Name: Meting van Chitinase activiteit in biologische monsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 s
Description: Leer chitinase-activiteit meten in biologische monsters zoals serum en bronchoalveolaire spoelvloeistof. Deze vereenvoudigde methode verbetert diagnostische en therapeutische monitoring van ziekten zoals Gaucher.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de American Lung Association en de American Thoracic Society Awards voor LS. Schrijvers willen oprecht Dr. Jack Elias en Dr. Chun Geun Lee bedanken voor het leveren van transgene muis stammen.

Alle dier procedures werden uitgevoerd onder een IACUC-goedgekeurd protocol aan de Yale University School of Medicine.
1. voorbeeld verzameling van muizen
<ol><li>
Esthetisering
	<ol>
<li>Anesthetiseer muizen met ketamine en xylazine (100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bloedmonster collectie
	<ol>
<li>Bevestig de diepte van de anesthesie door niet-responsiviteit op een teen knijpen.</li>
		<li>Open de borstholte chirurgisch om het hart bloot te leggen.</li>
		<li>Steek een 26,5 G naald in de linker ventrikel en verzamel bloed in een spuit. Opmerking: Meestal kan ongeveer 0,5 – 1 mL bloed worden geoogst van een gezonde 20 – 25 g muis.</li>
		<li>Verzamelen van het bloed in heparine buizen, voor plasma inzameling, of niet-gehepariniseerd buizen voor serum collectie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verzameling van bronchoalveolaire spoeling vloeistof (bal)
	<ol>
<li>Om de BAL te verzamelen, maak een verticale snede op de nek om de luchtpijp bloot te leggen.</li>
		<li>Cannulaat de luchtpijp met een 22 G katheter en bevestig het stevig met behulp van een string om lekkage uit de neus van de muis te voorkomen.</li>
		<li>Injecteer langzaam twee aliquots van steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 0,75 mL elk) in de longen via de luchtpijp en haal terug.</li>
		<li>Pool aliquots en blijf op ijs voor verdere analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De verwerking van de biologische monsters.
	<ol>
<li>Bloedmonster: ofwel vers (plasma) of na het toestaan van coagulatie voor 4 uur (serum), centrifugeer bij 600 x g gedurende 10 minuten. Neem de supernatant en ofwel bevriezen voor opslag of gebruik voor experiment.</li>
		<li>BAL: Centrifugeer het monster bij 350 x g gedurende 5 min. Neem de supernatant en ofwel bevriezen voor opslag of gebruik voor experiment.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Chitinase-test
Opmerking: De wetenschap achter de assay is relatief eenvoudig. Een niet-fluorescerende substraat wordt gespleten door enzymatisch actieve Chitinase om een fluorescerend product te produceren, dat vervolgens wordt gemeten als een indirecte marker van Chitinase activiteit. De chitinases in de monsters breken het substraat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose aanwezig in de 1x McIlvain buffer. Een fluorescerende molecuul 4-methylumbelliferyl wordt vrijgegeven. Door de totale fluorescentie van elk goed te meten, verkrijgen we een nauwkeurige meting van de actieve Chitinase in elk monster. Omdat de afbraak van chitine door Chitinase een Hydrolytische reactie is, beëindigt de stop buffer, een mengsel van 0,3 M glycine en NaOH (12,0 g/L bij pH 10,6), de afbraak van chitine door een omgeving te creëren die te eenvoudig is om het enzym te laten functioneren.
<ol><li>
Bereid de substraten, standaarden en oplossingen voor.
	<ol>
<li>De McIlvain-buffer voorbereiden. De McIlvain buffer bestaat uit 0,1 M citraat en 0,2 M fosfaat bij een pH van 5,2. Verdun met een verhouding van 1:1 voor 1x McIlvain buffer.</li>
		<li>Los zowel 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose en 4-methylumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetylchitotriose in 1x McIlvain buffer tot een concentratie van 500 μM elk. Opmerking: Stock oplossing kan bij-20 °C worden opgeslagen voor verder gebruik; beste opgeslagen in aliquots.</li>
		<li>Los standaard 4-methylumbelliferone op tot een concentratie van 0,1 mM in de stop buffer (mengsel van 0,3 M glycine en NaOH (12,0 g/L bij pH 10,6)) om de standaard curve stockoplossing te creëren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Creëer en plaat de werkoplossing.
	<ol>
<li>Combineer 1x McIlvain buffer en chitine substraat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose om de werkoplossing te creëren. Meng voor elke 10 monsters 100 μL substraat met 2,17 mL 1x McIlvain buffer. Zie tabel 1 voor aanvullende berekeningen op basis van de steekproefgrootte. Opmerking: Gebruik 4-methylumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetylchitotriose voor menselijke monsters. Hoewel beide substraten kunnen worden gecleaved door humane of muis enzymen, zijn ze toegewezen voor menselijke of muis monsters op basis van de efficiëntie van decolleté6.</li>
		<li>Pipetteer 95 μL werkoplossing in elke put van een 96-well plaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voeg biospecimen monsters toe aan de werkoplossing.
	<ol>
<li>Voeg vervolgens 5 μL van het testmonster (bloed/BAL/weefsel lysaat/andere biologische vloeistof) toe aan elk goed.</li>
		<li>Meng het monster in de werkoplossing voor de nauwkeurigste en betrouwbaarste resultaten. Opmerking: Monsters moeten worden uitgevoerd in duplicaten/triplicaten met speciale aandacht besteed aan potentiële randeffecten. Alle monsters moeten vooraf worden opgewarmd om het randeffect te minimaliseren. Aangezien de test een reactie inhoudt tussen chitinases in het monster en substraat in de werkoplossing, is het het beste om relatief snel te werken om het verschil in tijd te minimaliseren tussen wanneer het eerste monster wordt verguld en het laatste monster wordt verguld. Multikanaalspipet wordt aanbevolen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incuberen bij 37 °C.
