Name: Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Leer hoe u eencellige co-culturen opzet met een microfluïdische chip voor dynamische tracking van cel-celinteracties. Deze methode biedt hoge capturefficiëntie en gedetailleerde microscopische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het ministerie van Wetenschappen en technologie (105-2628-E-400-001-MY2), en het Ph.D. programma in weefsel engineering en regeneratieve geneeskunde, nationale Chung Hsing University en National Health Research instituten.

1. fabricage van een wafer Mold door zachte lithografie
Opmerking: masker patroon gegevens zijn beschikbaar in onze vorige publicatie14.
<ol><li>Dehydraat een 4-inch silicium wafer in een oven van 120 °C gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Spin Coat 4 g van Su-8 2 Negative fotoresist op een 4-inch silicium wafer bij 1.000 rpm voor 30 s om een 5 μm dikke laag te maken (Layer #1).</li>
	<li>Soft Bake Layer #1 op een 65 °C-kookplaat gedurende 1 minuut en breng vervolgens de laag #1 over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 3 minuten.</li>
	<li>Koele laag #1 op kamertemperatuur, plaats deze op de houder van de semi-automatische masker aligner en lijn deze uit met de laag #1 verchroomde photomask (Capture-sitelaag).</li>
	<li>Stel laag #1 bloot met 365 nm UV-licht in een dosis van 150 mJ/cm2.</li>
	<li>Verwijder laag #1 van de aligner en na het bakken op een 65 °C-kookplaat gedurende 1 min. overdrachts laag #1 naar een kookplaat van 95 °C gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Koele laag #1 op kamertemperatuur. Dompel onder in een propyleenglycol monomethylether acetaat oplossing om de niet-crosslinked fotoresist gedurende 2 min. zachtjes te drogen met stikstofgas om een laag #1 uitlijnings markering te onthullen.</li>
	<li>Bedek de laag #1 uitlijnings markering door een plakband, spin Coat 4 g van Su-8 10 Negative fotoresist op de laag #1 bij 1.230 rpm voor 30 s om een 25 μm dikke laag te creëren #2.</li>
	<li>Verwijder de tape, zachte bak laag #2 op een 65 °C-kookplaat gedurende 3 minuten en breng vervolgens de laag #2 over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 7 minuten.</li>
	<li>Koele laag #2 op kamertemperatuur, plaats de laag #2 op de houder van de semi-automatische masker aligner en lijn de laag #2 verchroomde photomask (bypass Channel Layer) uit op de laag #1 uitlijnings markering.</li>
	<li>Stel laag #2 bloot met 365 nm UV-licht in een dosis van 200 mJ/cm2.</li>
	<li>Verwijder laag #2 van de aligner en na het bakken op een 65 °C-kookplaat gedurende 1 minuut en breng laag #2 over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 3 minuten.</li>
	<li>Koele laag #2 op kamertemperatuur, en dek de laag #1 uitlijning markering door plakband. Spin jas 4 g van Su-8 2050 negatieve fotoresist op laag #2 bij 1.630 rpm voor 30 s om een 100 μm dikke laag te maken #3.</li>
	<li>Verwijder de tape, de zachte bak laag #3 op een 65 °C-kookplaat gedurende 5 minuten en breng de laag #3 vervolgens over naar een kookplaat van 95 °C gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Koele laag #3 op kamertemperatuur, plaats de laag #3 op de houder van de semi-automatische masker aligner en lijn de laag #3 verchroomde photomask (kweekkamer Layer) uit op de laag #1 uitlijnings markering.</li>
	<li>Stel laag #3 bloot met 365 nm UV-licht in een dosis van 240 mJ/cm2.</li>
