Name: Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer de isolatie van leukocyten uit menselijke moedermelk voor antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose van HIV-doelwitten. Deze methode helpt onderzoekers de fagocytische capaciteit te evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Susan Zolla-Pazner in het departement geneeskunde en departement microbiologie aan de Icahn school of Medicine op de berg Sinai voor manuscript Review. Het NIH/NICHD verstrekte financiering voor dit project onder grantnummer R21 HD095772-01A1. Daarnaast werd R. Powell gesteund door fondsen van de afdeling geneeskunde, afdeling besmettelijke ziekten, Icahn school of Medicine op de berg Sinaï.

Elke deelnemer aan deze studie werd gerekruteerd en geïnterviewd in overeenstemming met de goedkeuring van de ethische en institutionele Review Board (IRB) met de begeleiding en toestemming van het Mount Sinai-programma voor de bescherming van menselijke proefpersonen (PPH'S) met behulp van een IRB-goedgekeurde protocol voor het verkrijgen van borst melkmonsters.
1. doel microsphere voorbereiding
<ol><li>Selecteer een relevant doel antigen. Opmerking: in dit voorbeeld werd het recombinant eiwit V1V2-2F5K gebruikt, dat ontworpen was om de trimere Apex van inheemse HIV-envelop30na te bootsen.</li>
	<li>Voer biotinylatie uit met behulp van een commerciële Kit (tabel met materialen) volgens het Protocol van de fabrikant.<ol>
<li>Bereken mmol van het biotinereagens om toe te voegen aan de reactie voor een 5-voudige molaire overmaat met behulp van de formule: mmol Biotine = ml proteïne x (mg eiwit/ml eiwit) x (mmol Biotine/mg proteïne) x (5 mmol Biotine/mmol proteïne)30,31. Bereken vervolgens μL van het biotinereagens om toe te voegen met behulp van de formule: μL Biotine = mmol Biotine x (1.000.000 μL/L) x (L/10 mmol).</li>
		<li>Equilibrumbiotine op kamertemperatuur voor het openen. Los eiwitten op in 0,5 − 2,0 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) volgens de bovenstaande berekening.</li>
		<li>Bereid een 10 mM-oplossing van biotinereagens in dimethylsulfoxide (DMSO) en voeg het juiste volume van 10 mM Biotine reagens toe aan de eiwit oplossing en inbroed de reactie op ijs gedurende 2 uur of bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder overtollig Biotine met proteïne concentrators (polyethersulfone [PES] membranen, 3 kDa molecuulgewicht cut-off [MWCO], 0,5 mL; Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.<ol>
<li>Steek het monster in de bovenste kamer van de spin kolom en voeg PBS toe tot 400 μL. dop en steek deze monsterkamer in een verzamelbuis. Centrifugeer op 12.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Gooi de doorstroming weg en voeg PBS toe aan 400 μL. herhaald centrifugeren. Gooi de doorstroming weg en voeg PBS toe aan 100 μL. meet de eiwitconcentratie door een spectrofotometer. Opmerking: eiwitten kunnen worden alicgeciteerd en bevroren bij-80 °C totdat ze worden gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) test plaat preparaat
<ol><li>Geconjugeerde biotinyleerd proteïne tot 1 μm microsferen (' kralen '; Tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.<ol>
<li>Per plaat van geconjugeerde kralen, inbroed 6 μg eiwit met 12 μl voorraad kralen in 200 μl 0,1% boviene serumalbumine (BSA)-PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, grondig zachtjes elke 20 min.</li>
		<li>Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 5 min. Gooi supernatant weg, Vortex zachtjes en respendeert in 1200 μL van 0,1% BSA-PBS. Herhaal de spin en spoel stap 2x. Respenderen in 1200 μL van 0,1% BSA-PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 10 μL kraal oplossing per put in een ronde bodem 96-well plate. Bereid verdunningen van antilichamen of immuunsera die van belang zijn in 12 μL van 2% HBSS, meestal beginnend met 50 μg/mL antilichaam of een 1/100 serumverdunning. Opmerking: in de voorbeeldgegevens werd monoklonaal antilichaam (mAb) 830A gebruikt.</li>
	<li>Voeg 10 μL getitreerd antilichaam/sera toe aan de kraal plaat en incuberen gedurende 2 uur bij 37 °C. Voeg 200 μL van 2% HSA HBSS toe aan elke put en centrifuge plaat bij 2.000 x g gedurende 10 min.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig supernatant door een snelle ommekeer en decanteren van vloeistof van de plaat putten in een gootsteen om te voorkomen dat de onzichtbare kraal pellet wordt verstoord.</li>
</ol>3. borst melk celisolatie
<ol><li>Verkrijgen van menselijke moedermelk van gezonde zogende vrouwen, uitgedrukt met behulp van dubbele elektronische of handmatige pompen. Isoleercellen binnen ~ 4 h van expressie, melk bij kamertemperatuur houden.</li>