	<ol>
<li>Dek de plaat af en schud kort (5 s).</li>
		<li>Inincuberen van de plaat bij 37 °C gedurende 15 minuten. Hierdoor kan de enzymatische reactie plaatsvinden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereid de standaard curve voor.
	<ol>
<li>Terwijl de monsters worden geïnbroed, bereid een seriële verdunning van 4-methylumbelliferone, een standaard die vaak wordt gebruikt bij de fluorimetrische bepaling van enzymactiviteit.</li>
		<li>Verdun de kolf van de standaardoplossing in de stop buffer tot een concentratie van 5 μM.</li>
		<li>Voer een reeks verdunningen uit zoals aangegeven in tabel 2. Voeg de componenten toe in de aangegeven hoeveelheid en meng goed. Opmerking: De standaard curve helpt ervoor te zorgen dat de gemeten monsters in het lineaire bereik van de standaard curve vallen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stop de reactie met stop buffer.
	<ol>
<li>Voeg aan elke put 200 μL stop buffer toe om de reactie te stoppen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plaat de normen.
	<ol>
<li>Voeg in duplicaten op dezelfde plaat 300 μL van elke norm per put toe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lees de plaat met een fluorometrische lezer.
	<ol>
<li>Lees de plaat bij een excitatie van 360 nm en een emissie van 455 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. gegevensanalyse
<ol><li>
De lege cellen aftrekken
	<ol>
<li>Gemiddelde van de waarden van de dubbele standaard verdunningen die geen 4-methylumbelliferone hebben. Deze waarde aftrekken van alle andere vastgelegde waarden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Neem het gemiddelde van de technische replicaten en plot de normen.
	<ol>
<li>Gemiddelde de twee metingen voor elke concentratie en grafiek de gemiddelde lezing door concentratie. Opmerking: De resulterende plot moet lineair uitzien en hebben een R2 waarde dicht bij 1. Als dat niet zo is, kan het nodig zijn om de normen opnieuw te maken en de plaat te herlezen om de kwaliteit van de gegevensanalyse te garanderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Standaardiseer de uitleeswaarden.
	<ol>
<li>Maak een best passende lijn voor de uitgezette Standards-gegevens. Verdeel de Lees-outs van de samples door de helling van de best passende lijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Waarden vergelijken van controlegroep en variabelengroep.
	<ol>
<li>Gebruik een t-toets of ANOVA, voor meer dan twee groepen, om te bepalen of het verschil tussen groepen statistisch significant is. De waarden zullen de eenheden nmol/mL · h nemen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinases%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li>
<li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chitotriosidase+%28chitinase+1%29+under+normal+and+disease+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Epithelial+Biology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/</a> 1-9 (2012).</li>
<li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Chitin+and+Chitinase%2FChitinase-Like+Proteins+in+Inflammation%2C+Tissue+Remodeling%2C+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li>
<li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase%3A+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li>
<li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li>
<li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+Deficiency%3A+A+Mutation+Update+in+an+African+Population%5BTitle%5D)+AND+%22JIMD+Reports%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population.</a> JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).</li>
<li>Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+CHI3L-1+and+CHIT-1+Expression+in+Differentiated+and+Polarized+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages.</a> Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).</li>
<li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701(2015).</li>
<li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Research%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li>
<li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li>
<li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Fed+Clin+Res%22%5BJournal%5D)">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623</a> 78(1945).</li>
<li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li>
<li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li>
<li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li>
<li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li>
<li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li>
<li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li>
<li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li>
<li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ukrainian+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li>
<li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease%3A+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population%5BTitle%5D)+AND+%22eJIFCC%22%5BJournal%5D)">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li>
<li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutics+and+Clinical+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li>
<li>Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li>
<li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li>
<li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li>
</ol>

