Name: Generatie van heterogene drugs gradiënten over kanker populaties op een Microfluïdische evolution Accelerator voor real-time observatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer hoe je de microfluïdische Evolution Accelerator gebruikt voor real-time studies van kankerdynamiek op enkel-celniveau. Deze methode maakt longitudinale monitoring van gemengde tumorpopulaties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NSF PHY-1659940.

1. fabricage van microfluïdisch apparaat
<ol><li>Genereer het gewenste microfluïdische patroon met behulp van een lay-outontwerpsoftware (Zie aanvullende materialen).</li>
	<li>Fabriceren van de photomask. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.<ol>
<li>Met behulp van een Laser schrijver, schrijf het patroon op een soda-kalk glasplaat gecoat met 100 nm CR en 500 nm van fotoresist AZ1518.</li>
		<li>Ontwikkel de fotoresist met Developer AZ300MIF voor 60 s.</li>
		<li>Etch de chroom zonder bescherming van de fotoresist met behulp van CR-7 chroom Etchant.</li>
		<li>Strip rest fotoresist met behulp van een fotoresist stripper bij 70 °c gedurende 45 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Patroon van de photoresist. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.<ol>
<li>Spin Coat HMDS op silicium wafer bij 4000 rpm voor 40 s.</li>
		<li>Spin Coat fotoresist AZ4330 op silicium wafer bij 4000 rpm voor 40 s.</li>
		<li>Zacht bakken van de silicium wafer bij 95 °C voor 60 s.</li>
		<li>Gebruik de mask aligner om UV bloot te stellen aan de silicium wafer.</li>
		<li>Ontwikkel de fotoresist met Developer AZ300MIF voor 4 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer DRIE etsen uit. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.<ol>
<li>Dry-etch de wafer patroon met de fotoresist met behulp van een silicium diep reactieve Ion etsen (drie) systeem voor 100 μm diepte.</li>
		<li>Strip de fotoresist af met aceton en plasma etch met een plasma etcher.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wafer oxidatie en silanisatie. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.<ol>
<li>Voer thermische oxidatie uit op de geëtste silicium wafer in een oven bij 1100 °C gedurende 1 uur.</li>
		<li>Wacht tot de silicium wafer afkoelen en plaats de wafer in een exsiccator met een paar druppels trichloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl-silaan (PFOTS) die in een kleine container in de buurt van de wafer zijn druipt.</li>
		<li>Pomp de druk van de exsiccator tot 0,5 ATM bij kamertemperatuur gedurende 60 min. De silicium wafer mal moet hydrofoob worden na de juiste silanisatie, die kan worden getest door het toevoegen van verschillende druppels water op de wafer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zachte lithografie. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.<ol>
<li>Meng pre-polymeer en cross-linker (van polymethylsiloxaan (PDMS) Kit) bij een 10:1 per gewichtsverhouding.</li>
		<li>Giet de gemengde pdm's om een 10 mm film in hoogte te maken op de gesilaneerde glaswol Silicon wafer Mold.</li>
		<li>Degas het resulterende PDMS-silicium wafer systeem in een exsiccator gedurende 30 min tot 1 uur.</li>
		<li>Incuberen de PDMS-silicium wafer in een incubator van 70 °C 's nachts om de PDM'S te genezen.</li>
		<li>Pel de PDMS-film, zodra de PDMS is genezen, voorzichtig van de silicium wafer.</li>
		<li>Met behulp van biopsie naalden, Punch door-gaten bij de inlaat poorten op basis van de locatie van het patroon op de PDMS en gebruik maken van een circulaire punch te snijden chips 27 mm in diameter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDMS laag binding.<ol>
<li>Warmte genezing twee stapels van 27 mm PDMS cilinders (zonder patroon), die zal worden de reservoir laag en de capping laag van het apparaat.</li>
		<li>Knip twee cirkels van 7 mm rond de inhammen op de reservoir laag en gebruik een biopsie naald om door gaten te perforeren bij de inlaat poorten op de aftop slaag.</li>
		<li>BIND drie stapels PDM'S (gedessineerde stapel, reservoir laag, capping Layer) met zuurstof plasma behandeling.</li>
		<li>Met de biopsie naald, Punch door-gaten bij de uitgangen en de middelste poort van het apparaat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van media en cellijn