	<li>Gebruik 50 mL tubes, centrifuge 50 mL melk bij 800 x g gedurende 15 min. Giet de magere melk en het vet voorzichtig af terwijl u de celpellet ongestoord verlaat. Veeg de binnenkant van de buis af met een pluisvrij doekje om alle vetten uit de buiswand te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 10 ml 2% humane serumalbumine toe in de gebalanceerde zoutoplossing van Hank (2% HSA HBSS [zonder ca.2 + of mg+]). Rebreng de pellet door voorzichtig pipetteren om celactivatie en apoptosis te voorkomen. Breng aan op een buis van 15 mL en centrifugeer bij 450 x g gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Giet de supernatant af en herhaal stap 1,3. Vervolgens, voorzichtig respenderen cellen in 1 − 2 mL van 2% HSA HBSS afhankelijk van verwachte celnummer, en cellen tellen door een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller, opmerkend ook de levensvatbaarheid van de cel.</li>
</ol>4. ADCP-bepaling
Opmerking: hier beschreven methoden zijn aangepast van Ackerman et al.32.
<ol><li>Voeg 50.000 vers geïsoleerde BM-cellen toe aan elke ADCP-test plaat goed in 200 μL van 2% HSA-HBSS. Inincuberen voor 2 uur bij 37 °C.<ol>
<li>Voor controle-experimenten, pre-Incubate cellen bij 37 ° c met 10 μg/mL actine remmer (cytochalasin-D), 50 μg/mL FcR-blokkerende agent (FcBlock), of een combinatie van beide vóór hun toevoeging aan de platen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuge plaat bij 930 x g gedurende 10 min. Voeg 200 μL van 2% HSA HBSS toe en herhaal centrifugeren. Verwijder voorzichtig supernatant zoals in stap 2,7 en herhaal wassen.</li>
	<li>Verwijder zorgvuldig supernatant-en vlek cellen voor levensvatbaarheid met 0,5 μg/ml (eindconcentratie) corrigeerbare levensvatbaarheid vlek 450 per put in 50 μL van 2% HSA HBSS. Inincuberen 20 min bij kamertemperatuur in het donker. Centrifuge plaat bij 930 x g gedurende 10 min en verwijder supernatant zoals in stap 2,7. Voeg 200 μL van 2% HSA HBSS en centrifuge plaat opnieuw toe, gevolgd door verwijdering van supernatant zoals in stap 2,7.</li>
	<li>Na levensvatbaarheid kleuring, vlek cellen voor leukocyten markers van belang, minimaal met een CD45-specifieke vlek zoals PE-muis anti-menselijke CD45 (kloon HI30) in een geoptimaliseerde concentratie (1 μg/μL in 50 μL van 1% BSA HBSS in de voorbeeldgegevens). Opmerking: eventuele Lineage-specifieke markeringen van belang kunnen worden opgenomen.</li>
	<li>Inincuberen 20 min bij kamertemperatuur in het donker. Centrifuge plaat bij 930 x g gedurende 10 min en verwijder supernatant zoals in stap 2,7. Voeg 200 μL van 1% BSA HBSS toe en herhaal centrifugeren. Verwijder supernatant. Repareer cellen in 200 μL van 0,5% formaldehyde in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min of 's nachts bij 4 °C. Koel in het donker tot de analyse.</li>
</ol>5. analyse doorstroming cytometrie
<ol><li>Voer initiële gating uit om dubbeltjes op een forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC) plot en puin (materiaal kleiner dan FSC = 5000) te elimineren (Zie Figuur 1). Gebruik een SSC vs. levensvatbaarheid vlek (V450 in dit geval) plot om dode cellen te elimineren (die positief zijn voor de levensvatbaarheid vlek).</li>
	<li>Gebruik een SSC vs. CD45 plot om de belangrijkste leukocyten klassen (Granulocyten, monocyten, lymfocyten) te differentiëren zoals uitvoerig beschreven33,34. Opmerking: deze classificatie is alleen suggestieve en Lineage-specifieke markeringen nodig zijn om te bevestigen celtype.</li>
	<li>Meet voor alle CD45 + cellen, of voor elke interesse groep van leukocyten, ADCP-activiteit door te gaten met een marker op de parel-positieve cellen in een histogram van het fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-kanaal, waar de fluorescerende kralen worden gedetecteerd. Opmerking: de negatieve controle putten waarin kralen niet zijn toegevoegd, geven aan waar de parel-positieve cellen zichtbaar zijn in het histogram en dus waar de gating marker moet worden geplaatst.</li>
	<li>Bereken ADCP scores als (mediane fluorescentie intensiteit [MFI] van parel-positieve cellen) x (% van de totale CD45 + cellen in de positieve populatie). Gebruik grafische software om scores te tekenen bij elke AB/serumconcentratie en om een Area-under-the-Curve (AUC)-analyse uit te voeren. Opmerking: ADCP wordt als positief beschouwd als de AUC groter is dan 3x standaarddeviatie van de ADCP Score AUC van een niet-specifieke negatieve controle mAb (in dit geval 3865).</li>
</ol>

