Name: Het verkrijgen van gigantische Unilamellaire hybride blaasjes door elektro vorming en meting van hun mechanische eigenschappen door micropipet aspiratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer hoe je de mechanische eigenschappen van synthetische en polymeren lipidenvesicels meet met micropipetaspiratie. Deze methode beoordeelt membraanflexibiliteit en stabiliteit in biologische systemen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de ANR voor financiële steun (ANR Sysa) dankbaar.

1. fabricating micropipetten
Let op: hier zijn micropipetten met een inwendige diameter variërend van 6 tot 12 μm en een conus lengte rond 3-4 mm noodzakelijk. Een gedetailleerde methode voor het vervaardigen van micropipetten wordt hieronder beschreven.
<ol><li>Plaats het boor silicaatglas capillair in de dissel van de trekker en bevestig een van de uiteinden door de knop aan te spannen.</li>
	<li>Schuif het glas voorzichtig door de openingen aan de zijkant van de verwarmingskamer.</li>
	<li>Draai de klem knop aan de andere kant vast.</li>
	<li>Bedien de grootte van de tip en de taper-lengte om de gewenste specificaties te bereiken. Voor dat, optimaliseren van technische parameters zoals verwarmingstemperatuur, pull, snelheid, vertraging en druk. Hier is een voorbeeld van een programma dat wordt gebruikt: Serie: 550 °C Pull: 10 (bereik van de machine: 0-255 in willekeurige eenheden) Snelheid: 30 (bereik: 0-255 in willekeurige eenheden) Vertraging: 1 (bereik: 0-255 in willekeurige eenheden) Druk: 500 (sprei: 0-999 in willekeurige eenheden)</li>
	<li>Klik op PULL voor het uitvoeren van de gebeurtenissen die zijn gedefinieerd door het programma. Het capillair wordt vervolgens gescheiden in twee micropipetten, waarvan de afmetingen moeten worden aangepast met behulp van een microforge.</li>
	<li>Plaats de micro pipet in de metalen pipet houder van de microforge (Zie Figuur 1). Pas met behulp van de 10x-doelstelling de Microscoop fase en de pipet manipulator aan (verticaal en horizontaal bewegen) tot de pipetpunt dicht bij het oppervlak van de glazen kraal ligt.</li>
	<li>Druk op de voetschakelaar om de glazen kraal te smelten. Verlaag de punt en leg het in contact met de gesmolten glas kraal. Gesmolten glas zal via capillaire werking in de pipet stromen. Wacht een paar seconden tot het niveau van het gesmolten glas een bepaalde hoogte bereikt, zoals weergegeven in de insert van de Figuur 1.</li>
	<li>Stop de verwarming door de druk op de voetschakelaar te verwijderen en trek de punt snel weg met behulp van de verticale pipet manipulator om een scherpe pauze te veroorzaken.</li>
	<li>Herhaal de stappen 1,7 en 1,8 totdat de gewenste diameter is verkregen (6 tot 12 μm). Opmerking: om de nauwkeurigheid van de diameter meting te verbeteren, gebruikt u tijdens de laatste stap een 32x-doelstelling die is uitgerust met een dradenkruis.</li>
</ol>2. pipetpunten van de coating met BSA (runderserum albumine)
<ol><li>Om een 0,1 M-oplossing van glucose met 1% gew. BSA in zuiver water te bereiden.<ol>
<li>Weeg 180 mg glucose poeder, plaats in een conische buis van 15 mL polypropyleen en vul met 10 mL zuiver water.</li>
		<li>Voeg 0,1 g BSA poeder toe en schud zachtjes met behulp van een test buis hiervoor mixer tot volledige ontbinding (ongeveer 4 uur).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Neem de oplossing met een wegwerpbare Luer-spuit van 10 mL met een naald. Eenmaal gevuld, verwijder de naald en installeer een 0,22 μm acetaat cellulose filter. Vul verschillende polypropyleen micro-centrifugebuizen (1,5 mL) die gebruikt zullen worden om de tip onder te dompelen.</li>
	<li>Plaats de capillairen verticaal in de houders. Verlaag de houder en dompel de tip 's nachts onder in de glucose/BSA-oplossing. De oplossing moet ongeveer 1 cm hoog stijgen door capillaire werking.</li>
	<li>Verwijder de pipetpunt uit de glucose/BSA-oplossing. Bereid 5 mL van 0,1 M glucoseoplossing (Verdun 90 mg glucose poeder in 5 mL zuiver water) en filtreer door een 0,22 μm acetaat cellulose filter.</li>
	<li>Vul de pipet met de glucoseoplossing met behulp van een glazen spuit van 500 μL, uitgerust met een flexibel gesmolten silica capillair. Verwijder vervolgens alle glucoseoplossing door het terug te zuigen en weg te gooien (Figuur 2). Herhaal deze stap meerdere malen om de onbegrensde BSA te verwijderen.</li>
</ol>3. vorming van Guv's en Ghuv's door elektro vorming
Let op: elektro vorming is een veelgebruikte TECHNIC ontwikkeld door ANGELOVA9. De procedures voor het verkrijgen van een electroformation kamer, het storten van een lipide of polymeer film (of beide voor GHUVs (gigantische hybride Unilamellar blaasjes)) en hydrateren de film onder een alternatief elektrisch veld worden beschreven in het volgende. De procedure voor het verzamelen van de verkregen GUV wordt ook beschreven.
<ol><li>Voorbereiding van Amfifiel, sucrose en glucoseoplossingen<ol>
<li>Bereid een amfifiele oplossing met een concentratie van 1 mg/ml. Weeg 10 mg amfifiele af en los op in 10 ml chloroform. Bewaar de oplossing in verzegelde flacons om oplosmiddel verdamping te voorkomen.</li>
		<li>Bereid een stamoplossing van 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-foshoethanolamine-N-(lissamine Rhodamine B sulfonyl) (dope-Rhod) bij 1 mg/ml in chloroform.</li>
		<li>Voeg 10 μL fluorescerende lipide-oplossing toe aan de amfifiele oplossing. Bewaar de oplossingen in verzegelde flacons om oplosmiddel verdamping te voorkomen.</li>
		<li>Bereid sucrose-en glucoseoplossingen met een concentratie van 0,1 M. weeg respectievelijk 342 mg en 180 mg sucrose en glucose af en los ze op in 10 mL zuiver water.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiding van de elektro vormings kamer Opmerking: verschillende geleidende materialen kunnen worden gebruikt om een elektrovormings apparaat te maken (bijv. platina draden10, roestvrij naalden11). De electroformation kamer bestaat uit twee ITO-glijbanen gescheiden door een O-ring rubberen afstandhouder die aan de ene kant is gesneden om een diafragma te creëren. De dia's zijn via twee elektrische draden met een spannings Generator verbonden (Figuur 3 en Figuur 4a).<ol>
<li>Reinig de ITO-slides met organisch oplosmiddel (bijv. chloroform). Identificeer het geleidende oppervlak met behulp van een ohmmeter.</li>
		<li>Bevestig de elektrische draden aan de geleidende kant met behulp van plakband.</li>
		<li>Afzetting van amfifiele oplossingen<ol>
<li>Dompel een capillair in de oplossing tot het niveau toeneemt door capillaire werking en verzamel ongeveer 5 μL van de oplossing.</li>
