Een laser Capture microdissection protocol dat hoge kwaliteit RNA oplevert van vers-bevroren muis botten

Heb je ooit nagedacht over het benutten van de kracht van laser capture microdissection voor analyse van genexpressie in specifieke botcellen binnen hun natuurlijke omgeving? Hier beschrijven we een protocol waarmee u voldoende hoeveelheden RNA van hoge kwaliteit verkrijgen uit cryosections van muisbotten. Deze technologie is een geweldig hulpmiddel voor het onderzoeken van veranderingen in genexpressie in specifieke botcellen in genetisch gemanipuleerde muismodellen of in ziektemodellen.

Het hier beschreven protocol is gericht op muizenbotten, maar kan worden gebruikt om in situ een genexpressie te bestuderen in cellen van elk hard weefsel bij elke soort. Helpen om deze procedure aan te tonen, zal Worden Christiane Schueler, een technicus van mijn laboratorium. Na het euthanaseren van muizen door exsanguinatie onder algemene anesthesie, verwijder hele femurs snel.

Gebruik een scalpel en papieren handdoeken om de femurs van de omliggende zachte weefsels schoon te maken. Giet vervolgens een optimale snijtemperatuurverbinding in de inbeddingsvorm en plaats de femurs in de bodem van de inbeddingsvormen. Snap bevriezen van de monsters in vloeibare stikstof.

Zodra de monsters volledig zijn bevroren, wikkel ze in folie en breng ze op droogijs naar een vriezer. Bewaar ze op min 80 graden Celsius tot klaar voor verdere verwerking. Stel eerst de temperatuur in de cryostat in op min 19 graden Celsius en de temperatuur van de blokhouder op min 17 graden Celsius.

Veeg vervolgens het interieur van de cryostat weg met 70% ethanol. Plaats het wegwerpblad voor harde weefsels, de glazen glijbanen en een passend gereedschap in de cryostat om af te koelen en bewaar ze in de cryostat voor de duur van de sectie. Breng het bevroren weefselblok op droogijs over naar de cryostat en laat het minstens 10 minuten equiliberen.

Druk vervolgens op de onderkant van de inbeddingsvorm om het OCT-blok uit de mal te duwen. Breng voldoende OCT-medium aan op de blokhouder om het blok eraan te hechten en wacht tot het OCT-medium volledig bevriest. Plaats hierna de blokhouder in de objecthouder en draai deze op zijn plaats.

Pas de bladpositie aan en snijd het blok in snijstappen van 15 micrometer om de LGO voor het monster te verwijderen. Pas de cryostat aan om secties van acht micrometer te genereren en snijd twee tot drie cryosections die worden weggegooid. Plaats lijmfolie op het blok en gebruik het montagegereedschap om de folie aan het blok te hechten.

Nu, maak een snede langzaam en op constante snelheid, terwijl de sectie door de film. Plaats de film met het monster naar boven op een voorgekoelde glazen schuif op de cryobar in de cryostat om ontdooiing van het monster te voorkomen. Gebruik tape om de film vast te stellen aan de glazen glijbaan voor een gemakkelijkere kleuring.

Bereid in een rookkap de nodige oplossingen voor van ethanol, RNase-vrij water en xyleen op ijs zoals beschreven in het tekstprotocol. Incubeer de secties in 95% ethanol gedurende 30 seconden. Vervolgens, zorgvuldig dompel de secties in RNase-vrij water gedurende 30 seconden om volledig te verwijderen van de OKT.

Vervolgens 50 microliters commerciële LCM bevroren sectie vlek op de sectie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 seconden. Giet het gedeelte af door de rand van de dia op absorberend tissuepapier te plaatsen. Spoel de sectie in 100% ethanol gedurende 30 seconden om overtollige vlek te verwijderen.

Dompel de botsecties onder in een tweede buis met 100% ethanol gedurende 30 seconden en breng ze vervolgens gedurende 30 seconden over naar 100%xyleen. Leg lijmfolie als ondersteuning op een droge glazen glijbaan en zorg ervoor dat de folie zo plat mogelijk wordt geplaatst. Plaats hierna een PET-membraanframe op de film en druk kort een gehandschoende vinger op het membraan om het aan de film te bevestigen.

