Screening en identificatie van kleine peptiden gericht op fibroblast groei factor Receptor2 met behulp van een Phage display peptide Library

Vergeleken met andere methoden, dit protocol is gemakkelijker om uit te vinden nieuwe antagonisters, agonisteres, en allosterische modulatoren kwantitatief en kwalitatief zonder te weten de hydro-verdunning structuur en de vorming van het doeleiwit. Dit protocol is hoog efficiënt, gemakkelijk te hanteren, zuinig en commercieel beschikbaar. Combineer deze hoge doorvoer screening methode met ITC-analyse, de functionele kleine peptiden kunnen kwantitatief en kwalitatief worden verkregen.

Het aantonen van de procedure zal Ying Zhao en Qiang Wang, afgestudeerde studenten van ons laboratorium. Om deze procedure te beginnen, bereid een oplossing van FGFR2 in coating buffer bij een concentratie van 10 microgram per milliliter. Voeg een milliliter van de oplossing aan een 35 vierkante centimeter schotel en wervel herhaaldelijk totdat het oppervlak volledig nat is.

Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius met schudden. Giet de volgende dag de coatingoplossing af en voeg de voorbereide blokkeringsoplossing toe. Broed op vier graden Celsius gedurende ten minste een uur, gooi dan de blokkerende oplossing weg en was de plaat snel zes keer met TBST terwijl u ervoor zorgt dat de schotel niet uitdroogt.

Reconstrueer de originele faagbibliotheek in één milliliter tbst en voeg dit toe aan het gecoate gerecht. Wieg de plaat zachtjes op een shaker bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Gooi hierna de supernatant weg en was de schotel 10 keer met TBST.

Elute de gebonden faag door het toevoegen van een milliliter van 0,2 molaire glycine HCL aan de schotel en schommelen zachtjes op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Breng het eluent over in een gesteriliseerde microcentrifugebuis en neutraliseer het met 100 microliter van één kies Tris-HCL bij pH 9.1. Verwarm eerst de bereide LB- en IPTG X-Gal-platen op 37 graden Celsius gedurende ten minste een uur voor gebruik.

Bereid met pipettips met filtercartridges 100 microliter van tienvoudige verdunningen van het eluent in LB. Nadat de voorbereide E.coli-cultuur halverwege de logfase is bereikt, moet u 200 microliters van de cultuur in gesteriliseerde microcentrifugebuizen voor elke eluent verdunning. Om de infectie te starten, voeg 50 microliter van elke verdunning toe aan de buizen die de E.coli-cultuur bevatten. Vortex snel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

Gebruik vervolgens coatingsticks om de LB- en IPTG X-GAL-platen te coaten met 90 microliter van dit mengsel. Na vijf minuten, omkeren van de platen en incubeer ze 's nachts op 37 graden Celsius. Tel plaques wanneer ze verschijnen.

Om te beginnen verdun de nachtcultuur in 20 milliliter LB in een 250 milliliter Erlenmeyer-kolf. Voeg de unamplified eluent en incubeer bij 37 graden Celsius met krachtig schudden voor 4-1/2 uur. Vervolgens centrifuge de cultuur op 12,000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Breng de supernatant over op een verse buis. Centrifuge opnieuw met dezelfde omstandigheden en gooi de pellet. Breng de bovenste 80% van het supernatant over op een verse buis en voeg het toe aan het 1/6e volume van 20% polyethyleenglycol en 2,5 molaire natriumchloride.

Laat de faag 's nachts neerslaan bij vier graden Celsius. De volgende dag, centrifuge de neergeslagen faag op 12,000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Gooi de supernatant en centrifuge opnieuw met dezelfde voorwaarden.

Gebruik een pipet om de resterende supernatant te verwijderen. Resuspend de pellet in een milliliter van TBS en breng de supernatant naar een microcentrifuge buis. Centrifuge op 12.000 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Breng het supernatant over op een verse microcentrifugebuis en neerslaan opnieuw door 1/6e volume van 20% polyethyleenglycol en 2,5 molaire natriumchloride toe te voegen. Incubeer op ijs voor 15 tot 60 minuten. Vervolgens centrifugeren op 12,000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Gooi de supernatant en centrifuge opnieuw met dezelfde voorwaarden. Gebruik een pipet om de resterende supernatant te verwijderen. Resuspend de pellet in 200 microliters van TBS en centrifuge voor een extra minuut om onzuiverheden te verwijderen.

Breng vervolgens de supernatant over naar een verse microcentrifugebuis om het versterkte eluent te verkrijgen. In deze studie wordt het aantal faaginput ongewijzigd gehouden, terwijl de coatingconcentratie van FGFR2-eiwit geleidelijk wordt verminderd. De resultaten van de faagtiter suggereren dat het aantal herstelde fagen geleidelijk toeneemt en dat er na drie ronden een 65-voudige toename is ten opzichte van die van de eerste ronde.

Vervolgens wordt een ITC-experiment uitgevoerd om de affiniteit van het kleine peptide op FGFR2 te meten. De resultaten geven aan dat het SP1 peptide een hoge affiniteit heeft met FGFR2. Deze gegevens tonen de efficiëntie van het screeningprotocol aan.

Om de biologische activiteit van het SP1-peptide te onderzoeken, wordt een fibroblastproliferatietest uitgevoerd met behulp van een CCK-8-kit. BALB/C3T3 worden in verschillende concentraties geïncubeerd met het SP1 peptide. De resultaten suggereren dat de SP1 peptide onderdrukt de groei van de cellen.

De besmetting door wilde fagen moet hier worden vermeden. Zorg ervoor dat u aerosol-resistente pipet tips te gebruiken. Terwijl de groei door het verkrijgen van faagversterking.

Deze procedure kan ook worden gebruikt bij het screenen van kleine peptiden die binden aan koolhydraten, kweekcellen en weefsels. Deze peptiden kunnen verdere versterking over diagnostische en gerichte