			<li>Plaats het capillair in contact met het midden van de ITO-glasplaat en verdeel de oplossing zachtjes. Wacht 10 seconden om een volledige verdamping van het oplosmiddel te garanderen (Figuur 4A).</li>
			<li>Herhaal deze procedure 3 keer voor elke zijde.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voeg aan beide zijden van de geopende O-ring spacer een laagje silicium vrij vet toe. Zet het rond het gebied van depositie. Plaats het geleidende vlak van de tweede ITO-glasplaat op de bovenkant van de afstandhouder.</li>
		<li>Plaats de electrovormings kamer onder vacuüm gedurende 3 uur om eventuele sporen van organisch oplosmiddel te verwijderen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektrovormings procedure<ol>
<li>Sluit de elektrische draden aan op de generator.</li>
		<li>Gebruik de volgende instellingen voor de generator: Alternatieve sinusoïdale spanning Frequentie: 10 Hz Amplitude: 2 VPeak-to-Peak Opmerking: voor elk systeem moet een optimale spannings frequentie en-duur worden gevonden.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de spanning wordt toegepast vóór de injectie van de oplossing in de kamer.</li>
		<li>Injecteer 1 mL oplossing met behulp van een injectiespuit met een naald van 0,8 mm met binnendiameter om de kamer te vullen. Verwijder eventuele bubbels.</li>
		<li>Laat de kamer onder de toegepaste spanning/frequentie voor 75 min (Figuur 4B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>GUVs oogst<ol>
<li>Schakel de generator uit.</li>
		<li>Gebruik 1 mL spuit met 0,8 mm binnendiameter naald, zuig een klein deel van de oplossing om een luchtbel in de kamer te produceren. Kantel de kamer lichtjes om deze bubble in de kamer te laten bewegen. Dit kan helpen om de Guv's los te maken van het ITO-oppervlak (Figuur 4C).</li>
		<li>Zuig alle oplossing en breng het over in een plastic buis van 1 mL.</li>
		<li>Verwijder de draden en reinig de ITO-dia's met organische oplosmiddelen (tolueen dan chloroform).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. instellen van Micro manipulatie
Opmerking: het principe van micropipet aspiratie is het zuigen van een enkel blaasje door een glazen micro pipet door het toepassen van een depressie. De lengte van de tong in de pipet wordt gemeten als een functie van de aanzuigdruk. De pipet coating met BSA, eerder beschreven, is essentieel om elke hechting tussen blaasjes membranen en de pipet te voorkomen of te minimaliseren.
Het protocol wordt hieronder geïllustreerd.
<ol><li>Pipet en water gevulde reservoir aansluiting Opmerking: de water gevulde tank en de micrometer zijn bevestigd aan een Schuifplaat. Een digitale teller met een micrometer kop maakt een verticale verplaatsing van het apparaat mogelijk in een bereik van 0 tot 2,5 cm en een nauwkeurigheid van 1 μm. verplaatsing langs een aluminium optische Rail is mogelijk tot 1 meter lang. Een silicium slang verbindt het reservoir en de capillaire houder (Figuur 5A).<ol>
<li>Vul de tank met zuiver water. Sluit een wegwerpspuit van 5 ml aan op de capillaire metalen houder via een Siliconen slang en aspiraat om een waterstroom van de tank naar de houder te maken.</li>
		<li>Raak de buis iets aan om luchtbellen te elimineren. Breng tegelijkertijd het waterreservoir omhoog om een positieve druk te creëren. De 5 mL spuit is nog steeds aan de houder bevestigd.</li>
		<li>Na de coating en reinigingsstappen die eerder zijn beschreven (zie stap 2), vult u een capillair met glucose-oplossing tot een druppel vorm aan het einde. Verwijder de slang van de metalen houder om aan het uiteinde een lichte waterstroom te creëren.</li>
		<li>Draai het capillair ondersteboven en verbind de glucose druppel met de waterstroom van de houder. Bevestig het capillair en de houder door ze samen te schroeven.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats een pipet Opmerking: tijdens deze operatie is het waterreservoir nog steeds gepositioneerd op de aluminium rail om een positieve druk te behouden.<ol>
<li>Neem de zelfgemaakte aluminium podium uitgerust met twee glazen glijbanen (voorheen gereinigd met ethanol) en lijm ze met vacuüm vet aan elke kant. Installeer het op de Microscoop en vorm een meniscus tussen de twee dia's met behulp van een 1 mL spuit die 0,1 M glucose bevat, zoals afgebeeld in Figuur 5B, C.</li>
		<li>Plaats de pipet en de houder ervan op de motoreenheid van de micro manipulator en draai de klem knop aan.</li>
		<li>Gebruik de joystick van het bedieningspaneel in grove modus om de micropipet in de buurt van de glucose meniscus te verlagen. Pas de positie van de punt aan het midden van de meniscus aan met behulp van de fijnmodus.</li>
		<li>Houd de punt gedurende enkele minuten ondergedompeld in glucose om het buitenste en binnenste oppervlak te reinigen (als een positieve druk wordt gehandhaafd, zal de waterstroom het binnenste oppervlak van de pipet afspoelen om ongecoate BSA te verwijderen).</li>
		<li>Bewaar de positie van de tip op het micromanipulator toetsenbord en trek het uit de meniscus.</li>
		<li>Verwijder de glucose meniscus en vervang deze door een nieuwe. Zuig 2 μL Guv's op in 0,1 M sucrose met behulp van een micro Pipet van 20 μL en zet het in de verse glucose meniscus. Observeer in DIC-modus (differentieel interferentie contrast) de Guv's die zich onderaan bevinden vanwege het verschil in dichtheid tussen sucrose (voornamelijk in de Guv's) en glucose (voornamelijk buiten de Guv's).</li>
		<li>Wanneer de blaasjes licht leeg zijn, plaatst u de zuig pipet terug en concentreert u zich op de punt. Stel de hoogte H0 in van de watertank waarvan de druk bijna 0 is. Profiteer hiervoor van kleine blaasjes of deeltjes die van nature in de oplossing aanwezig zijn en pas de hoogte van het waterreservoir aan totdat de beweging van deze deeltjes is gestopt.</li>
		<li>Op dit punt, omringen de meniscus met minerale olie om te voorkomen dat Waterverdamping, Zie Figuur 5D. Opmerking: de kamertemperatuur moet worden geregeld tussen 20-22 °C met behulp van airconditioning.</li>
	</ol></li>
	<li>Micropipet aspiratie-experiment<ol>
<li>Verlaag de pipetpunt (6-12 μm in diameter) en maak een kleine zuigkracht (-1 cm) om een blaasje (15-30 μm in diameter) aan te zuigen. Het membraan van het geselecteerde vesikel moet lichtjes schommelen en mag geen zichtbare gebreken vertonen (geen kiem of filament) (Figuur 6).</li>
		<li>Til de pipet naar een hoger niveau om het aanzuig blaasje van de andere blaasjes te isoleren, door de micromanipulator te gebruiken en deze positie tijdens het hele experiment te behouden.</li>