<ol><li>Voorbereiden van media voor het kweken van PC3 cellijnen, met inbegrip van PC3-EMT en PC3-EPI: Meng RPMI 1640 medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1x antibioticum-antimycotic. Genereer cellijnen zoals eerder beschreven14. Opmerking: PC3 cellijnen worden gehandhaafd in de bovenstaande media in bevoficeerde incubatoren bij 37 ° c met 5% Co2. Splits cellen en subcultuur elke 3 dagen, voordat ze 100% confluency bereiken.</li>
	<li>Transfect cellijnen met cytoplasmatische-gelabelde fluorescerende markers voor betere visualisatie, zoals eerder beschreven12, zodanig dat PC3-EMT spreekt cytoplasmatische GFP en PC3-epi drukt cytoplasmatische mcherry. Merk op dat de technologie ook compatibel is met fluorescerende gelabelde cellen en brightfield Imaging van niet-gelabelde cellen.</li>
</ol>3. experimentele opstelling
<ol><li>Fabricage van metalen plaathouder<ol>
<li>Fabriceren van een plaathouder die voldoende is om gelijktijdig gas-permeabele cultuur gerechten voor parallelle experimenten te houden door verspanen of 3D-printen. Het 3D CAD-bestand ("3-well plate. FCStd ) u vinden op GitHub als referentie (https://github.com/kechihl/3-well-plate).</li>
		<li>Schroef de componenten van de houder (Figuur 2) met een schroevendraaier los. Desinfecteer de componenten via UV-blootstelling gedurende ten minste 1 uur en laat in een steriele omgeving. Opmerking: de houder is ontworpen om aanzienlijke voorwaarden te bieden voor thermisch evenwicht en ideale gassamenstellingen, met gaskanaal inlaten die de luchtstroom mogelijk maken. Meer informatie is te vinden in ons vorige werk12.</li>
		<li>Bereid tot drie gasdoorlatbare cultuur gerechten, waarvan het celkweek membraan relatief flexibel is.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellijn zaaien<ol>
<li>24 uur voor aanvang van het experiment, oogst PC3-EPI en PC3-EMT cellen door trypsinisatie voor 5 min. Voeg voorverwarmde kweekmedia toe, vervolgens Centrifugeer bij 150 x g gedurende 3 minuten en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Tel cellen van elke PC3-EPI en PC3-EMT met behulp van een hemocytometer en isoleren van een totaal van 2,5 x 104 van elk celtype voor elk gas-permeable cultuur gerecht.</li>
		<li>Meng en respendeer de twee celtypen in 2 mL cultuur media en zaai de cellen in elk van de gasdoorlatbare kweek schaal.</li>
		<li>Laat de hele plaathouder 's nachts in de incubator staan om de cellen te bevestigen.</li>
		<li>Desinfecteer de PDMS-apparaten via UV-blootstelling gedurende ten minste 1 uur en laat in een steriele omgeving.</li>
	</ol></li>
	<li>Thermische controle-eenheid en gastoevoersysteem instellen<ol>
<li>Zoals weergegeven in Figuur 3, stelt u een gastoevoersysteem in dat bestaat uit zowel co2 -als O2 -regeleenheden, een gaspomp, een gasmengkamer, een luchtbevochtiger of een bubbler, en drie afzonderlijke sets van gaskleppen en Drukmeters. Meer informatie is te vinden in ons vorige werk12.</li>
		<li>Stel de CO2 -en O2 -controle-eenheden zodanig in dat ze de mengsnelheid van het gas van de co2 -en N2 -tanks en de O2 -bron aanpassen. Als alternatief zou een gastoevoersysteem dat gas biedt onder normoxia-toestand zou werken.</li>
		<li>Zorg ervoor dat het gas dat in de mengkamer wordt gecombineerd en bevochtigd door een bubbler zodanig dat de relatieve vochtigheid wordt verhoogd tot 85% (zoals afgelezen van een relatieve vochtigheids monitor) en dat het gas leidt tot drie onafhankelijke gaskleppen met Drukmeters om Controleer en bewaak de gasstroom in de plaathouder.</li>
		<li>Plaats de volledige plaathouder in een on-stage incubatie thermische regeleenheid met aparte verwarmings subeenheden voor de deksel en de bodemplaat, met alle eenheden ingesteld op 37 °C. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.</li>
	</ol></li>
	<li>Installatie van microfluïdisch apparaat. Zie de tabel met materialen voor meer informatie.<ol>
<li>Vaststellen dat de gedetailleerde componenten van de 3-goed-plaathouder in orde zijn, zoals in Figuur 2. Elk van de drie putten zijn identiek en onafhankelijk, met een paar gaskanalen voor elke put. Elke put bezit een gas-permeable cultuur schotel houder, een PDMS chip houder, een glazen raamhouder, en een paar 35 mm glasramen. Deze componenten kunnen worden geassembleerd met behulp van de gemonteerde schroeven. Let op: de glazen ramen zorgen ervoor dat er een thermisch geïsoleerde ruimte is tussen de gasdoorlatbare kweek membraan en de put zodanig dat er geen watercondensatie optreedt als gevolg van temperatuurverschillen op de interface. Merk op dat de 3 putten onafhankelijk zijn, en 3 experimenten afzonderlijk kunnen worden gedaan.</li>