<ol><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+human+milk%3A+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Lactation%22%5BJournal%5D)">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li>
<li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li>
<li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li>
<li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+%287-20+months%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li>
<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li>
<li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatrica%22%5BJournal%5D)">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li>
<li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li>
<li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring%3A+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li>
<li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li>
<li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding%3A+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer%27s+Patches+of+the+Nursed+Infant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762(2016).</li>
<li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29(2011).</li>
<li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li>
<li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries%3A+a+pooled+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding%3A+The+Duration+of+Breastfeeding%2C+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).</li>
<li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li>
<li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission%3A+past+successes%2C+current+progress+and+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li>
<li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150(2015).</li>
<li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li>
<li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143(2012).</li>
<li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+%28ADCC%29+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li>
<li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li>
<li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAckerman%2C+M+%22Antibody+Fc%22">Antibody Fc</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).</li>
<li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li>
<li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li>
<li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li>
<li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li>
<li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li>
<li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+next-generation+cleaved%2C+soluble+HIV-1+Env+trimer%2C+BG505+SOSIP.664+gp140%2C+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618(2013).</li>
<li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Korean+Journal+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li>
<li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580(2015).</li>
<li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum%3A+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li>
<li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De flow cytometrie-gebaseerde techniek voor het meten van de ADCP-activiteit beschreven in dit document werd voor het eerst beschreven in 201130 en is sindsdien robuust en aangehaald in meer dan 80 studies. Het hier beschreven protocol past deze techniek voor de eerste keer aan voor gebruik met primaire BM-cellen. Eerdere studies met FC-gemedieerde functionaliteit van BM Cells zijn grotendeels beperkt tot het meten van oxidatieve uitbarstingen of op histologie gebaseerde fagocytose assays met cell...

