Karakterisatie van functioneel geassocieerde Mirna's in glioblastoma en hun engineering in kunstmatige clusters voor gentherapie

Dit protocol maakt de gelijktijdige modulatie van vele micro RNAs in eukaryotische cellen mogelijk en is gebaseerd op een zeer eenvoudige en flexibele methode die moleculaire kloonstappen minimaliseert. Deze techniek heeft implicaties voor de studie van micro RNA functionele interacties in vitro, maar nog belangrijker het biedt een platform voor een effectiever gebruik van micro RNAs in therapie. We hebben het voornamelijk ontwikkeld en gebruikt in het kader van hersenkanker, maar het is van toepassing op ziekten waarbij meerdere veranderingen van genexpressie betrokken zijn.

We hebben onze kunstmatige transgenen getest in andere modellen zoals borst- en schildklierkankerlijnen die de reproduceerbaarheid van deze techniek laten zien. Basiskennis van bio-informatica en micro RNA biologie is nuttig voor dit protocol, maar niet onmisbaar. Een bioinformatica benadering is belangrijk om relevante micro RNA combinaties en de TRK-11 te definiëren, terwijl vertrouwdheid met de micro RNA verwerking meetbaar is belangrijk om te begrijpen hoe deze verschillende micro RNAs kunnen worden geassembleerd in kunstmatige DNA-clusters die met succes kunnen worden verwerkt zodra stabiel om de specifieke cellen.

Om schotel te coaten, los eerst poly-D-lysine op in water met een concentratie van 100 microgram per milliliter. Giet de oplossing in de schotel op de hoeveelheid van een milliliter oplossing per 25 vierkante centimeter oppervlak. Draai de schotel om ervoor te zorgen van de dekking van de hele schotel.

Na zes uur de poly-D-lysine oplossing aanzuigen en twee keer spoelen met PBS. Plaat menselijke neurale stamcellen in de hoeveelheid van 100.000 cellen per vijf milliliter van het medium, hetzij in stamcelmedium, astrocytische differentiatie medium of neuronale differentiatie medium. Na celbeplating, plaats de schotel in een incubator op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide voor een week en ga verder met het uitvoeren van micro RNA expressie analyse volgens het manuscript.

Om gbm-34 glioblastoom stamachtige cellen te kweken, begin met één keer tien tot de vijfde cellen en vijf milliliter neurobasaal medium in een 25 vierkante centimeter lage bevestigingskolf. Plaats de kolf in een couveuse op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide. Voeg 48 uur na het beplating elke zeven dagen een verdubbeling van de concentraties DNA-alkylatingmiddel temozolomide toe.

Begin met toevoeging van vijf micromolar TMZ aangevuld in vijf milliliter medium gedurende vijf dagen. Na vijf dagen verwijdert u het medium en vervangt u het door vers medium zonder temozolomide om de overlevende cellen te laten herstellen. Voeg na 48 uur 10 micromolar temozolomide toe en incubeer nog eens vijf dagen.

Herhaal de verdubbeling van de temozolomide behandeling totdat de concentratie van ten minste 100 micromolar is bereikt en cellen resistent worden tegen het medicijn. Na de inductie van resistentie, liggen cellen met behulp van 1 milliliter van Lysis reagens. Haal het totale RNA eruit en analyseer de expressie van de specifieke micro RNAs volgens het manuscript.

Gebruik micro RNA-targetingvoorspellingstools om het voorspelde doelomeen van elk micro-RNA dat eerder is gedefinieerd te verkrijgen. Selecteer op de voorpagina van TargetScan het micro-RNA van belang in het vooraf ingevulde vervolgkeuzemenu. Klik op verzenden.

Download de resulterende lijst met doelen als spreadsheet via de koppeling downloadtabel. Als u de kans op fout-positieve voorspellingen wilt verkleinen, omvat u alleen doelen binnen de kolom behouden sites en downstream-analyse. Aanvullende micro-RNA-voorspellingsprogramma's verkrijgen verdere stringentie en bevatten alleen doelen die voor alle algoritmen gebruikelijk zijn.

Open vervolgens ToppGene suite 20. Om te evalueren voor de verrijking van trajecten die gemeenschappelijk zijn voor elk micro-RNA, plakt u de lijst met doelen die zijn verkregen in het venster van het trainingsgensets. Klik op HGNC-symbool als invoertype.