Chitinase activiteit is ontstaan als een belangrijke biomarker voor het voorspellen van de ernst van de ziekte, ziekteprogressie, therapeutische effectiviteit en de aanwezigheid van specifieke pathogenen18. Hoewel veel van de lang gepostleerde theorieën over de rol van chitinases niet experimenteel zijn bewezen19, hebben nieuwe studies belangrijke inzichten gegeven in de rol van chitinasen en Chitinase zoals eiwitten in verschillende ziekten2, <...

Chitine is de op een na meest overvloedige polysaccharide op aarde na cellulose en fungeert als een belangrijke structurele component van een verscheidenheid aan organismen, waaronder het exoskelet van insecten, schimmels, gist en algen; Sommige gewervelde dieren hebben ook chitine1. Chitinases zijn een familie van enzymen die in staat zijn chitine af te breken en worden sterk geconconserd door de evolutie in soorten variërend van bacteriën tot zoogdieren2,3. Naast chitinases hebben zoogdieren ook Chitinase-achtige eiwitten die vergelijkbaar zijn met chitinases in hun vermogen om chitine te binden, maar verschillen in die zin dat ze het enzymatische vermogen missen om de chitine4te klieven.
Hoewel chitine en chitinases al lang bestudeerd zijn — met onderzoeken die dateren uit de vroege jaren 1900 — lag de nadruk op hun rol in insecten en andere ongewervelde dieren. In feite was het pas in de jaren zestig, toen gewervelde dieren in het geheel chitinases bleken te hebben. Met behulp van een op chitobiase gebaseerde assay bleken chitinases te worden gevonden in het spijsverteringskanaal van een aantal gewervelde dieren, waaronder hagedissen en Merel — een observatie veronderstelde te wijten aan het gebruik van chitine bevattende organismen zoals insecten5 .
Zoogdieren hebben twee enzymatisch actieve vormen van Chitinase: zure zoogdier Chitinase (AMCase; ook bekend als CHIT2 en CHIA) en chitotriosidase (CHIT1)4. Beide eiwitten zijn geschikt voor het hydrolyseren van chitine. Echter, CHIT1 is meer enzymatisch actief bij de mens, waar bijna alle Chitinase activiteit is afgeleid van CHIT1. 4 bij muizen dragen zowel Chit1 als amcase bijna evenveel bij aan de algehele activiteit van Chitinase6. Aan de andere kant, Chitinase-achtige eiwitten missen Chitinase activiteit.
Chit1 wordt voornamelijk uitgescheiden door macrofagen en wordt vaak beschouwd als een immuunrespons op chitine bevattende pathogenen7. Het enzym is ook betrokken bij de rijping van monocyten in zowel M1 en m2 macrofaag subtypen, zelfs zonder de aanwezigheid van het substraat chitine8. Bovendien, het kan ook worden betrokken bij de rijping van andere immuuncellen, met inbegrip van T helper type 2 (Th2) cellen en eosinofielen — zoals bleek het geval te zijn in crypto Kokken longinfectie9. Deze studies wijzen op een complexe rol van chitinases in het immuunsysteem.