Menselijke moedermelk (BM) bestaat uit moeder cellen die > 90% levensvatbaar1. Cel samenstelling wordt sterk beïnvloed door het stadium van de lactatie, gezondheidstoestand van moeder en zuigeling, en individuele variatie, die blijft slecht begrepen1,2,3,4. Gezien het feit dat BM ~ 103− 105 leukocyten/ml bevat, kan worden geschat dat zuigelingen met borstvoeding ongeveer 105− 108 moeder leukocyten per dag innemen5. Verschillende in vivo studies hebben aangetoond dat maternale leukocyten kritische immuniteit bieden aan de zuigeling en functioneel ver buiten deze sites van initiële inname5,6,7,8 ,9,10,11. Alle maternally-afgeleide cellen ingenomen door de zuigeling hebben het potentieel om immune functies uit te voeren naast of te compenseren voor de zuigeling eigen leukocyten12.
De overdracht van moeder naar kind (MTCT) van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) blijft een crisis in landen met beperkte middelen. Aangezien diarree en luchtwegaandoeningen verantwoordelijk zijn voor een aanzienlijk sterftecijfer bij zuigelingen in hulpbronnen beperkte landen, en deze ziekten aanzienlijk worden verminderd door exclusieve borstvoeding, zijn de voordelen voor HIV-geïnfecteerde moeders van borstvoeding veel zwaarder dan de Risico's13,14,15. Tenzij de toegang tot schoon water en de juiste zuigelingenvoeding betrouwbaar is, raadt de WHO het staken van de borstvoeding voor HIV-geïnfecteerde moeders16niet aan. Ongeveer 100.000 MTCTs via BM komen jaarlijks voor; Toch wordt slechts ~ 15% van de zuigelingen die borstvoeding krijgen door hun HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd, wat een sterk beschermend effect van BM17,18,19,20,21suggereert. Talrijke factoren werken waarschijnlijk in tandem om transmissie te voorkomen. Belangrijk is dat HIV-specifieke antilichamen (ABS) in BM zijn gecorreleerd met verminderde MTCT en/of een verminderde baby sterfte van HIV-infectie22,23. Wat grotendeels onduidelijk blijft, is de bijdrage van de cellulaire fractie van BM aan zijn antivirale kwaliteiten.
Veel ABS vergemakkelijkt een verscheidenheid aan antivirale activiteiten die worden gemedieerd door de ' constante ' regio van het immunoglobuline molecuul, het kristalverbare fragment (FC), via interactie met FC receptoren (FcRs) gevonden op vrijwel alle aangeboren immuuncellen, vrijwel allemaal zijn te vinden in Human BM24. Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) is aangetoond indien nodig voor de klaring van virale infecties en is onderonderzocht in het geval van preventie van MTCT van HIV25,26,27, 28 , 29. gezien de schaarste van kennis over de potentiële bijdrage van de ADCP-activiteit door BM fagocyten aan de preventie van MTCT van HIV, hebben we ons gericht op het ontwikkelen van een rigoureuze methode om cellen te isoleren van menselijke BM om een studie te verrichten van ADCP gemedieerd door cellen uit BM verkregen in verschillende stadia van de lactatie.

<table><tbody><tr><td>1 &micro;m FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8776</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td><td>BD</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>8810025</td><td></td></tr><tr><td>Corning V-bottom polystyreen 96-well plate&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain 450&nbsp;</td><td>BD</td><td>562247</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution</td><td>Sigma</td><td>252549&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HBSS zonder Calcium, Magnesium of Fenol Rood</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Human BD Fc Block</td><td>BD</td><td>564219</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>2191349</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene 10 mL Serological Pipettes&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td><td>Pierce</td><td>88512</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van hiv-doelwitten

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Zelfs bij afwezigheid van antiretrovirale geneesmiddelen, wordt slechts ~ 15% van de zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd, wat duidt op een sterk beschermend effect van moedermelk (BM). Tenzij de toegang tot schoon water en de juiste zuigelingenvoeding betrouwbaar is, raadt de WHO het staken van de borstvoeding voor HIV-geïnfecteerde moeders niet aan. Talrijke factoren waarschijnlijk werken in tandem om BM transmissie te verminderen. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 105− 108 maternale leukocyten dagelijks, hoewel wat grotendeels onduidelijk blijft is de bijdrage van deze cellen aan de ANTIVIRALE kwaliteiten van BM. op dit moment waren we gericht op het isoleren van cellen van menselijke BM om te meten antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP), een van de meest essentiële en pervasieve aangeboren immuunresponsen, door BM fagocyten tegen HIV-doelwitten. Cellen werden geïsoleerd uit 5 menselijke BM monsters verkregen in verschillende stadia van de lactatie. Isolatie werd uitgevoerd via zachte centrifugeren gevolgd door zorgvuldige verwijdering van melkvet en herhaald wassen van de celpellet. Fluorescerende parels bedekt met HIV-envelop (env) epitoop werden gebruikt als doelstellingen voor analyse van ADCP. Cellen werden bevlekt met de CD45 oppervlakte marker om leukocyten te identificeren. Er werd vastgesteld dat ADCP-activiteit significant was boven controle-experimenten en reproduceerbare meetbaar met behulp van een HIV-specifiek antilichaam 830A.