		<li>Pre-warm kweekmedium bij 37 °C en Degas in een vacuümkamer gedurende 20 min.</li>
		<li>Behandel de chips van de PDMS met behulp van een zuurstof plasma systeem voor 30 s om de hydrofiliciteit te behouden.</li>
		<li>Stel het spuitsysteem in. Laad twee spuiten langzaam met groeimedia en andere twee spuiten met gewenste reagens van belang (media, media met drug, enz.). Verbind elke afzonderlijke spuit met een 50 cm slang (0,020 "x 0.060" OD) door een 23 G doseernaald in één holle stalen pen. Steek een holle stalen pin in het andere uiteinde van de slang.</li>
		<li>Prime de slang en steek de stalen pin in elke PDMS chip door de capping laag. Vul de reservoir laag en Bevochtig het patroon van de PDMS patroon laag met media. De reservoir-laag werkt als een on-chip Bubble-Trap om te voorkomen dat luchtbellen in het microfluïdische patroon geraken.</li>
		<li>Laad een spuit van 1 mL met kweekmedia. Sluit de spuit aan op een 5 cm slang (0,020 "x 0.060" OD) door een 23 G doseernaald in één holle stalen pen. Steek een holle stalen pin in het andere uiteinde van de slang en maak de slang priem.</li>
		<li>Steek de holle stalen pin in het midden gat van de chip, waar overmatige media kunnen worden geëxtraheerd uit de chip later tijdens het chip Seal proces.</li>
		<li>Omdat elk PDMS-apparaat 4 10 mL-spuiten op een spuitpomp moet laden, laadt u 2 10 mL spuiten per chip in het voorwaartse dek. Plaats de twee andere spuiten in het opname deck van het spuitsysteem.</li>
		<li>Plaats de chip direct bovenop de gasdoorlatbare kweek membranen (met cellen die al aan de membranen zijn gehecht). Om te voorkomen dat het verankeren van micro bubbels in het microfluïdische patroon, Doseer 1 mL voorverwarmde en ontgast media in de gasdoorlatende kweek schaal van 35 mm vóór de assemblage, en zorg ervoor dat de chip het vloeistofoppervlak benadert met een Kantelhoek van 15 graden.</li>
		<li>Klem de gasdoorlatbare kweek schaal en de put in de gasdoorlatbare kweek schotel houder voor elke chip, met de PDMS-chip houder die het PDMS-apparaat naar beneden duwt.</li>
		<li>Plak een vel van een sealer bovenop het PDMS-apparaat en klem met de PDMS-chip houder om te voorkomen dat de chip uitdroogt.</li>
		<li>Stel het Media debiet rond de array in op 20 μL/h.</li>
		<li>Stel de hele plaat in de on-stage incubator op de gemotoriseerde fase van een omgekeerde Microscoop. Sluit het gastoevoersysteem aan op de gaskanalen en druk het gas-permeabele cultuur membraan tegen de geïnstalleerde PDMS-chip aan om de afdichting van het apparaat te garanderen. Houd de meter druk bij 0,2 psi (1,4 x 104 PA).</li>
		<li>Extract langzaam overmatige media in de chip met behulp van de 1-mL spuit uit het middengat. Observeer de chip onder de Microscoop tijdens het uitpakken van media en Stop vervolgens met uitpakken wanneer de chip is verzegeld. Spaan afdichting moet duidelijk zijn, omdat een deel van de cellen door de micro-structuren zou worden verpletterd.</li>
		<li>Sluit de temperatuursensor van de on-stage incubator aan op de 3-well plaat en stel deze in op 37 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. timelapse-beeldvorming met één cel
<ol><li>Stel imaging software in met behulp van een omgekeerde Microscoop voor time-lapse-beeld verwerving. Merk op dat een omgekeerde fluorescerende Microscoop met volledig gemotoriseerde x-y stage, focus knop, sluiter en filter kubussen vereist is voor een EA-experiment.</li>
	<li>Configureer software voor het verkrijgen van afbeeldingen over twee kanalen met een 10x vergroting voor elke chip met automatische beeld stiksels na één ronde autofocus. Houd er rekening mee dat automatische correctie systemen zoals perfect focus geen bevredigende beeldkwaliteit garanderen. Het is meer aanbevolen voor het genereren van een aangepaste focus oppervlak voor lange termijn beeld verwerving op basis van ofwel autofocus of handmatige focus over de chip.</li>
	<li>Maak elk uur beelden en laat het experiment draaien op de tijdschaal van weken. Bewaak de beeldkwaliteit dagelijks en werk indien nodig het scherpstel oppervlak bij.</li>
	<li>Bereid de PDMS-chip en de gasdoorlatbare kweek schaal voor op daaropvolgende immunofluorescentie analyse, zoals eerder beschreven13.</li>
</ol>5. beeldverwerking en-analyse
<ol><li>Post-experimentele verwerking<ol>