In de afgelopen jaren, Chit1 niveaus zijn gevonden om te dienen als een belangrijke biomarker van progressie voor meer dan 40 verschillende ziekten van de mens, met inbegrip van lysosomale opslag ziekten, infectieziekten, ademhalingsziekten, endocrinologische ziekten, cardiovasculaire ziekten, neurologische aandoeningen, en anderen (beoordeeld10). In veel van deze ziekten, de niveaus van Chit1 zijn een sterke voorspeller van de ernst van de ziekte en therapeutische effectiviteit10.
Omdat chitinases een reputatie hebben opgebouwd als biomarker voor talrijke medische aandoeningen, waaronder de ziekte van Gaucher, zijn gereedschappen en assays ontwikkeld om het testen van de aanwezigheid van Chitinase te vergemakkelijken. Oudere methoden zijn onder meer de procedure van Schales, een protocol dat is aangepast aan een bloedglucose test en de methode met 3, 5 dinitrosalicyl zuur (DNS). Echter, deze methoden zijn vaak tijd gevoelig en technisch moeilijk11. De procedure voor beide tests vereist de reductie van anorganische oxidanten, ferricyanide in het geval van de Schales-procedure, bijvoorbeeld het produceren van een kleurverandering die alleen spectrofotometrisch kan worden gemeten. Daarnaast hebben beide tests betrekking op een verwarmings-of kook stap die zowel tijdrovend als noodzakelijk is om de kleur12,13te ontwikkelen.
Hier beschreven is een snelle en eenvoudige fluorimetrische assay om de Chitinase spiegels in zoogdier monsters14,15te bepalen. Twee van de hier gebruikte monsters omvatten serum en bronchoalveolaire spoeling vloeistoffen (bal); Chitinase activiteit is ook gemeten in moedermelk en urine monsters, en de techniek kan worden uitgevoerd in dit soort monsters, alsmede in elke andere biologische vloeistof16,17.

<table><tbody><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Standaard: veel gebruikt in fluorimetrische assays voor bepaling van enzymactiviteit</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc2</td><td>Sigma</td><td>M9763</td><td>fluorescentie chitinase substraat voor gebruik in muismonsters</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc3</td><td>Sigma</td><td>M5639</td><td>fluorescentie chitinase substraat voor gebruik in menselijke monsters</td></tr><tr><td>Citroenzuur-monohydraat</td><td></td><td></td><td>voor gebruik in McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td>voor gebruik in Stop Buffer op een concentratie van 0,3 M</td></tr><tr><td>Na2HPO4xH2O</td><td></td><td></td><td>voor gebruik in McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td></td><td>voor gebruik in Stop Buffer op een concentratie van 12 g/L</td></tr><tr><td>Vision Plate: Niet-steriele, onbehandelde zwarte 96-wellsplaat</td><td>4titude</td><td>4ti-0224</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van chitinase activiteit in biologische monsters