Melk kan op kamertemperatuur of koeler worden gehouden (hoewel niet bevroren); echter, gezien het feit dat we verminderde levensvatbaarheid hebben waargenomen wanneer melk erg koud is gehouden (gegevens niet weergegeven), en dat het eenvoudiger is om te verzamelen, kort op te slaan en te vervoeren bij omgevingstemperaturen, wordt aanbevolen dat de monsters niet gekoeld worden om de variabiliteit in monster-to-sample. In melk verkregen 7 − 183 dagen post-partum, celconcentratie bepaald doo...

Moedermelk zendt humaan immunodeficiëntie virus (HIV), hoewel slechts ~ 15% van zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd raken. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 105− 108 maternale leukocyten dagelijks, hoewel deze cellen zijn onderonderzocht. Hier beschrijven we de isolatie van moedermelk leukocyten en een analyse van hun fagocytische capaciteit.

Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

We ontwikkelden een rigoureuze methode voor het isoleren van cellen uit menselijke moedermelk om antilichaamafhankelijke cellulaire fagocytose, of ADCP, te bestuderen door borstkankerfgocyten tegen HIV-doelen. Deze techniek vergemakkelijkt de relatief snelle en eenvoudige isolatie van moedermelkcellen om de capaciteit van leukocytenpopulaties om ADCP uit te voeren te evalueren. Het aantonen van de procedure zal Alisa Fox zijn, een technicus van mijn laboratorium.Na het selecteren van een relevant doelantigeen, gebruik een commerciële kit om het eiwit van belang te biotinylaat volgens het protocol van de fabrikant. En deponeren de biotinylated monster in de bovenste kamer van een spin kolom. Voeg PBS tot 400 microliter toe en dop de kamer voordat u de kolom in een opvangbuis plaatst voor centrifugatie.Nadat u de stroom hebt verwijderd, voegt u PBS toe aan 400 microliter voor een tweede centrifugatie. Gooi de stroom door, voeg PBS toe aan 400 microliters en meet de eiwitconcentratie met een spectrofotometer om het biotinylated eiwit te vervoegen tot micrometermicrosferen. Incubeer zes microgram eiwit met 12 microliter voorraadkralen in 200 microliter PBS per plaat van geconjugeerde kralen bij kamertemperatuur gedurende twee uur, met zachte vortexing om de 20 minuten.Aan het einde van de incubatie, pellet het eiwit geconjugeerde kralen door centrifugatie en gooi de supernatant. Na zachte vortexen, resuspend het eiwit in 1200 microliters van 0,1%BSA in PBS, en was de buis door centrifugatie nog twee keer zoals net aangetoond. Na de laatste wasbeurt, resuspend de pellet in 1200 microliters in PBS plus BSA.Om ADCP-testplaten op te zetten, moet u eerst 12 microliterverdunningen van antilichamen, of het immuunserum van belang, voorbereiden in 2%BSA in PBS in een ronde bodem 96 putplaat. Voeg 10 microliter eiwit geconjugeerde kralen per put toe aan de plaat voor een incubatie van twee uur bij 37 graden Celsius. Voeg aan het einde van de incubatie 200 microliter PBS plus BSA toe.Na het verkrijgen van menselijke moedermelk van gezonde zogende vrouwen die met behulp van een pomp, binnen vier uur na expressie scheiden van de melk inhoud door centrifugatie en zorgvuldig giet de magere melk en vet, waardoor de cel pellet ongestoord. Veeg de binnenkant van de buis met een pluisvrij doekje om al het vet uit de buiswand te verwijderen en voeg 10 milliliter PBS plus HSA toe. Resuspend de pellet met zachte pipetting om celactivering in de apoptose te voorkomen, en breng de celsuspensie over naar een 15 milliliter buis voor centrifugatie.Na een tweede wasbeurt in PBS plus HSA zoals net aangetoond, voorzichtig resuspend de cellen in een tot twee milliliter verse PBS plus HSA voor het tellen. Voor een