Een op fluorescentie gebaseerde assay voor de karakterisering en kwantificering van de vorming van lipiden druppeltjes in humane intestinale Organoïden

Dit protocol beschrijft een aantal methoden om lipide druppelvorming in menselijke darmorganoïden te kwantificeren. Het kan worden gebruikt als een high-throughput screening platform om te testen op geneesmiddelen die lipide druppelvorming moduleren. De methode die we beschrijven is gebaseerd op een lipide druppelspecifieke kleurstof en biopsie-afgeleide darmorganoïden.

Het biedt daardoor een stabiel, nauwkeurig en fysiologisch relevant model voor lipidedruppelvorming. Dit protocol kan worden gebruikt om te screenen op patiëntspecifieke kandidaat-geneesmiddelenkandidaten die de vorming van lipidedruppels moduleren, bijvoorbeeld bij DGAT1-patiënten. Deze lipide druppelvorming test kan ook worden toegepast op andere soorten organoïde culturen om lipide metabolisme studie in andere celtypes.

De test is in belangrijke mate afhankelijk van de dichtheid van de organoïde cultuur. Probeer een consistente organoïde dichtheid te garanderen tussen monsters en experimenten. Visuele demonstratie van deze test is van cruciaal belang omdat het belangrijk is om te laten zien hoe de organoïde moet worden gekweekt en hoe ze moeten worden behandeld om een goede analyse van lipide druppelvorming te garanderen.

Na het voorbereiden van de organoïden, zorgvuldig aspirate de cultuur medium zonder verstoring van de druppels van kelder membraan matrix. Voeg 500 microliters koud basaal medium toe aan de eerste put van organoïden. Met behulp van een P1000 pipet, voorzichtig pipette op en neer om de kelder membraan matrix druppels verstoren met organoïden.

Herhaal deze procedures met hetzelfde medium in de volgende goed als vereist, maar oogst niet meer dan twee putten per 500 microliter van basaal medium. Verzamel de organoïden in een laag-bindende 1,5 milliliter microcentrifuge buis, en draai ze naar beneden in een mini-tafelblad centrifuge gedurende 15 tot 20 seconden. Voeg 400 microliter trypsine toe aan de gesponnen organoïden.

Incubeer in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik vervolgens een P200 pipet om de suspensie voorzichtig op en neer te pipetten om de resterende aggregaten van cellen te verstoren. Incubeer in een waterbad bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Wanneer slechts enkele cellen overblijven, voeg een milliliter basaal medium, en spin de cellen in een mini-tafelblad centrifuge voor 15 tot 20 seconden. Aspirate de supernatant volledig. Gebruik een P200 pipet om de enkele cellen opnieuw op te schorten in 200 microliter verse hSI-EM en voeg nog eens 800 microliter hSI-EM toe.

Tel vervolgens het aantal cellen in suspensie en bereken het volume van de cellen die nodig zijn voor de uiteindelijke celdichtheid. Neem het juiste suspensievolume en pas de dichtheid aan op 750 cellen per microliter. Voeg keldermembraanmatrix toe aan de celopening in een verhouding van twee tegen één.

Voorzichtig pipette de schorsing te mengen voorzichtig om te voorkomen dat het creëren van bubbels. In een voorverwarmde kweekplaat, zaad uit drie 10-microliter druppeltjes per goed als de plaat heeft 24 putten of een vijf-microliter druppel per goed als de plaat heeft 96 putten. Plaats de plaat in een couveuse op 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide gedurende 10 tot 15 minuten om de druppels te stollen.

Ondertussen, pre-warm een passend volume van hSI-EM +Y in een waterbad op 37 graden Celsius. Voeg hierna voorzichtig de voorverwarmde hSI-EM+Y toe aan elke put van de plaat. Broed de cellen uit op 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide.

Vervang het medium na twee tot drie dagen door hSI-EM en zorg ervoor dat u het twee tot drie keer per week verfrist. Weeg eerst 0,2 gram vloeibaar oliezuur bij kamertemperatuur. Voeg 1,5 milliliter steriele PBS van kweekkwaliteit toe en verwarm het mengsel gedurende een uur tot 70 graden Celsius om ervoor te zorgen dat de vortex met tussenpozen wordt.

Weeg vervolgens 5,89 gram vetzuurvrije BSA en los het op in 33,9 milliliter PBS. Verwarm het mengsel in een waterbad op 37 graden Celsius tot de BSA volledig is opgelost. Vortex het oliezuurmengsel opnieuw om een emulsie van fijne druppels te creëren en onmiddellijk toe te voegen aan de BSA-oplossing met behulp van een glazen pipet.

Houd het mengsel op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten tot een duidelijke geelachtige oplossing blijft. Passage de organoïden zoals eerder beschreven en zaad uit de organoïde-afgeleide enkele cellen in een zwarte clear-bottom 96-put plaat. Vervang op dag zes van het kweken op hSI-EM het kweekmedium door hSI-EM met één millimolar oliezuur en BSA-conjugaat.

