoebecultuur in twee milliliters hongermedium.

Dan inenting 100 milliliter van de voorraad oplossing die het mengsel van virussen in de amoebecelcultuur te ondersteunen bij een veelheid van infectie van 0,01. Broed de geïnfecteerde amoebecelcultuur ondersteuning. Voeg 30 graden Celsius toe gedurende 10 tot 14 uur of totdat cytopathische effecten worden veroorzaakt, zoals amoebal afronding of lyse.

Gebruik vervolgens een spuit om de media te verzamelen en filtrate door middel van een vijf micron filter om cellulaire puin te verwijderen. Voer een graanverdunning uit van het virale monster in verhongeringsmedium in verschillende putten. Inoculateert twee milliliter van één keer 10 tot de zesde Vermamoba Vermaformis in elke petrischaal met 100 milliliter van het mengsel entmateriaal.

Plaats vervolgens de petrischaaltjes in een afsluitbare plastic zak op 30 graden Celsius. Observeer de petrischaaltjes na zes uur met omgekeerde optische microscopie en controleer de celmorfologie om de vier tot acht uur. De antimicrobiële behandeling is voor de cellulaire ondersteuning.

Selecteer uit de petrischaaltjes degenen die afwezig zijn van een visuele besmetting door schimmel- en bacteriële agentia en met bewijs van cytopathisch effect van amoebe als gevolg van de virussen en met pre-lyse en afrondingsfase van de amoebe om aspiratie van virale deeltjes te voorkomen. Stel een werkstation in met micromanipulator, handmatig drukapparaat, omgekeerde microscoop, Plug and Play Motor-modules, camera en computermodule. Kies een micro capillair van 20 micron binnendiameter om het onderhoud van een interne positie en een gemakkelijke afgifte van de cel mogelijk te maken.

Bevestig de bedieningshoek van het grijpsysteem op de gemotoriseerde module op 45 graden. Voer een dubbele installatie uit, eerst op het grijpsysteem en vervolgens op de micro capillaire. Focus op de cellen.

Om cellen te klonen, plaats de petrischaal met twee milliliter geïnfecteerde amoebe onder de microscoop. Focus eerst op de cellen en vervolgens op de micro capillaire ondergedompeld in de cultuur. Het plukken van afgeronde eencellige en breng de micro capillaire dichter bij de micromanipulator.

Oefen zachte aspiratie uit met handmatige drukcontrole op de cel die deze in de micro-capillaire neemt Verwijder de enkele cel uit het eerste monster en laat het los in de celcultuurondersteuning van de amoebe. Dan broeden op 30 graden Celsius. Controleer zorgvuldig de druk om een enkele cel te kunnen nastreven en controleer uw aspiratie door de waarneming van het vrijkomen van een enkele cel.

Voer dagelijkse waarnemingen uit met een omgekeerde optische microscoop om het uiterlijk van de cellen te observeren en de opkomst van het cytopathische effect te monitoren. Gebruik nu een geautomatiseerd extractiesysteem om DNA te extraheren uit een deel van de positieve kweekmonsters waar een cytopathisch effect wordt waargenomen. Ontwerp primers om arme genen te versterken geannoteerd als RBP2 voor Faustovirus, belangrijke capsid eiwit voor Usurpatvirus, en kleine capsid eiwit voor Clandestinovirus.

Voer standaard PCR uit met behulp van een thermocycler volgens het manuscript. Voer 20 microliliters pcr-reacties uit met 50 micromolar van elke primer, 1X Master Mix en ribonuclease gratis water. Voer de PCR-producten met DNA-gel vlek op een 1,5%agarose gel op de spanning van 135 volt en visualiseren met UV. Dit protocol optimaliseert een micromanipulatieproces met microaspiratie met één cel.

Deze techniek maakt het vastleggen van een afgeronde en geïnfecteerde amoebe en de release ervan in een nieuwe plaat met niet-geïnfecteerde amoebe. Deze aanpak met succes geïsoleerd een nieuwe lage overvloed gigantische virus genaamd Userpatvirus LCD7. Uw Userpatvirus werd alleen waargenomen in kloon zeven met aanwezigheid van Userpatvirus LCD7 DNA en afwezigheid van Faustovirus DNA.

Elektronenmicroscopie onthulde het uiterlijk van Het Clandestinovirus ST1, dat een typische icosahedralmorfologie zonder fibrils evenals Usurpatvirus LCD7 met een icosahedral capsid van ongeveer 250 nanometers heeft. Lage cytometrie bevestigt de overlapping van populaties van Faustovirus en Nauvoirus. Eenmaal onder de knie, kan deze procedure gemakkelijk worden gedaan.

Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is de noodzaak van een minimale observatie ritueel met betrekking tot de grootte van de entiteiten met de goede behandeling van de bevoegde van het werkstation en de controle van eventuele verontreiniging probleem. Deze aanpak kan worden gebruikt als sorteertechniek op basis van celmorfologie. Momenteel wordt het gebruikt in ons laboratorium voor het klonen van specifieke amoebe.

Een kritiek punt van deze techniek is het handhaven van de cel integriteit. Inderdaad, kunnen we een aantal problemen met de niet-observatie van de cel of release. Dit is vooral te wijten aan de desintegratie van de cel in de micro capillaire.

Deze methode kan een efficiënt alternatief zijn wanneer fout telemetrie en fact sortering niet beschikbaar zijn en wanneer specifieke techniek beperkingen worden bereikt. Vergeet niet dat in sommige gevallen de cel niet wordt vrijgegeven uit de micro capillaire. Dit is deels te wijten aan de amoebe kenmerken en hun vermogen om zich aan te passen en vervolgens van het celmembraan.