		<li>Pre-stress het blaasje door het verlagen van de water gevulde tank tot ongeveer-10 cm, dan verlagen de druk om terug te keren naar de initiële waarde (-1 cm). Herhaal deze stap meerdere malen om membraan overmaat en kleine defecten uit het membraan te verwijderen.</li>
		<li>Vanaf een hoogte van-0,5 cm, gedefinieerd door de positie van het waterreservoir, verlaagt u langzaam de zuigdruk met de micrometer om een regime te bereiken waarin het membraan fluctueert. Verhoog vervolgens de druk om een tong in de tip duidelijk te visualiseren met een significante projectie lengte (een paar micron). Opmerking: de laagste toegepaste druk (P0) waarmee de kleinste membraan projectie lengte kan worden opzuigen (L0) zal het referentiepunt α0 (Figuur 7A) definiëren. Alle punten van de curve worden gemeten volgens deze referentie (ΔL = L-L0 en Δp = P-p0).</li>
		<li>Verhoog de aanzuigdruk met de micrometer op een stapsgewijze manier tot 0,5-0,8 mN/m bereikt wordt. Wacht bij elke stap 5 sec. en neem een momentopname van de tong. Deze procedure bij lage spanning maakt de bepaling van de buig modulus mogelijk.</li>
		<li>Blijf de zuigdruk verhogen van 0,5 mN/m naar de breuk spanning door het aanpassen van de hoogte van het water dat op de Rail glijdt (variërend van-2 tot-50 cm) (Figuur 7B-D). Van dit experiment met een hoge spanningsregeling wordt het gebied comprimeerbare modulus, lysisspanning en lysisstam gemeten.</li>
		<li>Strek ongeveer 15-20 blaasjes om belangrijke statistieken te verwerven. Elk micropipet aspiratie-experiment duurt tussen de 7 en 10 minuten. Voer beeldanalyse uit met behulp van de LASAF-software voor het meten van de projectie lengte van de tong, de diameter van de blaasjes en de straal van het capillair.</li>
	</ol></li>
	<li>Meten van buig modulus, gebied compressibiliteit modulus, lysisspanning en lysisstam<ol>
<li>Om toegang te krijgen tot deze parameters, gebruik maken van het formalisme opgericht door E. Evans12. Bereken de aanzuigdruk die over het membraan wordt uitgeoefend vanaf vergelijking 1: Δ P =US wg (h − H0) (1) waar g de zwaartekrachtversnelling is (9,8 m ∙ s− 2), is pw de dichtheid van het water (p = 1 g ∙ cm− 3), h is de positie van het waterreservoir en h0 is de beginpositie waar de druk gelijk is aan nul.</li>
		<li>Bereken de membraanspanning van de Laplace-vergelijking: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq1.jpg">2 Wanneer δp de aanzuigdruk op de micro Pipet is, zijn rp en rv respectievelijk de micro pipet en de blaasje radii (buiten de micro pipet). De stam van het oppervlaktegebied (α) van het membraan wordt gedefinieerd als: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq2.jpg">3 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq3.jpg">het membraan gebied van de blaasje bij de lagere aanzuigdruk.</li>
		<li>Bereken α van de toename van de projectie lengte ΔL van het vesikel in de capillaire punt volgens vergelijking 412: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq4.jpg">4</li>
		<li>Onder een zeer laag spannings regime domineert het verzachten van thermische buig-uitvloeiingen de schijnbare expansie. Plot ln (σ) versus α. Bij lage-σ waarden (meestal 0,001 – 0,5 mN. m− 113) geeft dit een rechte lijn waarvan de helling gekoppeld is aan de buig modulus, Kb (eerste termijn van de vergelijking 5)14: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq5.jpg">5 Let op: onder hoge spanningen (> 0,5 mN. m− 1), membraan-golvende worden volledig onderdrukt en membraan gebied toeneemt als gevolg van de toegenomen afstand tussen moleculen. In dit regime domineert de tweede term van vergelijking 5 en geeft hij toegang tot het gebied Comprimeer baarheid modulus Ka (Figuur 8 en Figuur 9).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li>
<li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li>
<li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+vesicles+from+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li>
<li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+polymer%2Flipid+vesicles%3A+state+of+the+art+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li>
<li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+Hybrid+Lipid%2FPolymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li>
<li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+De+Physique%22%5BJournal%5D)">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li>
<li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li>
<li>Rodríguez-García, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions+of+the+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+A%3A+Physicochemical+and+Engineering+Aspects%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li>
<li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+omega%22%5BJournal%5D)">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li>
<li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer%2Flipid+hybrid+unilamellar+vesicles+%28GHUVs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li>
<li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+properties+of+lipid+bilayers%3A+theory+and+possible+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+%28GHUVs%29+does+not+systematically+lead+to+%26%2334%3Bintermediate%27%27+membrane+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li>
<li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L%CE%B1+and+L%CE%B1-Gel+Coexistence+Regimes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li>
<li>Longo, M. L., Ly, H. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLongo%2C+ML+%22Methods+in+Membrane+Lipids%22">Methods in Membrane Lipids</a>. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).</li>
<li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles%3A+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae%2C+but+with+mechanical+stability+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li>
<li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li>
<li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+behavior+of+membranes+with+sterols%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li>
<li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity%2C+Stability%2C+and+Area%2FMolecule%3A%E2%80%89+A+Micropipet+Aspiration+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:  A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li>
<li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De coating van de micro Pipet is een van de belangrijkste punten voor het verkrijgen van betrouwbare metingen. Hechting van het blaasje aan de micro pipet moet worden voorkomen, en een coating wordt vaak gebruikt in de literatuur17,18,19,20,21, met BSA, β-caseïne of surfasil. Details van de coating procedure worden zelden genoemd.
H...