Incubeer de cellen gedurende 16 tot 17 uur bij 37 graden Celsius in aanwezigheid of afwezigheid van 0,1 micromolar DGAT1-remmer. Daarna, aspirate het medium zonder verstoring van de kelder membraan matrix druppels. Fixeer de organoïden door 100 microliter van vier procent neutraal gebufferd formaldehyde gedurende 30 minuten op kamertemperatuur aan de putten toe te voegen.

Verwijder de formaldehyde voorzichtig en zorgvuldig wassen van de cellen met 150 microliter PBS per put. Vlek de cellen voor lipidedruppels met 025 milligram per milliliter LD540 en DAPI in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was vervolgens de putten voorzichtig met PBS.

Voor overzichtsbeelden van hele organoïden wordt gebruik gemaakt van een 40X subjectief geschikt voor confocale fluorescerende beeldvorming. Stel de microscoop in op beeld voor DAPI en de LD540 kleurstof met behulp van de hier getoonde excitatie- en emissie-instellingen. Stel de pinhole grootte in op één luchtige eenheid voor voldoende z-as resolutie.

Om de helft van een bolvormige organoïde een z-stack op ongeveer 85 micrometer te laten zien. Met behulp van een geschikt beeldverwerkingssysteem transformeert u de z-stack van elke organoïde naar een maximale projectie door op Afbeelding, Stapels, Z Project te klikken. Stel de drempel van de maximale projectie in op een niveau waarin er geen LD540-signaal zichtbaar is in het BSA-voertuigbesturingsmonster door te klikken op Afbeelding, Aanpassen, Drempelwaarde.

Gebruik deze instellingen om elke afbeelding te thresholderen. Meet vervolgens het totale gebied van fluorescentie voor elke maximale projectie met behulp van de functie Analyseren, Deeltjes analyseren. Voor een goede analyse van lipidedruppelvorming mogen de organoïden niet te dicht worden gezaaid voorafgaand aan stimulatie met oliezuur en daaropvolgende kleuring.

Dit is vooral van belang voor de confocale en plaatlezer uitlezing, omdat overlappende organoïden kunnen interfereren met de fluorescentie. Na stimulatie met een millimolar van olie 's nachts, lipide druppelvorming kan worden gevisualiseerd met een omgekeerde helder-veld microscoop. De accumulatie van lipidedruppels verspreidt overgebracht licht, en daarom lijken de organoïden donkerder, terwijl niet-gestimuleerde organoïden een doorschijnend uiterlijk hebben.

Zodra de oliezuur-gestimuleerde organoïden zijn vastgesteld en gekleurd, kan de lipide druppelvorming worden gevisualiseerd met behulp van een confocale microscoop. Omdat de organoïden 3D-structuren zijn, is een regelmatige epifluorescente microscoop niet geschikt vanwege het out-of-focus achtergrondsignaal, dus een confocale z-stack wordt gebruikt om LDF in organoïden te karakteriseren. Kwantificering van de confocale microscopie monsters kan ook worden uitgevoerd met behulp van een fluorescerende plaatlezer genormaliseerd op de fluorescerende Hoechst signaal.

De plaatlezertest geeft een significante afname aan van het LD540-signaal in organoïde cellen die met DGAT1-remmer worden behandeld in vergelijking met onbehandelde organoïden. Kwantificering van LD-vorming in individuele cellen kan worden bereikt met behulp van een stroomcytometer. De hier getoonde gatingstrategie is voor gescheiden menselijke darmorganoïden.

Representatieve histogrammen voor zowel de SSC-A als het LD540-signaal van de laatste live celpopulatie tonen aan dat lipidedruppelvorming zal resulteren in een toename van SSC-A als gevolg van de vorming van intracellulaire lipidedruppels. Bovendien, LD540 vlekken voor lipiden die worden opgeslagen in de lipide druppeltjes, en het signaal zal ook toenemen bij de inductie van lipide druppelvorming. Als zodanig wordt lipidedruppelvorming gemeten als een verschuiving in de gemiddelde fluorescerende intensiteit van zowel SSC-A als LD540.

De meest cruciale stappen van dit protocol zijn de cultuur van menselijke darmorganoïden en de juiste golf van oliezuur aan BSA. Om meer voorwaarden tegemoet te komen, kan deze test worden geanalyseerd met behulp van een fluorescerende plaatlezer. Om het organoïde getal per put te corrigeren, werd het LD540-signaal genormaliseerd naar het DAPI-signaal.

Met deze techniek kunnen onderzoekers lipidedruppelvorming in organoïde systemen bestuderen en verschillende analysetechnieken verbeteren, zoals elektronenmicroscopie om hun bevindingen te valideren.