Klik op verzenden en begin. Het programma biedt een uitvoertabel met de belangrijkste GO-categorieën voor de ingevoerde lijst met genen. Om eindelijk de bijdrage van elk micro-RNA aan de regulering van een gemeenschappelijk traject of cellulair proces vast te stellen, opent u de venn-diagramfunctie die wordt geleverd in de website Bioinformatica en Evolutionair Genomics.

Controleer elk verkregen targetoom aan de hand van de volledige lijst van genen die betrokken zijn bij het specifieke cellulaire proces. Als doel messenger RNAs voor elke micro RNAs van belang zijn in de respectieve vensters, uploaden van copy-paste de lijst. Noem elke lijst met een unieke id.

Klik op verzenden. Het programma biedt een visuele uitvoer van een venn-diagram met aantallen genen in elke sector, evenals een volledige lijst van messenger RNAs voor elke subset en kruispunt combinaties. Om de geselecteerde micro RNAs te groeperen in een functioneel transgen, verkrijg je een transgeen steiger op basis van de miR-17-92 cluster locus.

Verkrijg de nucleotidesequentie uit de ensembled genome browser. Selecteer de ongeveer 800 basispaar kern sequentie omvat alle zes gecodeerde micro RNA haarspelden van de locus en ten minste 200 nucleotide flankerende sequenties zowel stroomopwaarts als stroomafwaarts van de kern sequentie. Plak de reeks in een tekstbewerkingsprogramma.

Definieer de volgorde van elk van de zes inheemse haarspelden door ze op te halen in miR-basis. Markeer elk van deze sequenties binnen de reeks van eerder geïdentificeerde kernreeks. Alle sequenties tussen elke haarspeld vertegenwoordigen spacer sequenties.

Vervolgens verkrijgen van de haarspeldopeenvolgingen van micro RNAs bedoeld om over uitgedrukt in het trans-gen van miR basis. Let zorgvuldig op de specifieke nucleotiden die zich op de plaatsen van microprocessor decolleté bevinden. Verwijder de inheemse haarspeldopeenvolgingen uit de kernvolgorde met uitzondering van drie tot vijf nucleotiden aan zowel de vijf als de uiteinden van elke haarspeld die als acceptor voor de nieuwe haarspelden zullen dienen.

Plak de haarspeldsequenties van de gewenste micro RNAs om de eerder verwijderde haarspelden te vervangen. Voeg gewenste beperkingssequenties toe aan beide flankerende gebieden van het transgen om sub klonen in naar keuze te maken van leveringsvectoren. Controleer of de gekozen beperkingssequenties niet aanwezig zijn in de reeks zelf.

Als u de tweedimensionale structuur van het transgen wilt verifiëren, kopieert u de volledige transgene sequentie in het RNA-structuurvoorspellingssoftwareprogramma RNA Webfold. Selecteer standaardprogramma-instellingen en klik op Doorgaan. Analyseer de grafische output, met name voor de aanwezigheid van goed gedefinieerde haarspelden in aanwezigheid van dubbelstrengs stengelstructuren die ten minste 11 nucleotiden proximaal zijn voor de microprocessordecolletésite.

Zoek ook naar de afwezigheid van vertakkingspunten binnen de haarspeldopeenvolgingen. Op dit punt is het trans-gen klaar om te worden geproduceerd door gensynthese en gekloond in de gewenste toedingsvectoren. Deze methode toegestaan karakterisering van een module van drie micro RNAs die consequent naar beneden geregeld in hersentumoren, die specifiek worden uitgedrukt tijdens neuronale differentiatie.

Co-expressie patronen van micro RNA modules tijdens genotoxische stress werden bevestigd en suggereerde een sterke synergetische activiteit onder deze drie micro RNAs. Het ontworpen transgen kan tegelijkertijd de expressie van de drie micro RNAs in glioblastoomcellen samenvatten, zowel in vitro als in vivo, met significante interferentie in tumorbiologie en veelbelovende translationele toepasbaarheid. Daarnaast was het transgene cluster ook functioneel in een borstkankermodel.

De cruciale vereisten van dit protocol zijn het behoud van de oorspronkelijke grootte van de processor decolleté in het trans-gen. En zorg ervoor dat de stam lus structuur van chimeric micro RNA haarspelden bewaard blijft. Met deze methode kunnen we meerdere biologisch actieve microRNA-genen concentreren in zeer korte DNA-sequenties die letterlijk in alle leveringsvectoren voor gebruik van gentherapie kunnen worden gemonteerd.

Deze methode is ideaal om de functionele interactie tussen verschillende micro RNAs te bestuderen en te interfereren met complexe multifactoriële cellulaire trajecten die anders meerdere combinaties van geneesmiddelen vereisen.