Reuzen blaasjes verkregen uit fosfolipiden (liposomen) zijn op grote schaal gebruikt sinds de jaren 1970 als basis celmembraan model1. In de late jaren negentig, vesiculaire morfologieën verkregen uit de zelf-assemblage van copolymeren, genaamd polymersomes in verwijzing naar hun lipide analogen2,3, snel verscheen als een interessant alternatief voor liposomen die zwakke mechanische stabiliteit en slechte modulaire chemische functionaliteit bezitten. Echter, hun cel biomimetische karakter is vrij beperkt in vergelijking met liposomen, omdat de laatste zijn samengesteld uit fosfolipiden, de belangrijkste component van de celmembraan. Bovendien, hun lage membraan permeabiliteit kan een probleem in sommige toepassingen zoals drug delivery waar gecontroleerde verspreiding van soorten door het membraan is vereist. Onlangs, de vereniging van fosfolipiden met blok copolymeren voor het ontwerpen van hybride polymeer-lipide blaasjes en membranen is het onderwerp geweest van een toenemend aantal studies4,5. Het belangrijkste idee is om entiteiten te ontwerpen die synergetisch de voordelen van elk onderdeel combineren (bio-functionaliteit en permeabiliteit van lipide-bilayers met de mechanische stabiliteit en chemische veelzijdigheid van polymeer membranen), die kunnen worden uitgebuit in verschillende toepassingen: gecontroleerde en gerichte drug delivery, biomoleculaire erkenning binnen biosensoren voor diagnose, functionele membranen voor kunstmatige cellen, ontwikkeling van bio-geïnspireerde micro-/nano-reactors.
Tegenwoordig hebben verschillende wetenschappelijke gemeenschappen (biochemici, chemici, biophysicisten, fysico-chemici, biologen) steeds meer belangstelling voor de ontwikkeling van een geavanceerder celmembraan model. Hier, ons doel is om te presenteren, zo gedetailleerd mogelijk, bestaande methodologieën (elektro vorming, micropipet aspiratie) om te verkrijgen en karakteriseren van de mechanische eigenschappen van gigantische blaasjes en de recente "geavanceerde" celmembraan modellen die hybride polymeer lipide reus blaasjes4,5.
Het doel van deze methoden is om betrouwbare meting van het gebied Comprimeer baarheid en buig moduli van het membraan, evenals hun lysis stress en spanning te verkrijgen. Een van de meest gebruikte technieken voor het meten van buigstijfheid van een reusachtig blaasje is fluctuatie analyse6,7, gebaseerd op directe video-Microscoop observatie; maar dit vereist een grote zichtbare membraan fluctuatie, en wordt niet systematisch verkregen op dikke membranen (bv. polymersomes). Area samendrukbaarheids modulus kan experimenteel worden bepaald met behulp van de Langmuir Blodgett techniek, maar meestal op een monolaag8. De micropipet aspiratie techniek maakt de meting van beide moduli op een dubbellaagvormende reus unilamellaire blaasje (guv) in één experiment mogelijk.
De volgende methode is geschikt voor alle amfifiele moleculen of macromoleculen die bilayers kunnen vormen en, bijgevolg, blaasjes door elektro vorming. Dit vereist een vloeiend karakter van de dubbellaagte bij de temperatuur van elektro vorming.

