Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip

Het is van cruciaal belang om effectief te combineren capture efficiëntie met dynamische live cel beeld observatie om het effect van cel-cel interactie op celgedrag te begrijpen. Deze buis kan zeer efficiënt meerdere enkele cellen in een grotere kamer vastleggen en een voldoende cultuurbasis bieden, voor dynamische tracking van meerdere eencellige interactiegedrag. Begin met het voorbereiden van het PDMS-apparaat.

Plaats een wafer mal in de weegschaal met 100 microliters van trichlorosilane in een desiccator en breng een vacuüm gedurende 15 minuten. Stop het vacuüm en verzilt de wafer schimmel in de desiccator op 37 graden Celsius voor ten minste een uur. Meng de PDMS-basis en PDMS-uithardingsmiddel met een verhouding van tien tegen één en giet vervolgens in totaal 20 gram van het mengsel op de wafermal in een schaal van 15 centimeter.

Plaats de schotel van 15 centimeter in een desiccator en breng anderhalve minuut een vacuüm aan. Haal vervolgens de schotel uit de desiccator en elimineer restluchtbellen in de PDMS met stikstofgas. Genees de PDMS door de schotel twee tot vier uur in een oven op 65 graden Celsius te plaatsen.

Als u klaar bent, verwijdert u de PDMS-replica uit de wafermal en slaat u een inlaat van 1,5 millimeter en een uitlaat van 0,5 millimeter op de PDMS. Reinig de PDMS-replica en het schuifoppervlak met verwijderbare tape. Behandel het oppervlak met zuurstofplasma.

Vervolgens moet u de PDMS-replica handmatig uitlijnen met de dia en deze met elkaar in contact brengen. Laat de PDMS-dia één dag in de 65 graden Celsius oven staan. Dompel het PDMS-apparaat de volgende dag onder in een container gevuld met PBS.

Plaats het in de desiccator, en breng vacuüm gedurende 15 minuten. Verplaats het apparaat naar een celkweekkap en steriliseer het gedurende 30 minuten met UV-licht. Vervang de PDMS-apparaatbuffer door medium en incubbate het op vier graden Celsius gedurende een dag.

Wanneer de cellen bereiken 70 tot 80%samenvloeiing, verwijder de cultuur medium en voorzichtig wassen ze drie keer met vijf milliliter PBS. Voeg een milliliter DMEM/F-12 medium met één micromolar fluorescerende kleurstof toe aan de WNT5B sh4- en pLKO-GFP-cellen en broed ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur uit. Na de incubatie was je de cellen voorzichtig drie keer met vijf milliliter steriele PBS, verwijder je de PBS en voeg je twee milliliter van 0,25% Trypsin-EDTA toe.

Incubeer de cellen gedurende vier minuten bij kamertemperatuur, dan zachtjes tik op de cultuur schotel om celloslating te bevorderen. Voeg vier milliliter DMEM/F-12 medium toe om WNT5B sh4- en pLKO-GFP-cellen te verspreiden, breng de cellen over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer ze drie minuten lang op 300 xg. Verwijder de supernatant en voorzichtig opnieuw op te schorten de cel pellet in een milliliter van DMEM / F-12 medium.

Bereid een milliliter celsuspensie voor met een concentratie van drie keer tien tot vijf cellen per milliliter en houd het op ijs om celaggregatie te voorkomen. Sluit de polytetrafluorethyleenbuis aan tussen het stopcontact van het apparaat en de spuitpomp. Verwijder het medium en voeg één microliter van de voorbereide celsuspensie toe aan de inlaat van het PDMS-apparaat.

Laad vervolgens de celsuspensie in het apparaat met behulp van een spuitpomp met een stroomsnelheid van 0,3 microliter per minuut. Voeg een microliter DMEM/F-12-medium toe aan de inlaat van het apparaat en laad het medium vervolgens in het apparaat met behulp van een spuitpomp. Laad 0,3 microliter dmem/F12-medium in het apparaat met de spuitpomp met een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut.

Nadat de cellen zijn geladen, verwijder de buis, en verzegel de inlaat en uitlaat met polyolefin tape om een gesloten cultuur systeem te creëren. Verplaats het PDMS-apparaat naar een kweekschotel van 10 centimeter en voeg 10 milliliter steriele PBS rond het apparaat toe om verdamping van medium te voorkomen. Breng het kweekschotel over naar een couveuse voor de driedubbele eencellige cultuur.

Het PDMS-apparaat heeft een structuur met drie lagen met een opnamesite die verbinding maakt met de cultuurkamer en het bypasskanaal. Het verschil in stroomweerstand tussen de kweekkamer en het bypasskanaal zorgt ervoor dat de cel in de opnamepositie kan stromen, waardoor de volgende cel door het bypasskanaal naar de volgende opnameplaats gaat. De reflux stap wordt gebruikt om de cel vrij te geven van de capture site en stuur het naar de cultuur kamer.

De efficiëntie van het celafvang van dit protocol is geëvalueerd op drie verschillende celtypen. Menselijke lymfe-endotheliale cellen, of LECs, menselijke orale plaveiselcelcarcinoom T2.6 cellen uitdrukken WNT5B-specifieke korte haarspeld RNA, en pLKO-GFP vector controlecellen. De single-cell capture efficiëntie van de drie aangetoonde cellen waren ongeveer 71%voor de LECs, 74% voor WNT5B sh4 cellen, en 78%voor de pLKO-GFP cellen.

De drievoudige eencellige opname-efficiëntie was 48%Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere eencellige co-culturen van lymfeendotheelcellen en plaveiselkankercellen, en de proliferatie en morfologie van de cel kan worden waargenomen onder een microscoop. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de voorbereide celsuspensies minimale celaggregaten hebben, omdat celaggregaten niet alleen de efficiëntie van het koppelen van één paar verminderen, maar ook de microkanalen kunnen verstoppen. Celcelinteractie tussen afzonderlijke cellen speelt een belangrijke rol bij het beheersen van celgedrag.

Onze methode kan een efficiënt instrument bieden om onderzoekers te helpen celcelinteractie op een celniveau te bestuderen, wat kan leiden tot de ontdekking van nieuwe mechanismen die niet gemakkelijk kunnen worden verkregen uit populatiestudies.