Middelgrote voorbereiding voor de teelt van micro-organismen onder strikt anaerobe/anoxische condities

In tegenstelling tot aërobe organismen vereisen strikt anaerobe micro-organismen de afwezigheid van zuurstof. Aangezien zuurstof alomtegenwoordig is in de lucht, is het vasthouden van zuurstofvrije omstandigheden tijdens de teelt een vereiste voor anaerobe kweek. De toegepaste techniek is een eenvoudige en goedkope methode om anoxische voorwaarden te bieden om een gemengde microbiële populatie in vloeibare cultuur te cultiveren.

Deze techniek kan ook worden toegepast voor de teelt van zuivere culturen. Voor zeer zuurstofgevoelige micro-organismen is deze procedure echter mogelijk niet van toepassing. Begin met het wegen van middelgrote ingrediënten in een geschikte kolf en los ze op met een half volume gedestilleerd water.

Voeg vervolgens milliliter REDOX-indicator toe, gevolgd door vitaminen in spoorelementoplossing. Pas de pH aan de voorschriften van het organisme en breng het eindvolume op 1 liter met gedestilleerd water. De kleur van de REDOX-indicator is afhankelijk van de pH en kan enige tijd nodig hebben om aan te passen.

Vul 120 milliliter serumkolven met 50 milliliter medium en broed ze vervolgens 20 tot 30 minuten in een waterbad van 100 graden Celsius om de oplosbaarheid van de zuurstof in de vloeibare fase te verminderen. Spoel de hoofdruimte door met stikstof. Zorg voor de juiste ruimte ventilatie bij het werken met stikstof.

Sluit de kolven met butylrubbers septa en bevestig de aluminiumdoppen. Voeg vervolgens 0,1 milliliter reducerend middel toe aan elke kolf, om het REDOX-potentieel verder te verminderen. En autoclave de flessen voor 20 minuten op 121 graden Celsius.

Bij de toepassing van dit protocol moet een autoclave worden gebruikt die gecertificeerd is voor de sterilisatie van gesloten vaten. Anders kan overdruk afkomstig van temperatuurstijging ervoor zorgen dat serumkolven exploderen. Om het entmateriaal van de anaerobe vergister te bereiden, voeg 400 milliliter gedestilleerd water toe aan een kolf en breng het aan de kook.

Koel het af tot ongeveer 30 graden Celsius terwijl permanent spoelen de hoofdruimte met stikstof. Voeg ongeveer 100 gram slib toe, afkomstig van een anaerobe vergister, om de exacte massa van het slib vast te houden voor de bepaling van de verdunning. Wissel de kopruimte van de kolf in met stikstof en sluit deze met een butylrubbereptum.

Schud de kolf 30 minuten bij 120 RPM. Laat grotere slibdeeltjes sediment, gebruik dan een spuit en canula om 5 milliliter entmateriaal te verwijderen en te injecteren in een eerder voorbereide serumkolf. Incubeer de ingeënte serumkolf op een geschikte temperatuur voor het experiment, waarbij de overdruk veroorzaakt door de temperatuurstijging ongeveer 15 tot 30 minuten na het begin van de incubatie wordt afgevoerd.

Om de productie en samenstelling van biogas tijdens de incubatietijd te evalueren, registreert u de huidige atmosferische druk en bereidt u een manometer voor om de druk in de kolf te evalueren. Schud de kolven en verwijder 1 milliliter hoofdruimtegas met behulp van de spuit en canula. Meet de waterstof- en zuurstof-, methaan- en koolstofdioxideconcentratie met behulp van gaschromatografie.

Gebruik 1 milliliter vloeistof uit de kolf om de concentraties van alle hoge vetzuren te controleren, volgens de handschriftrichtingen, en giet de kolven over druk af nadat deze op de juiste temperatuur is gezet. Dit protocol werd gebruikt om miniatuurbioreactoren te maken die anaerobe digesties uitvoeren. Tryptofaan, tyrosine, fenylalanine, vleesextract en caseïne werden toegevoegd bij 3 verschillende concentraties, en methaan productie werd gecontroleerd over een 28 dagen incubatietijd.

Methanogenen werden gevisualiseerd door het co-enzym F420 uit te stralen, een elektronendrager in methanogenese, en vertoont een blauwgroene fluorescentie met een absorptie maximum op 420 nanometer. Gelijktijdig met gasanalyse, werden de monsters geanalyseerd op vluchtige vetzuren, en fenylzuurconcentraties tijdens de incubatieperiode. Moleculaire biologische methoden die gericht zijn op de overvloed aan specifieke micro-organismen en/of samenstelling van de microbiële gemeenschap, op een bepaald punt van het experiment, kunnen worden toegepast met behulp van de beschreven procedure.