	<li>Verwijder laag #3 van de aligner en na het bakken op een 65 °C-kookplaat gedurende 5 min. overdrachts laag #3 naar een kookplaat van 95 °C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Koele laag #3 op kamertemperatuur. Dompel onder in een propyleenglycol monomethylether acetaat oplossing om de niet-crosslinked fotoresist gedurende 10 minuten weg te spoelen en zachtjes te drogen met stikstofgas.</li>
</ol>2. PDMS apparaat voorbereiding voor meerdere single cell Capture
<ol><li>Plaats de wafer Mold en de weegschaal met 100 μL trichloorsilaan in een exsiccator (alleen voor silanisatie) en breng gedurende 15 minuten een vacuüm aan (-85 kPa). Opmerking: Silanize het oppervlak met trichloorsilaan om hydrofobische oppervlakte eigenschappen te creëren vóór PDMS castingso, zodat het moeiteloos kan worden geschild van de mal van de wafer PDMS.</li>
	<li>Stop het vacuüm en silanize de wafer Mold in de exsiccator (alleen voor silanisatie) bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur.</li>
	<li>Meng PDMS base en PDMS Uithardings middel in een verhouding van 10:1. Giet in totaal 20 g gemengde PDM'S op de wafer Mold in een 15 cm schaal.</li>
	<li>Plaats de 15 cm schaal in een exsiccator en breng een vacuüm aan (-85 kPa) voor 1,5 min. Verwijder dan de 15 cm schaal van de desiccator. Houd gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder ten slotte resterende luchtbellen in PDM'S met stikstofgas.</li>
	<li>Plaats de 15 cm schaal in een oven bij 65 °C gedurende 2-4 uur om PDM'S te genezen.</li>
	<li>Verwijder de PDMS-replica van de wafer Mold en Punch vervolgens een 1,5 mm inlaat en een 0,5 mm uitlaat op de PDMS met een binnendiameter van 1,5 mm en een Puncher met een binnendiameter van 0,5 mm (Figuur 1C).</li>
	<li>Reinig de PDMS replica en het schuif oppervlak met verwijderbare tape en behandel het oppervlak met zuurstof plasma (100 W voor 14 s).</li>
	<li>De PDMS-replica's handmatig uitlijnen met de dia en ze in contact brengen met elkaar.</li>
	<li>Plaats de PDMS Slide 1 dag in een 65 °C oven. Opmerking: permanente binding tussen de dia en de PDMS replica wordt bereikt om het apparaat te vormen.</li>
	<li>Dompel het PDMS-apparaat onder in een container gevuld met fosfaatgebufferde zoutoplossing en plaats deze in een exsiccator. Breng vervolgens een vacuüm aan (-85 kPa) gedurende 15 minuten om luchtbellen te verwijderen.</li>
	<li>Plaats het PDMS-apparaat in een celcultuurkap en steriliseer het apparaat met UV-licht (licht golflengte: 254 nm) gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Vervang de apparaatbuffer van PDMS door middel van medium (DMEM-F12 Basaal medium met 1% antibioticum en 10% foetaal runderserum) en inincuberen het PDMS-apparaat bij 4 °C gedurende 1 dag. Dit voorkomt dat cellen zich aan het PDMS-oppervlak hechten.</li>
</ol>3. bereiding van een eencellige suspensie
Opmerking: celtypen omvatten menselijke lymfatische endotheliale cellen (LECs), humane OSCC TW 2.6-cellen die WNT5B-specifieke shRNA (WNT5B SH4) en vector Control (pLKO-GFP) uitdrukken die werden verkregen uit onze vorige studie15. Raadpleeg onze vorige publicatie voor gedetailleerde teelt stappen.
<ol><li>Verwijder het kweekmedium wanneer de cellen 70-80% samenloop bereiken. Vervolgens driemaal de cellen voorzichtig wassen met 5 mL steriele PBS.</li>