<li>Converteer afbeeldingen naar TIFF-formaat voorbeeld verwerking en metingen met behulp van Fiji/ImageJ.</li>
		<li>Comprimeer TIFF-bestanden voor eenvoudige verdere beeldverwerking.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiji/ImageJ-analyse<ol>
<li>Om cellen te identificeren, achtergrond aftrekken en deeltjes analyse uit te voeren om fluorescerende heldere vlekken te identificeren voor detectie van de cellocatie en automatische celtelling.</li>
		<li>Gebruik plugins (handmatige tracking, chemotaxis, migratie tool, Trackmate) om celmotiliteit en migratie te analyseren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li>
<li>Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analogy+between+the+evolution+of+drug+resistance+in+bacterial+communities+and+malignant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).</li>
<li>Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+penetration+of+anticancer+drugs+through+tumor+tissue%3A+a+potential+cause+of+resistance+of+solid+tumors+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).</li>
<li>Grantab, R. H., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+anticancer+drugs+through+tumour+tissue+as+a+function+of+cellular+packing+density+and+interstitial+fluid+pressure+and+its+modification+by+bortezomib%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib.</a> BMC Cancer. 12, 214(2012).</li>
<li>Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Heterogeneity+in+Drug+Concentrations+Can+Facilitate+the+Emergence+of+Resistance+to+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy.</a> PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142(2015).</li>
<li>Bogorad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microvessel+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">In vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).</li>
<li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine%3A+From+chip+to+the+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li>
<li>Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-vessel-on-a-chip+models+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery.</a> Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li>
<li>Wu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+hot+and+cold+genes+and+chemotherapy+resistance+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).</li>
<li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+and+mesenchymal+prostate+cancer+cell+population+dynamics+on+a+complex+drug+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Convergent+Science+Physical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape.</a> Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001(2017).</li>
<li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+heterogeneous+environment+and+docetaxel+gradient+in+the+emergence+of+polyploid%2C+mesenchymal+and+resistant+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).</li>
<li>Roca, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+OVOL1+and+OVOL2+induce+the+mesenchymal+to+epithelial+transition+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer.</a> PloS One. 8 (10), e76773(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trackmate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine%3A+From+chip+to+the+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li>
<li>Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flaws+and+human+harms+of+animal+experimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cambridge+Quarterly+of+Healthcare+Ethics%22%5BJournal%5D)">The flaws and human harms of animal experimentation.</a> Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).</li>
<li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li>
<li>Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+in+vitro+microvessel+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Review: in vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).</li>
<li>Zañudo, J. G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+control+of+cellular+decision-making+networks+in+the+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).</li>
<li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+population+solitary+waves+can+defeat+rings+of+funnels%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels.</a> New Journal of Physics. 19 (3), 035002(2017).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten gedeclareerd.