<table><tbody><tr><td>Vereiste apparatuur en materialen voor micropipettontwerp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boorsilicaatglas capillairen</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td>externe en interne diameter van respectievelijk 1 mm en 0,58 mm.</td></tr><tr><td>Geïnstalleerd filament</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>FB255B</td><td>2,5 mm * 2,5 mm Box Filament</td></tr><tr><td>Vlam/Brown Micropipettontrekker</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>NARISHGE Co.</td><td>MF-900</td><td>uitgerust met twee objectieven (10x en 32x)</td></tr><tr><td>Materialen voor het coaten van pipettips met BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine Fractie V (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>Draaiknopoplossing 1 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>Draaiknopoplossing 10 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>626616</td><td></td></tr><tr><td>Draaiknopoplossing 5 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td></td></tr><tr><td>Acetaatcellulose filter</td><td>Cluzeau Info Labo</td><td>L5003SPA</td><td>Poriegrootte: 0,22&micro;m, diameter: 25 mm</td></tr><tr><td>Flexibele versmolten silica capillaire buis</td><td>Polymicro Technologies.</td><td>TSP530660</td><td>Binnendiameter 536&micro;m, buitendiameter 660&micro;m,</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Spuit 500 &micro;L luer Lock GASTIGHT</td><td>Hamilton Syringe Company</td><td>1750</td><td></td></tr><tr><td>Roterende menger voor testbuisjes</td><td>Labinco</td><td>28210109</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulatie opstelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminium optisch spoor, 1000 mm lengte, M4 schroefdraad, X48-serie</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gedempte optische tafel</td><td>Newport</td><td></td><td>gebruikt als ondersteuning van microscoop om externe trillingen te voorkomen.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP 2</td><td>De module-eenheid (motoreenheid voor X, Y en Z beweging) is op de omgekeerde microscoop gemonteerd door middel van een adapter.</td></tr><tr><td>Micrometer</td><td>Mitutoyo Corporation</td><td>350-354-10</td><td>Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Bereik 0,001 mm</td></tr><tr><td>Plexiglas waterreservoir (100 ml)</td><td>Zelfgemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 omgekeerde confocale microscoop (DMI6000) uitgerust met een resonante scanner en een waterdompelingobjectief (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X48 Rail Carrier 80 mm lengte, met 1/4-20, 8-32 en 4-40 draad</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materialen voor sucrose en amfifiele oplossingsvoorbereiding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank">2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine</a></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>22711.244</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-Fosfatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810146C</td><td>Rhodamine-gelabeld lipide</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Electroformatie opstelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;L glazen capillaire ringkappen</td><td>Hirschmann</td><td>9600110</td><td></td></tr><tr><td>Draaiknopoplossing 1 ml Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>H Vet</td><td>Apiezon</td><td>Apiezon H Vet</td><td>Silicon-vrij vet</td></tr><tr><td>Indium tin oxide gecoate glazen platen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>703184</td><td></td></tr><tr><td>Naald</td><td>Terumo</td><td>AN2138R1</td><td>0,8 x 38 mm</td></tr><tr><td>Ohmmeter (Multimeter)</td><td>Voltcraft</td><td>VC140</td><td></td></tr><tr><td>Tolueen</td><td>VWR</td><td>28676.297</td><td></td></tr><tr><td>Spanningsgenerator</td><td>Keysight</td><td>33210A</td><td></td></tr></tbody></table>