ADCP-test, snel omkeren van de voorbereide ADCP-plaat om de supernatant decanteren na de laatste centrifugatie en voeg vijf keer 10 op een vierde vers geïsoleerde moedermelkcellen in 200 microliters van PBS plus BSA voor een twee uur incubatie bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, centrifugeren de cellen en was de pellets twee keer in 200 microliters van verse PBS zoals aangetoond.Na de laatste wasbeurt, vlek de cellen met 0,5 microgram per milliliter van fixable levensvatbaarheid vlek 450 per put in 50 microliter PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, pellet de cellen voor twee wasbeurten in verse PBS zoals aangetoond, en vlek de cellen voor de leukocyten markers van belang gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Verzamel aan het einde van de incubatie de cellencentrifugatie en was de cellen twee keer in 200 microliters van 1%BSA plus PBS per wasbeurt.Na de laatste wasbeurt, bevestig de pellets in 200 microliters van 0,5% formaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Stel voor de stromingscytometrische analyse van de celmonsters een stroomcytometer in die is uitgerust met een hoge doorvoerplaatlezer om 175 microliter monster terug te trekken en 5000 cellen per put te verzamelen. Voer de eerste gating uit om doubletten en puin op een voorwaartse verstrooiing versus zijverstrooiingsplot te elimineren.Gebruik een side scatter versus levensvatbaarheid vlek plot om de dode cellen te elimineren. En gebruik een side scatter versus CD45 plot om de belangrijkste leukocyte klassen te onderscheiden. Voor alle CD45 positieve cellen, of voor elke leukocyte subset van belang, meet het antilichaam afhankelijke cellulaire fagocletose activiteit door gating met een marker op de kraal positieve cellen in een histogram van de juiste fluorofolaat kanaal voor de geconjugeerde kralen.Bereken vervolgens de antilichaamafhankelijke cellulaire fagocytosescores als de mediaan van de fluorescentieintensiteit van de kraalpositieve cellen door het percentage van de totale CD45 plus de cellen in de positieve populatie. Hier wordt de gating strategie voor het elimineren van doubletten, puin en dode cellen getoond. Tussen een tot 12% van de totale levende cellen zijn meestal CD45 positieve leukocyten met de meeste van de vermeende kant verstrooiing laag tot intermediaire CD45 lage monocyten lijken te zijn precursoren, of onrijpe cellen, op basis van de zijkant scatter versus CD45 gating.De vermeende granulocyten worden gedefinieerd als zijverstrooiing hoog, CD45 tussenliggende cellen. Meting van de ADCP-activiteit van vers geïsoleerde moedermelkcellen met behulp van een HIV-specifiek menselijk monoklonal antilichaam op een maand postpartum blijkt dat de behandeling met actineremmer Cytochalasin D en of Fc-receptor blokkerende antilichamen voorafgaand aan incubatie met antilichaamgebonden antigeen gekoppelde kralen resulteert in de ADCP-activiteit op of onder die waargenomen in de aanwezigheid van bestrijdingsantilichaam. De ADCP-score bepaald voor de totale CD45 positieve cellen is meestal tussen de 25 tot 35 keer boven de achtergrondniveaus, gedefinieerd met behulp van een negatieve controle, anti-miltvuur monoklonale antilichaam.Elke moedermelk monster is uniek en sommige pellets kan moeilijk te zien. Bovendien kunnen de leukocytenpopulaties, en dus de ADCP-scores, enorm variëren van steekproef tot monster.

isolation-leukocytes-from-human-breast-milk-for-use-an-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate the isolation of B cells from human peripheral blood using biotinylated antibodies specific for non-B cells and streptavidin-conjugated magnetic microbeads.