Conventionele celcultuur werd bijna een eeuw geleden ontwikkeld en blijft het meest gebruikte preklinische model in biomedisch onderzoek, ondanks het bewezen beperkte vermogen om klinische resultaten in kanker17te voorspellen. Diermodellen bieden de hoogste fysiologische relevantie en redelijke genetische gelijkenis met de mens, maar hebben al lang erkend aanzienlijke beperkingen te hebben in het voorspellen van menselijke resultaten18. Onder alle bestaande preklinische mod...

Kanker wordt steeds meer erkend als een complex ecosysteem dat niet alleen afhangt van de aanhoudende disregulatie van gemuleerde celpopulaties, maar ook van vitale interacties tussen kankercellen en de host-micro omgeving. In deze zin evolueert kanker op een adaptief landschap dat zich manifesteert door een combinatie van factoren, waaronder een heterogene tumor micro omgeving en overspraak met een verscheidenheid aan gastcellen, die allemaal selectieve druk leveren voor verdere genetische of epigenetische veranderingen1,2,3. In de context van solide tumoren draagt een ongelijke verdeling van chemotherapeutica en andere middelen gradiënten bij aan hun moleculaire heterogeniteit en kan een rol spelen bij de ontwikkeling van de resistentie tegen geneesmiddelen, verhoogde angiogenese tot bepaalde tumor subpopulaties, en zelfs metastase4,5,6. Conventionele in vitro 2D celkweek studies, terwijl het bezitten van grootschalige, handige experimentele capaciteit, biedt mean-veld, uniforme en vaste voorwaarden, vaak ontbreekt de precieze ruimtelijke en temporele milieucontrole nodig om echt emuleren in vivo tumor dynamiek. Er is dus behoefte aan meer representatieve ex vivo-modellen om de tumor micro te reproduceren voorafgaand aan diermodellen in de pijplijn ontwikkeling van de geneesmiddelen, zodat een betere voorspelling van kanker progressie en reacties op drugs binnen dynamische stress Landschappen. Microfluïdica is voorgesteld om de kloof tussen 2D celkweek studies en meer complexe in vivo dierstudies die mogelijk niet in staat zijn om controleerbaar kwantitatieve studies7,8,9te overbruggen.
Een ideaal in vitro systeem om de celdynamiek van kanker te karakteriseren, moet de mogelijkheid bezitten om een heterogene micro omgeving te genereren om de adaptieve cellulaire reacties die kunnen plaatsvinden in een tumor na te bootsen, en om de observatie van deze dynamiek op een resolutie met één cel. In dit artikel beschrijven we een microfluïdisch celcultuurplatform, een PDMS-gebaseerd apparaat dat de "Evolution Accelerator" (EA) wordt genoemd, dat parallelle in vitro studies van kanker celdynamica op cellulaire resolutie mogelijk maakt met real-time data-acquisitie over de loop van weken, terwijl stabiel hellingen van stress in het cultuurlandschap behouden blijft. Het ontwerp van dit platform is gebaseerd op ons vorige werk, waarin de evolutionaire dynamiek van organismen in een metaopulatie kan worden versneld10,11. Specifiek, in een groep van ruimtelijk gescheiden populaties die op een bepaald niveau interageren, bij blootstelling aan een heterogeen stress landschap, kunnen de meest geschikte soorten sneller domineren in een lokale populatie in vergelijking met die van een grote uniforme populatie. De voordelige soorten migreren vervolgens naar naburige micro habitats op zoek naar middelen en ruimte, en domineren uiteindelijk de hele bevolking. Zoals weergegeven in Figuur 1, is het patroon van de microfluïdische EA-chip samengesteld uit (i) een paar serpentine kanalen die nieuwe media circulatie bieden en vaste grenswaarden voor chemische diffusie construeren, en (II) het zeshoekige celkweek gebied dat bestaat uit 109 verbonden zeshoekige en 24 half-zeshoekige kamers in het midden, die lijken op een honingraatstructuur. De chip is 100 μm diep. Media kanalen en celcultuurregio zijn verbonden met kleine spleten (ongeveer 15 μm breed), die directe mediastroom en de resulterende shear stress in het celkweek gebied voorkomen, maar toch chemicaliën kunnen verspreiden door kleine spleten en voedingsstoffen uitwisselen, metabole afvalstoffen, enz. De aanmaak van chemische gradiënten wordt aangetoond in Figuur 1B, waarbij één media kanaal 0,1 mm fluoresceïne bevat, terwijl het andere kanaal vrij is van fluoresceïne. Cellen worden gekweekt op een gasdoorlatbaar membraan, ingekapseld door de microstructuren door de positieve rugdruk op het membraan tegen de chip. De componenten van de Apparaathouder worden geïllustreerd in Figuur 2, en de experimentele opstelling wordt geïllustreerd in Figuur 3, waar de cultuur wordt gehandhaafd op een omgekeerde Microscoop bij 37 °c, met boven 85% relatieve vochtigheid, en geconditioneerd onder normoxia-gassamenstelling.
Dit systeem biedt gedetailleerde observatie van gelokaliseerde cellulaire interacties via brightfield en fluorescerende kanalen en zorgt voor ruimtelijk opgeloste downstream testen zoals immunofluorescentie, Western Blot of massaspectrometrie. We hebben eerder gedemonstreerd als een proof-of-principe van deze microfluïdische kanker-op-chip model op de lange termijn co-cultuur van epitheliale en mesenchymale PC3 prostaatkanker cellen12 evenals de opkomst van de drug-resistentie polyploïde reus kankercellen met behulp van de epitheliale PC3 cellijn13. Terwijl we de toepassing van dit platform om te begrijpen van de spatiotemporele dynamiek van epitheliale PC3 en mesenchymale prostaatkanker cellen onder een spannings gradiënt van docetaxel presenteren, kan het microfluïdische systeem gemakkelijk worden toegepast op elke combinatie van cellijnen en middelen (d.w.z. drugs, nutriënten, zuurstof) gradiënten.