	<li>Voeg 1 mL DMEM-F12 medium met 1 μM fluorescerende kleurstof toe aan WNT5B SH4 en pLKO-GFP cellen (gebruik MV2 medium voor LECs) en inincuberen de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: LECs waren gekleurd met groene chlooromethylfluorescein DIACETAAT (CMFDA) kleurstof, WNT5B SH4 cellen werden bevlekt met blauwe 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) kleurstof en pLKO-GFP cellen werden gekleurd met rode DIL fluorescerende kleurstof.</li>
	<li>Spoel de cellen drie keer zachtjes met 5 mL steriele PBS.</li>
	<li>Verwijder de PBS en voeg 2 mL 0,25% trypsine-EDTA (0,05% trypsine-EDTA voor LECs) toe.</li>
	<li>Inincuberen de cellen gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur en tik vervolgens zachtjes op de weefselkweek schaal om de loslating van cellen te bevorderen.</li>
	<li>Voeg 4 mL DMEM-F12 medium toe om WNT5B SH4 en pLKO-GFP cellen te dispergeren (voor LECs gebruikt u 3 mL MV2 medium en 1 mL trypsine neutralisatieoplossing). Breng de cellen vervolgens over in een buis van 15 mL en centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten.</li>
	<li>Verwijder de supernatant en rebreng de celpellet voorzichtig in 1 mL DMEM-F12 medium. Tel het aantal levende cellen in een hemocytometer met behulp van de standaard Trypan Blue uitsluitings methode16. Bereid 1 mL celsuspensie bij 3 x 105 cellen/ml concentratie in DMEM-F12 medium, en houd vervolgens cellen op ijs om celaggregatie te voorkomen. Let op: om de single-cell Capture-efficiëntie te verbeteren, is een zorgvuldige voorbereiding van de eencellige suspensie met goed-dissociated vereist.</li>
</ol>4. meerdere single-cell Capture en Triple eencellige cultuur
<ol><li>Sluit een poly-tetrafluoretheen (PTFE) buis aan tussen de uitlaat van het apparaat en de spuitpomp. Verwijder het medium en voeg 1 μL celsuspensie toe bij een concentratie van 3 x 105 cellen/ml in de inlaat van het PDMS-apparaat.</li>
	<li>Laad de celsuspensie in het apparaat door een spuitpomp met een debiet van 0,3 μL/min (Figuur 2a). Stroomrichting is van de inlaat naar de uitlaat. Opmerking: laad onmiddellijk na het toevoegen van de celsuspensie in de inlaat om celsedimentatie te voorkomen.</li>
	<li>Voeg na stap 4.2 1 μL DMEM-F12-medium toe aan de inlaat van het PDMS-apparaat. Laad het medium op de DMEM-F12 in het apparaat door een spuitpomp met een debiet van 0,3 μL/min (Figuur 2B). Stroomrichting van de inlaat naar het stopcontact stroomt.</li>
	<li>Laad 0,3 μL DMEM-F12 medium in het apparaat door middel van een spuitpomp met een debiet van 10 μL/min (Figuur 2C). Stroomrichting stroomt van de uitlaat naar de inlaat.</li>
	<li>Herhaal de stappen 4,1 tot 4,4 om andere celtypen in het apparaat te laden.</li>
	<li>Na het voltooien van de celopname, gebruik een microscoop met 4x lens om elke cultuur kamer te beelden. NB: de fluorescentie-uitstoot van de cellen werd gebruikt om het aantal individuele cellen in elke kweekkamer te identificeren en te tellen.</li>
	<li>Verwijder de PTFE-buis en verzegel de inlaat en de uitlaat met Polyolefine tape om een gesloten cultuur systeem te creëren.</li>
	<li>Verplaats het PDMS-apparaat naar een kweek schaal van 10 cm en voeg 10 mL steriele PBS rond het PDMS-apparaat toe om de verdamping van het medium van het apparaat te voorkomen.</li>
	<li>Breng de kweek schaal over naar een incubator (37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid) voor drievoudige eencellige kweek.</li>
	<li>Microscopisch observeren en fotograferen celgroei elke 12 h.</li>
</ol>