het verkrijgen van gigantische unilamellaire hybride blaasjes door elektro vorming en meting van hun mechanische eigenschappen door micropipet aspiratie

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Reuzen blaasjes verkregen uit fosfolipiden en copolymeren kunnen worden uitgebuit in verschillende toepassingen: gecontroleerde en gerichte levering van geneesmiddelen, biomoleculaire herkenning binnen biosensoren voor diagnose, functionele membranen voor kunstmatige cellen, en ontwikkeling van biogeïnspireerde micro/nano-reactoren. In al deze toepassingen is de karakterisering van hun membraan eigenschappen van fundamenteel belang. Onder bestaande karakterisatie technieken, micropipet aspiratie, gepionierd door E. Evans, maakt het mogelijk om mechanische eigenschappen van het membraan te meten, zoals het gebied comprimeerbare modulus, buig modulus en Lysis stress en stam. Hier presenteren we alle methodologieën en gedetailleerde procedures om gigantische blaasjes te verkrijgen van de dunne film van een lipide of copolymeer (of beide), de fabricage-en oppervlaktebehandeling van micropipetten, en de aspiratie procedure die leidt tot de meting van alle eerder genoemde parameters.

Met het bovengenoemde protocol hebben we verschillende synthetische reus unilamellaire blaasje (guv) bestudeerd, verkregen uit een fosfolipide: 2-oleoyl-1-Palmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (popc), een triblock copolymeer: poly (ethyleeneoxide)-b-poly (dimethylsiloxaan)-b-poly (ethyleeneoxide) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) gesynthetiseerd in een eerdere studie13, en een diblock copolymeer pol...

Het doel van het protocol is om de mechanische eigenschappen van de membraan van gigantische blaasjes betrouwbaar te meten met micro pipet aspiratie.

Het verkrijgen van gigantische Unilamellaire hybride blaasjes door elektro vorming en meting van hun mechanische eigenschappen door micropipet aspiratie