Isolation and Purification of B Cells from Human Peripheral Blood

This video demonstrates an assay to measure the antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) by breast milk phagocytes. Fluorescently labeled microspheres conjugated to an antigen-antibody complex, are combined with a cell suspension isolated from breast milk to induce antibody-dependent cellular phagocytosis by the phagocytic leukocytes. Upon labeling the cells with antibodies against common leukocyte antigen (CD45), flow cytometry is used to measure the fluorescence intensity of...

An In Vitro Assay to Measure Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis by Phagocytes

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren subsets van precursor B-cellen uit navelstrengbloed. Een voldoende hoeveelheid en kwaliteit van nucleïnezuren kunnen worden geëxtraheerd uit de cellen en gebruikt in daaropvolgende testen gebruik DNA of RNA.

Isolatie van Precursor B-cel subsets van navelstrengbloed

Beschreven hierin is een protocol om de infiltrerende leukocyten van de decidua basalis en decidua parietalis - de menselijke moeder-foetus interface - te isoleren en verder te bestuderen. Dit protocol handhaaft de integriteit van celoppervlaktemarkeringen en levert voldoende levensvatbare cellen op voor downstream-toepassingen, zoals bewezen door flowcytometrie-analyse.

Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Technieken die een gradiëntprocedure beschrijven om exosomen te scheiden van humaan immunodeficiëntievirus (HIV) deeltjes worden beschreven. Deze procedure werd gebruikt om exosomen te isoleren van HIV-deeltjes in menselijk plasma van met HIV geïnfecteerde personen. De geïsoleerde exosomen werden geanalyseerd op cytokine/chemokine-gehalte.

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

We beschrijven een methode om de snelheid van fagosomen te meten die zich in levende cellen, geïnfecteerd met of zonder het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) type 1, naar het centrum van de cel bewegen, met behulp van spinning disk confocale fluorescentiemicroscopie om gefluorescerende geïnfecteerde cellen te identificeren en helder veld microscopie om fagosomen te detecteren.

Phagosome Migratie en Velocity Gemeten Live primaire humane macrofagen geïnfecteerd met HIV-1

Menselijk perifeer bloed wordt vaak gebruikt voor de beoordeling van de humorale immuunrespons. Hier worden de methoden beschreven voor het isoleren van menselijke B-cellen uit perifeer bloed, het differentiëren van menselijke B-cellen in antilichaam (Ab)-secreterende B-cellen (ASC's) in cultuur en het tellen van het totale aantal IgM- en IgG-ASC's via een ELISpot-assay.

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

We beschrijven een methode voor de verwerking van bronchoalveolaire spoeling vloeistof en matched perifeer bloed van chronisch HIV-geïnfecteerde individuen op antiretrovirale therapie om pulmonale HIV-reservoirs te beoordelen. Deze methoden resulteren in de verwerving van zeer zuivere CD4 T-cellen en alveolaire macrofagen die vervolgens kunnen worden gebruikt voor immunophenotypering en HIV-DNA/RNA-quantificaties door ultragevoelige polymerase-kettingreactie.

Verwerking van bronchoalveolaire lavage vloeistof en geëvenaard bloed voor alveolaar macrofaag en CD4+ T-cel Immunophenotypering en HIV-reservoir beoordeling

Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

Dit protocol beschrijft een high-throughput automatisering-compatibele methode om menselijke perifere bloed mononucleaire cellen te isoleren voor biobanking en andere doeleinden.

Het isoleren van Menselijke Perifere Bloed Mononucleaire Cellen van Buffy Coats via de Scheiding van de Hoge Doorvoer Immunomagnetische Parel

Dit protocol is ontworpen om de effectieve isolatie van extracellulaire blaasjes uit menselijke moedermelk met hoge zuiverheid te versnellen en mogelijk te maken.

Snelle isolatie van extracellulaire blaasjes afkomstig van menselijke moedermelk

Leer de isolatie van leukocyten uit menselijke moedermelk voor antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose van HIV-doelwitten. Deze methode helpt onderzoekers de fagocytische capaciteit te evalueren.

Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten (Video) | JoVE Journal

Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten

Meer video's verkennen