<ol><li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Poisson+distribution+and+beyond%3A+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li>
<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804(2008).</li>
<li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li>
<li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li>
<li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340(2015).</li>
<li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li>
<li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li>
<li>Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li>
<li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li>
<li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li>
<li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li>
<li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503(2016).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li>
<li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li>
<li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De intercellulaire interacties van verschillende cellen in de tumor micro omgeving spelen een belangrijke rol in de progressie van de tumor17. Om het mechanisme van celcelinteracties te begrijpen, worden co-cultuur systemen gebruikt als een gemeenschappelijke analytische methode. Echter, meerdere celtypen en de heterogeniteit van de cellen zelf hebben geleid tot experimentele complexiteit en analytische moeilijkheden.
De hydrodynamische pendelen chip laat meerdere eence...

Efficiënte inname van verschillende soorten afzonderlijke cellen en het verstrekken van voldoende cultuur ruimte zijn nodig voor co-cultuur experimenten met één cel van meerdere typen enkelvoudige cellen1. Beperkende verdunning is de meest gebruikte methode om de afzonderlijke cellen voor dergelijke experimenten voor te bereiden, vanwege de lage kosten van de benodigde apparatuur. Vanwege de Poisson-verdelings beperking is de maximale kans op een enkelvoudige celverwerving echter slechts 37%, waardoor de experimentele operatie moeizaam en tijdrovend is2. Daarentegen kan het gebruik van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) de Poisson-verdelings begrenzing overwinnen tot hoog-efficiënt enkelvoudige cellen voorbereiden3. FACS is echter mogelijk niet toegankelijk voor sommige laboratoria vanwege dure instrumentatie-en onderhoudskosten. Micro fabricaat-apparaten zijn onlangs ontwikkeld voor single cell-overvulling4, eencellige pairing5en toepassingen voor één celcultuur. Deze apparaten zijn voordelig op basis van hun vermogen om nauwkeurig individuele cellen te manipuleren6, uitvoeren van experimenten met hoge doorvoer, of verminderen van monster en reagens verbruik. Het uitvoeren van eencellige co-cultuur experimenten met meerdere celtypen met de huidige microfluïdische apparaten is echter nog steeds een uitdaging vanwege de beperking van Poisson-distributie1,7,8of het onvermogen van de apparaten om meer dan twee soorten afzonderlijke cellen vast te leggen4,5,6,9,10.
Bijvoorbeeld, Yoon et al. rapporteerde een microfluïdisch apparaat voor cel-cel interactiestudie11. Dit apparaat gebruikt de probabilistische-methode om cellen in één kamer te koppelen. Het kan echter alleen de koppeling van twee verschillende celtypen bereiken vanwege geometrische beperkingen in de apparaatstructuur. Een ander verslag van Lee et al. demonstreerde een deterministische methode om enkelvoudige cellen vast te leggen en te koppelen12. Dit apparaat verhoogt de koppel efficiëntie door de deterministische methode, maar het wordt beperkt door de verlengde bewerkingstijd die nodig is om cellen te koppelen. Specifiek, de tweede cel Capture kan alleen worden uitgevoerd nadat de eerste vastgelegde cel is bevestigd aan het oppervlak na 24 h. Zhao et al. rapporteerde een op droplet gebaseerd microfluïdisch apparaat om twee typen van één cel13vast te leggen. We kunnen vinden dat het op druppel gebaseerde microfluïdische apparaat nog steeds beperkt is tot de Poisson-verdeling en alleen kan worden gebruikt op niet-aangehechte cellen, en het is niet mogelijk om de cultuur oplossing tijdens het teeltproces te veranderen.
Eerder hebben we een microfluïdische "hydrodynamische pendelen chip" ontwikkeld die deterministische hydrodynamische krachten gebruikt om meerdere soorten eencellige in de cultuur kamer vast te leggen en vervolgens celco-cultuur experiment kan uitvoeren om te analyseren individuele Celmigratie gedrag onder celcelinteracties14. De hydrodynamische pendelen chip bestaat uit een reeks eenheden die elk een serpentine by-pass kanaal, een Capture-site en een cultuur kamer bevat. Door gebruik te maken van het verschil in stromingsweerstand tussen het serpentine by-pass kanaal en de kweekkamer, en een speciaal ontworpen operatie procedure, kunnen verschillende soorten enkelvoudige cellen herhaaldelijk in de kweekkamer worden gevangen. Met name de ruime ruimte van de cultuur kamer kan niet alleen voorkomen dat de cel wordt gespoeld tijdens het vastleggen van de cel, maar biedt ook voldoende ruimte voor de cellen om te verspreiden, te vermenigvuldigen en te migreren, waardoor het observeren van Live eencellige interacties mogelijk is. In dit artikel richten we ons op de productie van dit apparaat en gedetailleerde protocol stappen.