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Dit protocol vergemakkelijkt een betrouwbare meting van de mechanische mechanische eigenschappen van synthetische en echte polymeerlipvezel met behulp van een micropipet aspiratietechniek. Dit is de enige techniek die het mogelijk maakt membraanflexibiliteit en instabiliteit te worden uitgerekt om te worden beoordeeld in enkele experimenten. Dit protocol omvat een reeks procedures, van vesicle voorbereiding tot de mechanische beoordeling.Het is erg belangrijk om geduldig te zijn en technische problemen op te lossen wanneer ze zich voordoen. Visualisatie op deze technieken is van cruciaal belang om te begrijpen hoe het capillaire oppervlak goed te behandelen en hoe de verplichte prestress stap uit te voeren. Het tonen van de blaas zonder gebreken.Demonstrerende procedure is Martin Fauquignon, een promovendus uit het laboratorium die werkt aan de ontwikkeling van hybride polymeerlipide vesicles. Voordat u met de procedure begint, plaatst u koudglas micropipet haarvaten verticaal in houders. En verlaag de houders tot de tips worden ondergedompeld in vers bereide glucose runder serum albumin oplossing 's nachts.Tegen de volgende ochtend zou de oplossing ongeveer één centimeter in de uiteinden door capillaire actie moeten gestegen zijn. Vul elke pipet met een 500 microliter glasspuit, uitgerust met een flexibele gesmolten silicacapillary, elke pipet met de glucoseoplossing. Vervolgens de oplossing van elke pipet aanzuigen, voordat u de pipetten meerdere keren bijvult met verse glucoseoplossing totdat al het serum is verwijderd.Om een elektrovormingskamer voor te bereiden, reinigt u eerst ITO-dia's met een geschikt organisch oplosmiddel en identificeert u het geleidende oppervlak met een Ohmeter. Bevestig elektrische draden op de geleidende kant van elke glijbaan met plakband. Dip een capillaire in amiviviale oplossing tot ongeveer 5 microliter van de oplossing is verzameld door capillaire actie.Plaats de geladen capillaire in contact met het midden van één glazen ITO-plaat en verdeel de oplossing voorzichtig over de glijbaan. Wanneer het oplosmiddel volledig is verdampt, breng de oplossing nog twee keer aan, zoals zojuist is aangetoond. voordat u aan beide zijden van de geopende O-ring spacer een laag siliciumvrij vet toevoegt rond het afzettingsgebied.Plaats vervolgens het geleidende gezicht van een tweede ITO-glasplaat op de bovenkant van de afstandsruimte en plaats de elektrovormingskamer gedurende 3 uur onder vacuüm om eventuele sporen van organisch oplosmiddel te verwijderen. Voor de elektroformatie van Giant Unilamellar Vesicles, Sluit de elektrische draden in de generator. Stel de generatorfrequentie in op 10 Hertz, en de amplitude op 2 Volt, piek op piek.Wanneer de spanning is ingesteld, gebruik dan een spuit uitgerust met een 0,8 millimeter binnendiameter naald om een milliliter van 0,1 molaire sacharose oplossing injecteren in de kamer, en laat de kamer onder de toegepaste spanning en frequentie gedurende 75 minuten. Zet aan het einde van de elektroformatie de generator uit. En gebruik de een milliliter spuit om een klein volume van de oplossing aan te lokken totdat een luchtbel wordt geproduceerd in de kamer.Kantel de kamer iets om de bel in de kamer te bewegen en om de agelsjes los te maken van het schuifoppervlak. En het hele volume van de oplossing in de spuit aanzuigen. Breng vervolgens de blaasoplossing over in een plastic buis van één milliliter.Om de materialen voor de micromanipulatie op te zetten, aanzuigen om een waterstroom, een tank van zuiver water, aan één houder tot stand te brengen. En licht tikken tijdens het verhogen van de tank om eventuele luchtbellen te elimineren, en om positieve druk te creëren. Vul een serum gecoate capillaire met verse glucose oplossing tot een druppel vormen aan de punt.Verwijder de spuitbuizen van de metalen houder om een lichte waterstroom aan het einde van de houder te creëren en draai de capillaire ondersteboven om de glucosedruppel aan te sluiten op de waterstroom. Schroef vervolgens de capillaire en de houder aan elkaar. Om de pipet te positioneren, lijm je twee glazen platen van een op maat gemaakt aluminium podium samen met vacuümvet.En installeer de dia's op een microscooppodium. Met behulp van een een milliliter pipet, vormen een meniscus tussen de twee dia's met 0,1 molaire glucose. Plaats de pipet en de houder ervan op de motorunit van de micromanipulator.Draai de klemknop vast en gebruik de joystick van het bedieningspaneel in grove modus. Laat de micropipet in de buurt van de glucose-meniscus zakken. Gebruik de fijne modus om de positie van de tip aan te passen aan het midden van de meniscus.Dompel de punt onder in de glucose om de buiten- en binnenoppervlakken schoon te maken. Na een paar minuten, trek de capillaire van de meniscus en vervang de glucose door een verse meniscus. Aspirate twee microliters van Giant Unilamellar Vesicles in 0.1 molaire sacharose, in een 20 milliliter micropipet tip.Introduceer de akeltjes in de meniscus. Gebruik de microscoop om de akeltjes aan de onderkant van de diakamer te observeren. Wanneer de akeltjes enigszins leeggelopen zijn, de zuigpijpe opnieuw integeren en de focus op de punt van de pipet.Stel vervolgens de basishoogte van de watertank in op de druk waarbij de beweging van de deeltjes wordt gestopt. Omring de meniscus met minerale olie om verdamping te voorkomen. Om een micropipette aspiratie experiment uit te voeren, laat de pipet tip in de meniscus.Maak een kleine hoeveelheid zuigdruk om een blaasmiddel aan te zuigen. Het membraan van de geselecteerde blaasje moet enigszins fluctueren en mag geen zichtbare gebreken vertonen. Gebruik de micromanipulator om de pipet naar een hoger niveau te tillen om de aangezogen blaasje van andere blaasjes te isoleren.Laat de watertank zakken tot ongeveer 10 centimeter om de blaasje voor te zetten voordat u de tank verhoogt om de druk terug te brengen naar de oorspronkelijke waarde. Vanaf een hoogte van 0,5 centimeter neemt u de zuigdruk langzaam af tot een druk waarbij het membraan fluctueert. Verhoog vervolgens de druk om een tong duidelijk te visualiseren in de punt, de projectielengte van een paar micron.Om de buigmodulus te bepalen, verhoogt u de zuigdruk, één micrometer tegelijk op een stapsgewijze manier. Tot 0,5 tot 0,8 milliNewtons per meter wordt bereikt. Wachten vijf seconden, en het nemen van een momentopname van de tong na elke stap.Om de compressibiliteitsmodulus van het gebied te bepalen, blijven lysespanning en spanning de zuigdruk verhogen van 0,5 milliNewtons per meter totdat de breukspanning is bereikt. In dit representatieve experiment waren de compressibility modulus en lysisstam voor POPC in perfecte overeenstemming met die verwacht van de literatuur. In deze tabel kunnen typische waarden voor de verkregen polymeren worden waargenomen.Merk op dat de taaiheid van het membraan verkregen uit diblock copolymeren is veel groter dan die verkregen uit triblock copolymeer. Interessant, met behulp van de diblock copolymeer, is het mogelijk om een Giant Hybrid Unilamilar Lipid Polymer Vesicles die een meer robuuste taaiheid dan die gemeten voor liposomen aan te tonen. Dit protocol kan nuttig zijn voor het meten van blaasjes met een pipet, bijvoorbeeld om de doorlaatbaarheid van het membraan te meten door middel van asmatische schok.Zorg ervoor dat u elke stap met strengheid en precisie voltooit, vooral bij het opzetten van de tribuneverbinding. Deze techniek is gebruikt om de fysieke oorsprong van membraansplitsing te begrijpen, door het meten van lijnspanning aan de hoofdgrenzen in gemodificeerde vesikles.