Dit monster wordt ingeklemd tussen het membraan en de kleeffilm. De kleeffolie mag niet worden gevouwen of gerimpeld en er mogen geen luchtbellen tussen de film en het membraan zijn. Begin met het gebruik van oppervlaktedecontaminant om de houder van het podiumeind te reinigen.

Laad de schuif in de schuifhouder en de doppen in de dophouder. Pas vervolgens de focus aan en verkrijg een diaoverzicht met de doelstelling 1.25x. Verander naar de 40x doelstelling en pas de focus aan.

Kies met het diaoverzicht het interessegebied. Pas vervolgens de laserparameters aan zoals hier wordt weergegeven, zodat u deze parameters voor elke doelstelling optimaliseert. Als de laser er niet in slaagt om het monster te snijden, verhoog de laserkracht.

Selecteer osteoblast, osteocites, en bot voering cellen in distale femorale cancellous of corticale bot op basis van morfologische criteria. Teken een lijn voor het laserpad verder weg van de doelcellen om de schade door de UV-laser te minimaliseren. Als de laser er niet in slaagt om het monster te snijden, breng de laser meer dan eens of inspecteer het doel voor vlekken van onvolledige bezuinigingen en gebruik de move and cut optie om het weefsel te snijden in deze plekken.

Verzamel elk celtype in een aparte buisdop van 0,5 milliliter. Ten eerste, doe 50 microliter van de lysebuffer met bètamercaptoethanol in de dop van de opvangbuis. Lyse het monster door pippetting het op en neer in de dop voor een minuut.

Draai vervolgens het lysaat naar beneden en voeg 00 microliters toe van de lysebuffer met bèta-mercaptoethanol aan de buis. Bereid voor elke dia een gelabelde microcentrifugebuis met 350 microliter van de lysebuffer met beta mercaptoethanol. Gebruik de secties die na de LCM overblijven om RNA te extraheren.

Scheid de folie voorzichtig van het membraan en lyse het monster door de lysisbuffer langzaam meerdere keren op de sectie te spuiten. Zet vervolgens de lysate monsters op droog ijs en bewaar ze op min 80 graden Celsius. Wanneer klaar om verder te gaan, ontdooien de lysates bij kamertemperatuur.

Breng hierna de lysates van LCM-geoogste cellen in de opvangbuizen over naar nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuizen en extraher RNA volgens de instructies van de fabrikant. In deze studie wordt een LCM-protocol ontwikkeld om voldoende hoeveelheid RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen voor genexpressieanalyse in botcellen van muisvrouwlijken. LCM wordt uitgevoerd met behulp van een LCM-systeem dat zwaartekracht gebruikt voor monsterverzameling.

De opbrengst en integriteit van geïsoleerd RNA werd gemeten met behulp van microcapillaire elektroforese. Het verschil in RNA kwaliteit en kwantiteit verkregen met behulp van verschillende lyse protocollen kan hier worden gezien in de representatieve gel en elektroferogrammen. Wanneer het monster gedurende één minuut op en neer in de dop wordt gelyseerd, is het mogelijk om ongeveer 8,5 nanogram RNA te isoleren van één vierkante millimeter microdissected botweefsel.

De RIN-waarde is 8,60. Als alternatief wordt LCM uitgevoerd met behulp van een LCM-systeem dat gebruik maakt van een onscherpe laserpuls, die het materiaal katapulteert in de overhangende kleefdop. Voor verse bevroren botten is het mogelijk om ongeveer 1,6 nanogram RNA te isoleren van één vierkante millimeter microdissected botweefsel.

De RIN-waarde is één. Tot slot, de belangrijkste dingen om te onthouden in deze procedure zijn het toepassen van het permanente protocol op de juiste manier, voorkomen dat volledige uitdroging van secties in het sandwichcomplex, gebruik maken van een geschikt LCM-systeem, en niet meer dan de termijnen voor het oogsten van de cellen. Zodra u RNA van de gevangen cellen hebt geïsoleerd, u het RNA gebruiken voor expressieprofilering, bijvoorbeeld door RNA zoeken.

Tot slot willen we u eraan herinneren dat xyleen en bèta-mercaptoethanol gevaarlijke stoffen zijn die onder een kap moeten worden behandeld. Neem bovendien de juiste voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van vloeibare stikstof en ook de cryotoombladen.