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Chitinasen zijn de enzymen die het aankleven van chitin. Zelfs bij afwezigheid van chitine hebben zoogdieren aanzienlijke hoeveelheden chitinases aanwezig in het lichaam, waaronder bij Baseline. De precieze rol van Chitinase is niet bekend, maar het werd verondersteld om een belangrijke rol te spelen in de spijsvertering en gastheer verdediging tegen chitin-bevattende voedsel en pathogenen, respectievelijk. Recent werk, met inbegrip van de onze, heeft een belangrijke rol getoond van Chitinase en Chitinase-achtige eiwitten in gastheer immuniteit en allergische ziekten. Belangrijk, Chitinase activiteiten dienen als belangrijke biomarkers van de ernst van de ziekte in een breed scala van ziekten, met inbegrip van type 2 ontstekingsziekten zoals astma en pulmonale fibrose. Evenzo hebben patiënten met genetische aandoeningen zoals de ziekte van Gaucher de Chitinase-niveaus significant verhoogd, die niet alleen correleren met de ernst van de ziekte, maar ook dienen als een betrouwbare biomarker voor therapeutische effectiviteit. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een eenvoudige, snelle en eenvoudige manier om Chitinase-activiteit in BAL-of serummonsters van muizen te meten en kan op grote schaal worden aangepast aan menselijke proefpersonen en andere model organismen als gevolg van de sterk geconmaelde aard van de enzymen.

De getoonde resultaten zijn afkomstig uit een studie die de Chitinase activiteit in serum en BAL monsters van wild type (C57BL/6) en Chit1 transgene muizen (op C57BL/6 achtergrond) meet die het Chit1 gen op een doxycycline-promotor overdrukken. Uit onze gegevens blijkt dat zowel serum-als BAL monsters detecteerbare Chitinase-activiteit hebben bij Baseline 698,2 ± 189,9 nmol/mL · h en 485,7 ± 114 nmol/ml · h, respectievelijk. Overexpressie van het Chit1 gen met behulp van doxycycline in drinkwater gedurende 4 weken result...

Hier gepresenteerd is een eenvoudige methode voor het meten van Chitinase activiteit in biologische vloeistoffen zoals bronchoalveolaire spoeling of serum.

Meting van Chitinase activiteit in biologische monsters

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Deze methode maakt een effectievere manier om chitinase activiteit in biologische monsters te kwantificeren. Chitinase activiteit is aangetoond dat het dienen als een goede marker voor diagnose en therapeutische werkzaamheid in tal van aandoeningen en ziekten. Eerdere methoden voor het meten van chitinase activiteit waren vaak tijdrovend en moeilijk uit te voeren, beide problemen die zijn opgelost door de test hier getoond.Deze techniek zal helpen bij het vervullen van de potentiële chitinases hebben als een diagnostische en therapeutische marker door het gemakkelijker maken om chitinase activiteit te meten;bijvoorbeeld, het kan worden gebruikt om de behandeling van de ziekte van Gaucher te controleren, omdat chitinase activiteit is aangetoond dat afneemt tijdens een effectieve behandeling. Begin met het voorbereiden van substraten, normen en oplossingen voor de test. Bereid 1x McIlvain buffer volgens het manuscript richtingen en gebruik het om chitine substraten te verdunnen tot 500 micromolar per stuk.Los 4-methylumbelliferone, de standaard, op tot een concentratie van 0,1 millimolar in stopbuffer om een standaard curve stock oplossing te creëren. Voor elke 10 monsters, meng 2,17 milliliter van 1x McIlvain buffer met 100 microliter van de chitine substraat om een werkende oplossing te creëren, dan pipette 95 microliter van de werkoplossing in elk goed van een 96-put plaat. Voeg vijf microliter van het testmonster toe aan elke put en meng het in de werkoplossing.Dek de plaat af en schud deze gedurende vijf seconden en broed de plaat vervolgens gedurende 15 minuten uit op 37 graden Celsius om de enzymatische reactie te laten plaatsvinden. Verdun ondertussen de voorraadoplossing van 4-methylumbelliferone om een vijf-micromolar werkende standaardoplossing te maken en een standaardcurve te creëren door een reeks verdunningen volgens het manuscript voor te bereiden. Begin met de concentratie van vijf micromolar en meng elke verdunning goed.Voeg na de incubatie 200 microliters stopbuffer toe aan elke put om de reactie te stoppen. Voeg 300 microliter duplicaten van elke standaard toe aan dezelfde plaat en lees de plaat vervolgens op een excitatie van 360 nanometer en een emissie van 455 nanometer. Dit protocol werd met succes gebruikt om chitinase activiteit te meten in bronchoalveolaire lavage en serumvloeistof van wild type en chitotriosidase over-uitdrukkende transgene muizen.De test bevestigt dat overexpressie van het CHIT-1 gen bij muizen resulteert in verhoogde chitinase activiteit. Een standaardcurve werd gebruikt om chitinase te bepalen op basis van fluorescentie van de monsters. Het belangrijkste om te onthouden bij de eerste poging van het protocol is om de monsters zo snel en efficiënt mogelijk toe te voegen, terwijl nog steeds grondig mengen.Wanneer u voor het eerst begint, kan het nuttig zijn om minder monsters per run te doen om nauwkeurigheid in metingen te garanderen, als gevolg van een kortere incubatietijd.

