Generatie chimeric Axolotls met Mutant Haploid Ledematen door embryonale grafting

Dit protocol maakt de productie van mutagenized haploid ledematen die kunnen worden gebruikt voor genetische screening in de axolotl. Bij haploïden kan zelfs mutagenese op laag niveau verlies van functiefenotypen in cellen veroorzaken. Deze enting techniek kan ook worden gebruikt om embryonale dodelijke fenotypes te redden.

Deze methode kan worden gebruikt om regeneratie te bestuderen bij amfibiesoorten die vatbaar zijn voor in vitro bevruchting en enting. Alvorens haploïde embryo's als donor te gebruiken, raden we aan om het succes van grafts tussen GFP-positieve en negatieve diploïde embryo's te oefenen en te bevestigen. Voor vrouwelijke gamete donor voorbereiding, verdoven een seksueel volwassen witte of witte RFP vrouwelijke axolotl om te dienen als de gamete donor.

Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pijnsimulatie, gebruik een 30-meter insulinespuit om 0,15 milliliter menselijke chorionic gonadotropin in de spierstelselrug in de achterste ledemaat te injecteren. Plaats de spuit in een hoek van 45 graden naar de middellijn om contact met het ruggenmerg te voorkomen. Plaats het geïnjecteerde dier in verse 40%Holtfreter's oplossing en breng de axolotl gedurende 48 uur over naar een koelkast van acht tot 12 graden Celsius.

Breng het vrouwtje terug naar kamertemperatuur. Terwijl het vrouwtje eieren legt, plaats een volledig verdoofd mannetje in de supinepositie op vochtige papieren handdoeken onder een ontledende microscoop en plaats de punt van een P1000 pipet aan de basis van de cloaca met de dominante hand. Plaats de andere wijsvinger en duim twee tot drie centimeter rostral aan het bekken en knijp het dier terwijl u de vingers naar de achterpoten beweegt om de zaadcellen van de zaadcellen die elk monster in een nieuwe microcentrifugebuis verzamelen, uit te spoelen.

Breng vervolgens vijf microliter van elk monster over in een petrischaaltje om de kwaliteit van het sperma te inspecteren met behulp van een omgekeerde microscoop. Verdun na het tellen het sperma tot een concentratie van acht keer 10 tot de vierde cel per milliliter in 0,1X steriele MMR en breng 0,5 microliter spermacellen per ei naar een nieuw petrischaaltje. Gebruik vervolgens de pipetpunt om de ophanging te verspreiden naar een een millimeter dikke laag en gebruik een plastic lift om het monster vier centimeter van de bollen van een 254 nanometer crosslinker te plaatsen voor bestraling op acht keer 10 tot de vijfde microjoule per vierkante meter.

Na het verzamelen van een gezond spermamonster, plaats het vrouwtje in de supine positie op een stapel vochtige papieren handdoeken en gebruik een soortgelijke spoelbeweging om onbevruchte eieren uit de vrouwelijke axolotl te halen. Gebruik vervolgens natte tangen om de eieren over te brengen in een petrischaal van 10 centimeter. Gebruik binnen 15 minuten na het verzamelen een P10 pipet om het bestraalde sperma op de onbevruchte eieren te geven die elk ei met 0,25 tot 0,5 microliter geïnactiveerd sperma coaten.

Nadat de eieren 30 minuten op kamertemperatuur zijn laten zitten, overspoelt u de eieren met 0,1 X MMR. Dertig minuten na de hydratatie, gebruik scherpe tangen om de eieren dejelly en plaats de eieren op 18 graden Celsius voor microinjectie binnen zeven uur. Voor het genereren van een haploïde-diploïde chimera, plaats een gezonde haploïde donor met een of twee fase overeenkomende GFP positieve diploïde gastheer embryo's in de trog van een voorgekoelde werkschaal met chirurgisch medium op een 10 graden Celsius of lagere koeling stadium.

Gebruik twee ultra fijne autoclaved rechte tip tangen om de hele ledemaat knop en de omliggende ectoderm en mesoderm weefsel lagen te verwijderen en opzij te zetten het gastheerweefsel. Verwijder een weefselschede van gelijke grootte van de haploïde donor en plaats de haploïde donorweefselschede op het overeenkomstige gebied van het gastembryo. Bevestig het weefsel met een autoclaved rechthoekige glasscherf uit een geplette microscoop coverglass en druk het weefsel voorzichtig in het lichaam van het gastheerembryo.

Laat het anker 60 tot 75 minuten controleren om de 20 minuten om te bevestigen dat het glas niet is uitgegleden voordat u de tangen gebruikt om het coverglass-fragment af te pellen. Breng de geïngrafeerde embryo's in verse chirurgische medium waardoor ze te genezen op acht tot 12 graden Celsius 's nachts voor de huisvesting van de geënteerde embryo's individueel in 12 of 24-well platen. 38,7% van de eicellen ontwikkelde zich tot normaal ontwikkelde haploïde embryo's.

In het transplantaat vertonen haploïde embryo's een verminderde kromming langs de voorste achterste as en een onvolledige behuizing van de dooierplug. Bovendien kan een fluorescerende microscoop worden gebruikt om te bevestigen dat de haploïde embryo's vrij zijn van paternally-afgeleide GFP-expressie. Mislukte en onzuivere grafts produceren een verscheidenheid aan fenotypes.

Wanneer de grafts schoon zijn en normaal ontwikkeld, moet GFP-expressie voornamelijk worden beperkt tot de brachial plexus, het neurale netwerk dat is afgeleid van het ruggenmerg van de gastheer. Punctate GFP expressie is ook aanwezig in enkele cellen die lijken te zijn zintuiglijke neuronen in bloed-afgeleide gastheercellen die migreren naar de zich ontwikkelende ledemaat. Wanneer RFP positieve donoren worden gebruikt, vertonen haploïde graftledematen een universele expressie van RFP.

Gedurende de ontwikkeling zijn niet-gemuteerde haploidlede ledematen aanzienlijk korter dan de tegengestelde diploïde voorpoten bij chimerische dieren. Niet-mutagenized haploid ledematen volledig regenereren, hoewel ze een lichte vertraging in het bereiken van de digitale uitgroei fase in vergelijking met diploïden. Vergeet niet om steriele techniek te gebruiken en volledig te verwijderen en te vervangen de volledige mesoderm en ectoderm weefsel lagen van de embryonale gastheer om een schoon geënte ledemaat te produceren.

Mutantledematen kunnen worden geamputeerd en gescoord voor regeneratie fenotypes. Mutant allelen kunnen worden gekwantificeerd met de volgende generatie sequencing. In combinatie met CRISPR-Cas9 mutagenesis heeft onze entingstechniek ons in staat gesteld om een negatief selectiescherm van gerichte genen uit te voeren bij het regenereren van haploid ledematen.