obtention-giant-unilamellar-hybrid-vesicles-electroformation

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Reconstructie van functionele membraaneiwitten in gigantische liposomen van gedefinieerde samenstelling is een krachtige aanpak in combinatie met patch-clamp elektrofysiologie. Echter, kunnen conventionele reus liposoom productie onverenigbaar met eiwitstabiliteit. We beschrijven protocollen voor het produceren gigantische liposomen uit pure lipiden of kleine liposomen die ionkanalen.

Giant liposoombereiding for Imaging en patch-clamp elektrofysiologie

Microfluïdische jetting tegen een druppel-interface lipide bilaag een betrouwbare manier om vesicles te genereren controle over membraan asymmetrie, incorporatie van transmembraan eiwitten en inkapseling materiaal. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen waarbij gecompartimenteerd biomoleculen gewenst bestuderen.

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode - electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

We beschrijven een protocol voor de bereiding van ondersteunde lipide-dubbellagen en de karakterisering ervan met behulp van atoomkrachtmicroscopie en krachtspectroscopie.

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Experimenten op fase gescheiden reus unilamellar blaasjes (GUVs) worden vaak verwaarloosd fysiologische oplossing voorwaarden. Dit werk presenteert benaderingen om te bestuderen van het effect van hoge-zoutgehalte buffer op vloeistof-vloeistof fasenscheiding in geladen multicomponent GUVs als een functie van trans-membraan oplossing asymmetrie en temperatuur.

Fase gedrag van geladen blaasjes onder voorwaarden van symmetrische en asymmetrische oplossing bewaakt met fluorescentie microscopie

Veel proteïnen in de cel zin en membraan kromming veroorzaken. Beschrijven we een methode om te halen membraan nanotubes van lipide blaasjes te bestuderen de interactie van proteïnen of elke kromming-actieve molecuul met gebogen membranen in vitro.

Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

Presenteren we een techniek voor contactloze micromanipulation van blaasjes, met behulp van de gelokaliseerde calcium ion verlopen. Microinjection van een calcium Ionenoplossing, in de nabijheid van een gigantische lipide blaasje, is gebruikt om het remodelleren van het lipide membraan, wat resulteert in de productie van membraan buisvormige uitsteeksels.

Membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde Calcium Ion verlopen

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Dit artikel presenteert een methode voor het bereiden van samengestelde Giant Unilamellaire blaasjes (cGUV's) met een blaasje-in-blaasjesstructuur, met aangepaste elektrische geleidbaarheid in binnenste, ringvormige en buitenste gebieden. Elektroformatie synthetiseert eenvoudige GUV's, die via osmotische shock worden omgezet in stomatocyten en cGUV's, wat een waardevol model biedt voor het bestuderen van de biofysica van cellen met kern.

Synthese van samengestelde reusachtige unilamellaire blaasjes: een biomimetisch model van nucleaatcellen

Deze beginnershandleiding presenteert een algemeen protocol voor de bereiding van Giant Unilamellaire blaasjes (GUV's) via de druppeloverdrachtsmethode, bespreekt de kritieke stappen en biedt inzichten om mogelijke aanpassingen te helpen die nodig zijn voor verschillende toepassingen, waaronder synthetische biologie en microrobotica.

De druppeloverdrachtsmethode gebruiken om op betrouwbare wijze gigantische unilamellaire blaasjes te bereiden

Leer hoe je de mechanische eigenschappen van synthetische en polymeren lipidenvesicels meet met micropipetaspiratie. Deze methode beoordeelt membraanflexibiliteit en stabiliteit in biologische systemen.

Het verkrijgen van gigantische Unilamellaire hybride blaasjes door elektro vorming en meting van hun mechanische eigenschappen door micropipet aspiratie (Video) | JoVE Journal

Het verkrijgen van gigantische Unilamellaire hybride blaasjes door elektro vorming en meting van hun mechanische eigenschappen door micropipet aspiratie

Meer video's verkennen