<table><tbody><tr><td>3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape</td><td>3M Company</td><td>9795R</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamine-Penicillin-Streptomycin</td></tr><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Part No. 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>CellTracke Blue CMAC Dye</td><td>Invitrogen</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>Conventional oven</td><td>YEONG-SHIN company</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Space saver vacuum desiccator 190 mm white base</td></tr><tr><td>DiIC12(3) cell membrane dye</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Used as a cell tracker</td></tr><tr><td>DMEM-F12 medium</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum Hyclone</td><td>Thermo</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml )</td><td>Hamilton</td><td>80630</td><td>100 &micro;L, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core puncher</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15075</td><td>with 1.5mm inner-diameter</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core puncher</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15071</td><td>with 0.5mm inner-diameter</td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>YOTEC company</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak aligner</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen plasma</td><td>NORDSON MARCH</td><td>AP-300</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Bench-Top Plasma Treatment System</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) kit</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Poly-tetrafluoroethene (PTFE)</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm</td></tr><tr><td>Removable tape</td><td>3M Company</td><td>Scotch Removable Tape 811</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>Eltech corperation</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2" ~ 6"</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 10 negative photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y131259</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2 negative photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y131240</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050 negative photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Propylene glycol monomethyl ether acetate</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.</td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizer Solution</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr></tbody></table>

het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een microfluïdische chip

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Celco-cultuur assays zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van celcelinteracties tussen verschillende celtypen om beter te begrijpen van de biologie van ziekten met inbegrip van Cancer. Het is echter een uitdaging om het complexe mechanisme van intercellulaire interacties in zeer heterogene celpopulaties te verduidelijken met behulp van conventionele co-cultuur systemen, omdat de heterogeniteit van de celsubpopulatie wordt bedekt door de gemiddelde waarden; de conventionele co-cultuur systemen kunnen alleen worden gebruikt om het bevolkings signaal te beschrijven, maar zijn niet in staat om het gedrag van individuele cellen te volgen. Bovendien hebben conventionele eencellige experimentele methoden een lage efficiëntie bij het manipuleren van cellen vanwege de Poisson-verdeling. Micro fabricaat-apparaten zijn een opkomende technologie voor eencellige studies omdat ze afzonderlijke cellen nauwkeurig kunnen manipuleren bij hoge doorvoer en het monster-en reagens verbruik kunnen verminderen. Hier beschrijven we het concept en de toepassing van een microfluïdische chip voor meerdere eencellige co-culturen. De chip kan efficiënt meerdere soorten afzonderlijke cellen in een cultuur kamer vastleggen (~ 46%) en heeft een voldoende cultuur ruimte die nuttig is om het gedrag van de cellen te bestuderen (bijv. migratie, proliferatie, enz.) onder celcelinteractie op het eencellige niveau. Lymfatische endotheliale cellen en oraal plaveiselcelcarcinoom werden gebruikt om een eencellige co-cultuur experiment uit te voeren op het microfluïdische platform voor Live meervoudige interactiestudies met één cel.

Het apparaat heeft een drie lagenstructuur zoals aangegeven door de doorsnede foto van een cut PDMS-apparaat (Figuur 1a). De eerste laag bevat een Capture-site (6,0 μm in breedte en 4,6 μm in hoogte) die de cultuur kamer en het by-pass kanaal verbindt. Het verschil in stromingsweerstand tussen de kweekkamer en het by-pass kanaal zorgt ervoor dat de cellen in de veroverings positie stromen en de ingang van het kleine pad vullen. Nadat een cel ...

Dit rapport beschrijft een microfluïdische chip-gebaseerde methode voor het opzetten van een eencelkweek experiment waarbij hoogrenderende koppeling en microscopische analyse van meerdere afzonderlijke cellen kunnen worden bereikt.

Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Het is van cruciaal belang om effectief te combineren capture efficiëntie met dynamische live cel beeld observatie om het effect van cel-cel interactie op celgedrag te begrijpen. Deze buis kan zeer efficiënt meerdere enkele cellen in een grotere kamer vastleggen en een voldoende cultuurbasis bieden, voor dynamische tracking van meerdere eencellige interactiegedrag. Begin met het voorbereiden van het PDMS-apparaat.Plaats een wafer mal in de weegschaal met 100 microliters van trichlorosilane in een desiccator en breng een vacuüm gedurende 15 minuten. Stop het vacuüm en verzilt de wafer schimmel in de desiccator op 37 graden Celsius voor ten minste een uur. Meng de PDMS-basis en PDMS-uithardingsmiddel met een verhouding van tien tegen één en giet vervolgens in totaal 20 gram van het mengsel op de wafermal in een schaal van 15 centimeter.Plaats de schotel van 15 centimeter in een desiccator en breng anderhalve minuut een vacuüm aan. Haal vervolgens de schotel uit de desiccator en elimineer restluchtbellen in de PDMS met stikstofgas. Genees de PDMS door de schotel twee tot vier uur in een oven op 65 graden Celsius te plaatsen.Als u klaar bent, verwijdert u de PDMS-replica uit de wafermal en slaat u een inlaat van 1,5 millimeter en een uitlaat van 0,5 millimeter op de PDMS. Reinig de PDMS-replica en het schuifoppervlak met verwijderbare tape. Behandel het oppervlak met zuurstofplasma.Vervolgens moet u de PDMS-replica handmatig uitlijnen met de dia en deze met elkaar in contact brengen. Laat de PDMS-dia één dag in de 65 graden Celsius oven staan. Dompel het PDMS-apparaat de volgende dag onder in een container gevuld met PBS.Plaats het in de desiccator, en breng vacuüm gedurende 15 minuten. Verplaats het apparaat naar een celkweekkap en steriliseer het gedurende 30 minuten met UV-licht. Vervang de PDMS-apparaatbuffer door medium en incubbate het op vier graden Celsius gedurende een dag.Wanneer de cellen bereiken 70 tot 80%samenvloeiing, verwijder de cultuur medium en voorzichtig wassen ze drie keer met vijf milliliter PBS. Voeg een milliliter DMEM/F-12 medium met één micromolar fluorescerende kleurstof toe aan de WNT5B sh4- en pLKO-GFP-cellen en broed ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur uit. Na de incubatie was je de cellen voorzichtig drie keer met vijf milliliter steriele PBS, verwijder je de PBS en voeg je twee milliliter van 0,25% Trypsin-EDTA toe.Incubeer de cellen gedurende vier minuten bij kamertemperatuur, dan zachtjes tik op de cultuur schotel om celloslating te bevorderen. Voeg vier milliliter DMEM/F-12 medium toe om WNT5B sh4- en pLKO-GFP-cellen te verspreiden, breng de cellen over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer ze drie minuten lang op 300 xg. Verwijder de supernatant en voorzichtig opnieuw op te schorten de cel pellet in een milliliter van DMEM / F-12 medium.Bereid een milliliter celsuspensie voor met een concentratie van drie keer tien tot vijf cellen per milliliter en houd het op ijs om celaggregatie te voorkomen. Sluit de polytetrafluorethyleenbuis aan tussen het stopcontact van het apparaat en de spuitpomp. Verwijder het medium en voeg één microliter van de voorbereide celsuspensie toe aan de inlaat van het PDMS-apparaat.Laad vervolgens de celsuspensie in het apparaat met behulp van een spuitpomp met een stroomsnelheid van 0,3 microliter per minuut. Voeg een microliter DMEM/F-12-medium toe aan de inlaat van het apparaat en laad het medium vervolgens in het apparaat met behulp van een spuitpomp. Laad 0,3 microliter dmem/F12-medium in het apparaat met de spuitpomp met een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut.Nadat de cellen zijn geladen, verwijder de buis, en verzegel de inlaat en uitlaat met polyolefin tape om een gesloten cultuur systeem te creëren. Verplaats het PDMS-apparaat naar een kweekschotel van 10 centimeter en voeg 10 milliliter steriele PBS rond het apparaat toe om verdamping van medium te voorkomen. Breng het kweekschotel over naar een couveuse voor de driedubbele eencellige cultuur.Het PDMS-apparaat heeft een structuur met drie lagen met een opnamesite die verbinding maakt met de cultuurkamer en het bypasskanaal. Het verschil in stroomweerstand tussen de kweekkamer en het bypasskanaal zorgt ervoor dat de cel in de opnamepositie kan stromen, waardoor de volgende cel door het bypasskanaal naar de volgende opnameplaats gaat. De reflux stap wordt gebruikt om de cel vrij te geven van de capture site en stuur het naar de cultuur kamer.De efficiëntie van het celafvang van dit protocol is geëvalueerd op drie verschillende celtypen. Menselijke lymfe-endotheliale cellen, of LECs, menselijke orale plaveiselcelcarcinoom T2.6 cellen uitdrukken WNT5B-specifieke korte haarspeld RNA, en pLKO-GFP vector controlecellen. De single-cell capture efficiëntie van de drie aangetoonde cellen waren ongeveer 71%voor de LECs, 74% voor WNT5B sh4 cellen, en 78%voor de pLKO-GFP cellen.De drievoudige eencellige opname-efficiëntie was 48%Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere eencellige co-culturen van lymfeendotheelcellen en plaveiselkankercellen, en de proliferatie en morfologie van de cel kan worden waargenomen onder een microscoop. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de voorbereide celsuspensies minimale celaggregaten hebben, omdat celaggregaten niet alleen de efficiëntie van het koppelen van één paar verminderen, maar ook de microkanalen kunnen verstoppen. Celcelinteractie tussen afzonderlijke cellen speelt een belangrijke rol bij het beheersen van celgedrag.Onze methode kan een efficiënt instrument bieden om onderzoekers te helpen celcelinteractie op een celniveau te bestuderen, wat kan leiden tot de ontdekking van nieuwe mechanismen die niet gemakkelijk kunnen worden verkregen uit populatiestudies.