<table><tbody><tr><td>10 mL BD Luer-Lok tip syringes</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>1x anti-anti</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF</td><td>Merck KGaA</td><td>18441123163</td><td>Photoresist developer</td></tr><tr><td>AZ1518</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ1518</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>AZ4330</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ4330</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>Cr Chromium Etchant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>651826</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberg DWL 66+ laserwriter</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>DWL66+</td><td>Writing photomask</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379212</td><td>Voor verbetering van de hechting van fotoresist</td></tr><tr><td>Hollow steel pins</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1300-01</td><td>&nbsp;.025 OD.017 ID x.500 lang / type 304 WD fullhard</td></tr><tr><td>ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame</td><td>ibidi</td><td>10929</td><td>On-stage incubator&nbsp;</td></tr><tr><td>Luer-Lok 23 G dispensing needle</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Om spuiten en slangen aan te sluiten</td></tr><tr><td>Lumox dish 35</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.331</td><td>Gasdoorlatende celkweekschaal</td></tr><tr><td>Microposit Remover 1165</td><td>Dow Electronic Materials</td><td>Microposit Remover 1165</td><td>Fotoresiststripper</td></tr><tr><td>Microseal B Adhesive Sealer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td>Zelfklevende verzegelbaan</td></tr><tr><td>O-Ring (voor het afdichten van Lumox-platen)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K114</td><td>Dash Nr. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70</td></tr><tr><td>O-Ring (voor het afdichten van de glazen bodemvenster)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K74</td><td>Dash Nr. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70</td></tr><tr><td>Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System</td><td>Plasmatic Systems, Inc</td><td>Plasma-Preen</td><td>Zuurstofplasmasysteem</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Samco RIE800iPB DRIE</td><td>Samco</td><td>RIE800iPB</td><td>Diep reactief ionen etsen systeem</td></tr><tr><td>Suss MA6 mask aligner</td><td>SUSS MicroTec</td><td>MA6</td><td>Maskeraligner&nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>PDMS-elastomeer</td></tr><tr><td>TePla M4L plasma etcher</td><td>PVA TePla</td><td>M4L</td><td>Plasma-etcher</td></tr><tr><td>Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Voor het silaniseren van siliciumwafers</td></tr><tr><td>Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06419-01</td><td>Slangen voor medialevering</td></tr></tbody></table>