measurement-of-chitinase-activity-in-biological-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit...

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

This video demonstrates an assay to screen enzymes effective in degrading complex polysaccharides in plant biomass using insoluble chromogenic biomass or ICB. The enzymes hydrolyze ICB to release soluble dye-linked oligosaccharides, and the enzyme activity is assessed by colorimetric analysis of the reaction product.

Insoluble Chromogenic Biomass-Based Enzyme Screening: An Assay to Evaluate the Degradation Activity of Plant Biomass-Degrading Enzymes

This video demonstrates the in vitro measurement of enzyme activity for α-galactosidase A and acid α-glucosidase in samples using synthetic 4-Methylumbelliferyl substrates.

In Vitro Measurement of &alpha;-Galactosidase A and Acid &alpha;-Glucosidase Enzyme Activity

Hier presenteren we protocollen om snel enzymen te screenen en te karakteriseren op antimicrobiële activiteit. De microslide-diffusietest en de kleurstof-releasetest maken gebruik van doelbacteriële substraten voor kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie van enzymatische activiteit.

Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

We beschrijven een basisprotocol voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd op basis van het activiteitsniveau en de vereisten voor een bepaalde gezuiverde ATPase.

Meten<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase activiteit voor enzymatische Karakterisatie

Hier beschrijven we een protocol voor het chromatine immunoprecipitation van gemodificeerde histonen uit de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wordt vervolgens gebruikt voor kwantitatieve PCR te ondervragen de overvloed en lokalisatie van Histon posttranslationele modificaties in het genoom.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) van Histone modificaties van Saccharomyces cerevisiae

We beschrijven een aangepaste methode op basis van agar die is ontworpen om de antischimmeleffecten van plantaardige producten te kwantificeren. Zowel volatiele als niet-volatiele bijdragen aan de antischimmelactiviteit kunnen via dit protocol worden beoordeeld. Bovendien kan de werkzaamheid tegen schimmels worden gemeten in belangrijke ontwikkelingsstadia in één experimentele opstelling.

Meten van vluchtige en niet-vluchtige antischimmelactiviteit van Biocontrol-producten

Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de antischimmelactiviteit van peptiden en andere verbindingen, zoals antischimmelmiddelen met kleine moleculen, tegen Candida albicans. Het gebruik van optische dichtheid in plaats van het tellen van kolonievormende eenheden om groeiremming te kwantificeren, bespaart tijd en middelen.

Kwantificeren van de antischimmelactiviteit van peptiden tegen Candida albicans

In dit artikel worden gestandaardiseerde ecotoxicologische methoden gepresenteerd voor de evaluatie van biomarkers in neotropische anura-soorten. In het bijzonder beschrijft dit artikel verschillende methodologieën op verschillende schalen van ecotoxicologische evaluatie, zoals genetisch, cellulair-histologisch, biochemisch, morfologisch en individueel niveau.

Ecotoxicologische methodologieën om biomarkers op verschillende schalen te evalueren bij neotropische anura's

Leer chitinase-activiteit meten in biologische monsters zoals serum en bronchoalveolaire spoelvloeistof. Deze vereenvoudigde methode verbetert diagnostische en therapeutische monitoring van ziekten zoals Gaucher.

Meting van Chitinase activiteit in biologische monsters

Meer video's verkennen