Analyse van de Satellietcel functie tijdens de skeletspieren regeneratie door Cardiotoxine letsel en injectie van Self-leveren siRNA in vivo

Deze techniek maakt de combinatie van de intramusculaire injectie van het slangengif cardiotoxine, de intramusculaire injectie van zelfleverende siRNA, waardoor de analyse van regeneratie van skeletspieren mogelijk is. De toepassing van zelfleverend siRNA is een elegante manier om het functionele verlies van enkele genen tijdens spierregeneratie te onderzoeken, waardoor transgene dieren worden vermeden. Na bevestiging van een gebrek aan respons op teensnuifje, scheert u het injectiegebied van het schedelonderbeen van de knie tot de poot en verwijdert u het losse haar.

Plaats de muis in de supine conditie op een postpad bedekt met een steriele chirurgische doek, en gebruik 70% ethanol om het injectiegebied van het schedelonderbeen te desinfecteren. Laad vervolgens een insulinespuit uitgerust met een 29-gauge naald, met 50 microliter van 20 micromolar cardiotoxine en doorboor de huid volledig in de spier, gewoon distaal aan de knie. Wanneer de naald op zijn plaats is, injecteer het cardiotoxine over een 10-tot 20-seconden leveringsperiode over de volledige lengte van de spier, terwijl het bewegen van de naald heen en weer, om een gelijkmatige verdeling van het cardiotoxine mogelijk te maken, waardoor de gehele tibialis voorste spier wordt verwond.

Breng de muis vervolgens terug naar zijn kooi op een verwarmingskussen met bewaking tot volledige recumbency. Drie dagen na de operatie, desinfecteren het injectiegebied zoals net aangetoond. Injecteer tot 50 microliter siRNA gericht tegen het doelgen van belang in de tibialis anterieelspier van de verdoofde muis, zoals net is aangetoond.

Breng de muis vervolgens terug naar zijn kooi, met controle tot volledige recumbency. Voordat u het gewonde spierweefsel verzamelt, wikkel folie rond een potlood en verzegel het potlood met tape, zodat de onderkant van de mal een gelijkmatig, gesloten oppervlak biedt. Wanneer de mal klaar is, desinfecteren het hele dier met 70%ethanol, en gebruik extra scherpe schaar om de huid te verwijderen bij de enkel.

Gebruik voor het oogsten van de spier fijne tangen om de gesloten tangen door de fascia naast het scheenbeen bij de enkel van het gewonde been te knijpen en beweeg de tangen naar de knie om de fascia te scheuren, waardoor de voorste spier van de tibialis wordt blootlegd. Om de tibialis voorste spier te isoleren, de distale pees bloot te leggen en de pees te grijpen met fijne tangen. Gebruik de lenteschaar om de pees te snijden, en pak de spier bij de pees om de spier naar de knie te trekken.

Om de analyse van het midbelly-gebied mogelijk te maken, gebruikt u rechte scharen om de scheenspier van tibialis in het midbelly-gebied in twee helften van gelijke grootte te snijden en de potloodmal halverwege te vullen met vriesoplossing. Steek de twee helften van de scheenspier van de tibialis in de vriesvorm rechtop, met het midbelly-gebied dat naar de onderkant van de mal kijkt. Gebruik tangen om de bevriezing schimmel halverwege over te brengen in vloeibare stikstof.

Wanneer het vriesmedium verandert van transparant naar wit en stevig wordt, breng de vriesvorm over naar een vriesvriezer van 80 graden Celsius, of naar droogijs voor toekomstige verwerking. In de controlespieren blijft de architectuur van het weefsel intact, zoals waargenomen door de lokalisatie van de kernen in de periferie van de myofibers, en het gebrek aan accumulatie van mononucleeerde cellen binnen de interstitiële ruimte. Zeven dagen na cardiotoxine gemedieerde schade worden nieuwe myofibers gevormd zoals gekenmerkt door centraal gelegen kernen, en een ophoping van mononucleated cellen die voornamelijk bestaan uit satellietcellen, maar ook niet-myogene cellen zoals immuuncellen.

Onder rustomstandigheden bevinden satellietcellen zoals gemarkeerd door Pax7-kleuring in het rood, zich onder de basale lamina, hier in het groen weergegeven. Drie dagen na de verwonding neemt het aantal satellietcellen toe en bevinden de satellietcellen zich niet meer onder de basale lamina. Op dag 10 na letsel wordt het aantal satellieten nog steeds verhoogd.

Om het regeneratieproces verder te analyseren, kunnen nieuw gevormde myofibers worden bevlekt met antilichamen gericht tegen ontwikkelingsschocone. Twee dagen na injectie met siRNA kunnen satellietcellen worden geanalyseerd op de aanwezigheid van het fluorescerende siRNA. In dit representatieve experiment was ongeveer 75% van de satellietcellen in de regenererende spier positief voor het fluorescerende siRNA.

Bovendien was ongeveer 74% van alle regenererende myofibers ook positief voor het fluorescerende siRNA, wat suggereert dat ofwel 74% van de regenererende myofibers het siRNA opnam, dat siRNA-positieve satellietcellen samen waren gesmolten tot nieuwe myofibers, of dat fusie met reeds bestaande regenererende myofibers had plaatsgevonden. De meest kritieke stap is het bereiken van een volledige blessure van de scheenbeen voorste spier. Naast histologische analyse kunnen parameters zoals de gegenereerde kracht worden geregistreerd om regeneratie van skeletspieren op een functionele manier te analyseren.