Een Ectopic Chemokine-expressie model voor het testen van macrophage Recruitment in vivo

Het hier beschreven protocol stelt ons in staat om de functie van een chemokine en het gedrag van macrofaag in vivo te onderzoeken. De meeste bestaande experimentele modellen van cel chemotaxi's zijn gebaseerd op in vitro cel experimenten. Maar in vitro experimenten zijn soms te eenvoudig om de complexe omgeving in vivo te modelleren.

Ook kunnen ze niet vertegenwoordigen de chemoattractie vermogen in vivo. Deze methoden maken gebruik van het specifieke voordeel van zebravissen voor directe celgedragsobservatie, wat moeilijk is voor muizen. Begin met het genereren van TGFABP-10A interleukine-34 transgene constructies.

Injecteer de FABP-10A interleukine-34 constructen in één celstadium Tg(mpeg1:GFP)transgene en een wild-type visembryo's samen met de transposase MRNA. Hef en verzamel de embryo's volgens manuscriptinstructies. Bevestig ze vervolgens met 4% paraformaldehyde 's nachts bij 4 graden Celsius of gedurende twee uur bij kamertemperatuur.

Na fixatie was je de embryo's drie keer met PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt. Dehydrateer de embryo's afzonderlijk met 50% methanol in PBST, gevolgd door 100% methanol, verander vervolgens in verse 100% methanol en bewaar ze minstens 2 uur bij negatieve 20 graden Celsius. Wanneer u klaar bent voor sondehybrideisatie, rehydrateert u de embryo's afzonderlijk in 50% methanol in PBST.

Was ze vervolgens drie keer vijf minuten per wasbeurt met PBST. Verteren de embryo's met proteinase K in PBST bij kamertemperatuur. Gooi vervolgens de spijsverteringsoplossing weg en herhaal fixatie met 4%paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Na fixatie was je de embryo's twee keer met PBST gedurende 10 minuten per wasbeurt. Voer prehybridisatie uit met verwarmde hybridisatiebuffer bij 65 graden Celsius gedurende ten minste één uur. Verwarm vervolgens de interleukine-34 sonde voor op 65 graden Celsius gedurende 10 minuten.

Recycle de hybridisatiebuffer in de originele buis en voer 's nachts hybridisatie uit met de voorverwarmde sonde bij 65 graden Celsius. Op de volgende dag, was de embryo's met 50% formamide en 2X SSCT gevolgd door 2X SSCT en vervolgens 0,2X SSCT bij 65 graden Celsius. Herhaal elke was drie keer met 20 minuten per wasbeurt.

Was vervolgens de embryo's drie keer met PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt. Blokkeer de monsters met 600 milliliter blokkeerbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 400 microliter anti-digoxigenin HRP-antilichaamoplossing toe en broed de embryo's 's nachts bij vier graden Celsius uit.

Verwijder de volgende dag het antilichaam en was de embryo's zes keer met PBST gedurende 20 minuten per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt spoelt u elk monster gedurende vijf minuten af met 30 microliter 1x plus versterkingsverwijding. Incubeer de monsters in de fluorofoftoer tyramine werkoplossing gedurende vijf tot 15 minuten in het donker.

Uitbreiding van de incubatietijd tot 30 minuten als de signalen zwak zijn. Was vervolgens de embryo's met PBST drie keer gedurende 10 minuten per wasbeurt. En broed ze uit met het primaire antilichaam op vier graden Celsius 's nachts.

Op de volgende dag, was de embryo's vijf keer met PBST gedurende 30 minuten per wasbeurt, en broed ze met de secundaire antilichamen op vier graden Celsius 's nachts. Op de volgende dag, was de embryo's drie keer in PBST gedurende 10 minuten per wasbeurt, en bewaar ze in 70% glycerol in het donker op vier graden Celsius of negatieve 20 graden Celsius langer. Gebruik voorafgaand aan de beeldvorming een fluorescentiemicroscoop om de DS-rode en GFP-dubbele positieve embryo's te selecteren.

Om de vis te monteren, gebruik een metalen bad om een milliliter van 1% laag smelten agarose warmte tot boven de 90 graden Celsius. Vervolgens, afkoelen tot lichaamstemperatuur en meng in 50 microliter van 0,2% tricaine. Breng de verdoofde embryo's naar een kleine schaal gemonteerd met een cover slide op de bodem.

Verwijder het omringende water en laat langzaam de laag smeltende agarose op de embryo's vallen. Stel de positie van de vis zorgvuldig in voordat de agarose is gestold, waardoor het levergebied dicht bij de afdekplaat blijft. Zodra de agarose is gestold, zorgvuldig te bedekken met een andere laag van agarose om het te versterken.

Plaats de schotel op de confocale microscoop drager tafel, bedek de vis met de E2-oplossing met tricaine, en start beeldvorming. Om de confocale microscoop te bedienen, opent u de Zen Black 2.3-software en klikt u op lokaliseren, dan incubatie en stelt u de temperatuur in op 29 graden Celsius. Klik op het acquisitiemenu en selecteer de vereiste scanmodus en lasers in het menu slimme instellingen.

Selecteer vervolgens Z-stack en positie. Klik op het experimentele ontwerpmenu en selecteer multiblokexperiment inschakelen in het eerste blok om het voorbeeld onder lage vergroting te vinden. Schakel vervolgens over naar de hoge vergroting en laat het waargenomen gebied in het midden van het gezichtsveld.

Stel de positie en Z-stack informatie in. Selecteer vervolgens de juiste laserintensiteit, scanlagen en beeldsnelheid. Zodra alle blokken zijn ingesteld, stelt u het juiste aantal lussen in en begint u met opnemen.

Dit protocol werd gebruikt om een leverspecifieke interleukine-34 over expressieplasmid te injecteren in transgene visembryo's, die macrofagen werden aangeduid met GFP. Volledige mount fluorescentie in situ hybridisatie en immunostaining werden gebruikt om de expressie van interleukine-34 en de GFP gelabelde macrofagen te analyseren. Macrofaagcelnummers werden kwantitatief geanalyseerd in niet-geïnjecteerde en construeren geïnjecteerde embryo's lever- en staartgebied.

Live imaging werd gebruikt om direct te observeren macrofagen, gelabeld groen, die door de lever van een controle vis en migreren in de lever van een interleukine-34 over het uitdrukken van vis. De belangrijke stappen van dit protocol zijn de selectie van een geschikte transgene lijn om de cel van belang te etiketteren. En geschikt weefsel voor het beeldvorming van uw expressie van transgeen gen, evenals een geschikte observatie tijd venster.

Deze techniek kan worden toegepast om de functie van andere chemokines op het gedrag van andere cellen, zoals T-cellen en neutrofielen in vivo te bestuderen.