generatie van heterogene drugs gradiënten over kanker populaties op een microfluïdische evolution accelerator voor real-time observatie

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

Conventionele celcultuur blijft het meest gebruikte preklinische model, ondanks het bewezen beperkte vermogen om klinische resultaten bij kanker te voorspellen. Microfluïdische kanker-op-chip-modellen zijn voorgesteld om de kloof tussen de oververeenvoudigde conventionele 2D-culturen en meer gecompliceerde diermodellen te overbruggen, die een beperkt vermogen hebben om betrouwbare en reproduceerbaar kwantitatieve resultaten te produceren. Hier presenteren we een microfluïdische Cancer-on-chip-model dat belangrijke componenten van een complexe tumor micro-omgeving op een uitgebreide manier reproduceert, maar is eenvoudig genoeg om robuuste kwantitatieve beschrijvingen van de kanker dynamiek te bieden. Deze microfluïdische kanker-op-chip model, de "Evolution Accelerator," breekt een grote populatie van kankercellen in een onderling verbonden array van tumor micro-omgevingen terwijl het genereren van een heterogene chemotherapeutische stress landschap. De progressie en de evolutionaire dynamiek van kanker in reactie op de gradiënt van de drug kunnen weken in real time worden gemonitord, en talrijke downstreamexperimenten kunnen aanvullend worden uitgevoerd op de timelapse-beelden die door de loop van de experimenten zijn genomen.

Validatie van optimale celgroei op chip Een belangrijk doel van het experiment platform is het reproduceren van belangrijke componenten en interacties in een complexe tumor micro omgeving op een uitgebreide manier, maar toch eenvoudig genoeg om kwantitatieve, betrouwbare en reproduceerbaar gegevens te leveren. Dit doel kan alleen worden bereikt als we de volledige controle hebben over de fysische en biochemische omgevingsfactoren. We moeten de ongewenste factoren uitsl...

We presenteren een microfluïdische Cancer-on-chip-model, de "Evolution Accelerator"-technologie, die een controleerbaar platform biedt voor langdurige realtime kwantitatieve studies van kanker dynamiek binnen goed gedefinieerde omgevingscondities op de eencellige Niveau. Deze technologie wordt verwacht te werken als een in vitro model voor fundamenteel onderzoek of pre-klinische ontwikkeling van de drug.

Generatie van heterogene drugs gradiënten over kanker populaties op een Microfluïdische evolution Accelerator voor real-time observatie