establishing-single-cell-based-co-cultures-deterministic-manner-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een chip-gebaseerde platform voor de drie-dimensionale kweken van cellen in micro-bioreactoren. Een chip kan maximaal huis tot 10 miljoen. cellen die kunnen worden geteeld onder nauwkeurig omschreven voorwaarden met betrekking tot stroming, zuurstofspanning enz. in een steriele, gesloten circulatie lus.

Chip-op basis van drie-dimensionale Cultuur van de Cel in doorbloed Micro-bioreactoren

We een eenvoudige methode om microfluïdische inrichtingen kunnen toepassen soortgelijke dynamische omstandigheden meerdere verschillende stammen produceren zonder de noodzaak van een clean room of zachte lithografie.

Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.

Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Protocollen voor enkel neuron microfluïdische arraying en water maskeren voor de in-chip plasma patroonvorming van biomateriaal coatings worden beschreven. Sterk verbonden co-culturen kan worden bereid met minimale cel ingangen.

Voorbereiding van Neuronale Co-culturen met Single Cell Precision

Hier presenteren we een protocol om primaire cellen, weefselmodellen en punchbiopten gedurende maximaal 28 dagen te cocultiveren in een microfluïdische multi-orgaan chip. Humane dermale microvasculaire endotheelcellen, leveraggregaten en huidbiopten werden met succes gecombineerd in een gemeenschappelijke mediacirculatie.

De Multi-orgel Chip - Een Microfluïdische platform voor lange termijn Multi-weefsel Coculture

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

We presenteren een microfluïdische Cancer-on-chip-model, de "Evolution Accelerator"-technologie, die een controleerbaar platform biedt voor langdurige realtime kwantitatieve studies van kanker dynamiek binnen goed gedefinieerde omgevingscondities op de eencellige Niveau. Deze technologie wordt verwacht te werken als een in vitro model voor fundamenteel onderzoek of pre-klinische ontwikkeling van de drug.

Generatie van heterogene drugs gradiënten over kanker populaties op een Microfluïdische evolution Accelerator voor real-time observatie

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering vereist kankerbiologie nieuwe in vitro en computationele hulpmiddelen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context. We beschrijven protocollen om tumor-immuun microfluïdische co-culturen te exploiteren in 2D- en 3D-instellingen, compatibel met dynamische, multiparametrische monitoring van cellulaire functies.

Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen

Een protocol voor het kweken en manipuleren van embryonaal weefsel van muizen op een microfluïdische chip wordt verstrekt. Door pulsen van pathway modulators toe te passen, kan dit systeem worden gebruikt om signaaloscillaties extern te regelen voor het functionele onderzoek van muis somitogenese.

Een microfluïdische benadering voor het functioneel onderzoek van signaaloscillaties die somitogenese beheersen

Leer hoe u eencellige co-culturen opzet met een microfluïdische chip voor dynamische tracking van cel-celinteracties. Deze methode biedt hoge capturefficiëntie en gedetailleerde microscopische analyse.

Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip

Meer video's verkennen