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

Dit microfluïde kanker on-chip model dat we de evolutieversneller noemen, biedt een controleerbaar platform voor lange termijn, real-time kwantitatieve studies van kankerdynamica binnen goed gedefinieerde omgevingsomstandigheden op een enkelcellig niveau. De technologie stelt ons in staat om de evolutionaire dynamiek van kanker te onderzoeken onder een tumorachtig stresslandschap. Het verstrekken van informatie, waaronder morfologie, bevolking, beweeglijkheid, en migratie in de tijd op cellulair niveau.Met de mogelijkheid om het gedrag van gemengde tumorpopulaties onder goed gecontroleerde stressgradiënten te controleren en te monitoren, kan onze technologie een fysiologisch relevanter model voor preklinische medicijnontwikkeling presenteren. De gepresenteerde drukafdichtingsverpakkingsmethode kan ook worden geïmplementeerd in andere microfluïde systemen die een uitgekiende aanpassing van de samenstelling van het omgevingsgas en de downstream-experimentcapaciteit vereisen. De sleutels om een langdurig experiment succesvol uit te voeren is het beveiligen van een fysiek en biochemisch stabiele omgeving.Factoren zoals temperatuur, vochtigheid en gassamenstelling moeten te allen tijde

generation-heterogeneous-drug-gradients-across-cancer-populations-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een protocol voor de microfabricage van de gradiënt-genererende microfluïdische apparaat dat kan genereren ruimtelijke en temporele gradiënten in goed gedefinieerde micro-omgeving. In deze benadering kan de gradiënt-genererende microfluïdische apparaat worden gebruikt om gerichte celmigratie, embryogenese, wondgenezing, en kanker metastase te bestuderen.

Een Gradient-genererende Microfluïdische Device for Cell Biology

We presenteren de procedure voor de productie en exploitatie van een microfluïdische apparaat dat heterogene tumor micro-omgevingen...

Microfluïdische apparaat voor het herstellen van een tumor micro-omgeving<em&gt; In vitro</em

We beschrijven een hoge-doorvoer geneesmiddelgevoeligheidstest voor primaire multiple myeloomcellen. Het bestaat uit een reconstructie van de beenmergomgeving (inclusief extracellulaire matrix en stroma) in platen met meerdere putjes, en een niet-invasieve methode voor longitudinale kwantificering van celviabiliteit.

Een Organotypische High Throughput systeem voor de karakterisering van de Drug gevoeligheid van Primary Multiple Myeloma cellen

De controle van chemische en zuurstofgradienten is essentieel voor celculturen. Dit artikel beschrijft een microfluïdisch apparaat van polydimethylsiloxaan-polycarbonaat (PDMS-PC) dat in staat is om op betrouwbare wijze combinaties van chemische en zuurstofgradienten te genereren voor celmigratiestudies, die praktisch kunnen worden gebruikt in biologische laboratoria zonder geavanceerde instrumentatie.

Polydimethylsiloxaan-polycarbonaat microfluïdische apparaten voor mobiele Migration Studies Onder Perpendicular Chemical en zuurstof verlopen

Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma's. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Dit rapport beschrijft een microfluïdische chip-gebaseerde methode voor het opzetten van een eencelkweek experiment waarbij hoogrenderende koppeling en microscopische analyse van meerdere afzonderlijke cellen kunnen worden bereikt.

Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering vereist kankerbiologie nieuwe in vitro en computationele hulpmiddelen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context. We beschrijven protocollen om tumor-immuun microfluïdische co-culturen te exploiteren in 2D- en 3D-instellingen, compatibel met dynamische, multiparametrische monitoring van cellulaire functies.

Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen

Hypoxie is een kenmerk van tumormicromilieu en speelt een cruciale rol bij de progressie van kanker. Dit artikel beschrijft het fabricageproces van een hypoxische kanker-op-een-chip op basis van 3D-celprinttechnologie om een hypoxiegerelateerde pathologie van kanker samen te vatten.

3D-celgeprinte hypoxische kanker-op-een-chip voor het samenvatten van pathologische progressie van solide kanker

Leer hoe je de microfluïdische Evolution Accelerator gebruikt voor real-time studies van kankerdynamiek op enkel-celniveau. Deze methode maakt longitudinale monitoring van gemengde tumorpopulaties mogelijk.

Generatie van heterogene drugs gradiënten over kanker populaties op een Microfluïdische evolution Accelerator voor real-time observatie (Video) | JoVE Journal

Generatie van heterogene drugs gradiënten over kanker populaties op een Microfluïdische evolution Accelerator voor real-time observatie

Meer video's verkennen