Name: Karakterisatie van functioneel geassocieerde Mirnas in glioblastoma en hun engineering in kunstmatige clusters voor gentherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer kunstmatige microRNA-clusters te ontwerpen voor gentherapie in glioblastoma. Deze methode minimaliseert kloneringsstappen en maakt simultane modulatie van meerdere microRNAs mogelijk voor therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de leden van het Harvey Cushing Neuro Oncology laboratorium bedanken voor hun steun en constructieve kritiek. Dit werk werd gesteund door NINDS Grants K12NS80223 en K08NS101091 aan P. P.

1. karakterisering van functioneel geassocieerde miRNAs in glioblastoma
<ol><li>Analyse van de brede differentiële Mirna expressie in multiform glioblastoom vs. hersenen
	<ol>
<li>Bepaal eerst de meest sterk gedereguleerde miRNAs in de tumor. Dit kan worden bereikt met behulp van ten minste drie verschillende methoden:<ol>
<li>Mine de kanker genoom Atlas, gevonden op https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, voor sequencing data11.</li>
			<li>Voer microarray analyse uit van een vers operatief specimen12.</li>
			<li>Gebruik eerder gepubliceerde gegevenssets13. Opmerking: Welke methode er ook wordt gekozen, de output biedt een bulk verzameling miRNAs waarvan de uitdrukking statistisch gecorreleerd is (direct of omgekeerd) met tumor biologie. Deze eerste groep vormt de pool van miRNAs die verder worden geanalyseerd voor de identificatie van een subset van miRNAs die de strengste functionele associatie weergeeft door een meer dynamische analyse van uitdrukkings wijzigingen uit te voeren, zoals hieronder wordt besproken.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Voorwaarde-specifieke miRNA-expressie analyse
	<ol>
<li>Inductie van celdifferentiatie:<ol>
<li>Gebruik pre-Coated poly-D-Lysine (PDL) plastic gerechten om de vorming van een monolaag cultuur te gunst. Voor de afdeklaag, los PDL in water op met een concentratie van 100 μg/mL. Gebruik 1 mL oplossing per 25 cm2 oppervlak. Spoel 2x met PBS 6 h na toepassing van de PDL-oplossing.</li>
			<li>Plaat menselijke neurale stamcellen in gelijke hoeveelheden (100.000 cellen/5 mL) hetzij in stamcel medium (neurobasal medium + B27 supplement + 20 ng/mL EGF/FGF), astrocytische differentiatie medium (DMEM + 10% FBS), of neuronale differentiatie medium (neurobasal medium + B27 supplement, + 2 μM retinoïnezuur)14. Het protocol voor oligodendrocyten differentiatie vereist toevoeging van IGF-1 (200 ng/ml) na EGF/FGF Removal14,15.</li>
			<li>Na celplating, plaats in incubator voor 1 week bij 37 °C, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>RNA-extractie:<ol>
<li>Verwijder na 7 dagen de cellen uit de incubator en verwijder het medium.</li>
			<li>Was de cellen met PBS (5 mL). Voeg vervolgens 1 mL lysisreagens (zie tabel met materialen) toe om de cellen te lyseren en de cellen in 1,5 ml microfugebuis Tube te schrapen met behulp van een celscraper. Houd de buisjes met de gelyseerd-cellen gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT).</li>
			<li>Ga naar totale RNA-isolatie volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		</ol>
</li>
		<li>miRNA expressie analyse:<ol>
<li>Kwantificeer de differentiële uitdrukking van specifieke miRNAs die in stap 1,1 is geïdentificeerd onder de drie differentiatie patronen door real-time PCR, met behulp van TaqMan probes en volgens de protocollen van de fabrikant voor omgekeerde transcriptie en PCR-versterking ( Figuur 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Validatie van miRNA-clusters door stress-specifieke uitdagingen
	<ol>
<li>Cultuur G34 multiform glioblastoom stam-achtige cellen in neurobasal medium + B27 supplement + 20 ng/ml EGF/FGF. Begin met 1 x 106 cellen in 5 ml in een 25 cm2 laag gehechtheid kolf.</li>
		<li>Vanaf 48 h na het beplating, Voeg elke 5 dagen verdubbelde concentraties van DNA alkylerende agent temozolomide (TMZ) toe, als volgt:<ol>
<li>Begin met 5 μM gedurende 5 dagen. Verwijder na 5 dagen het medium en vervang het met vers medium zonder temozolomide, zodat de overgebleven cellen kunnen worden hersteld. Na 48 h, voeg 10 μM TMZ toe en inincuberen voor nog eens 5 dagen.</li>
			<li>Herhaal stap 1.3.2.1, verdubbelde TMZ-concentratie elke keer, totdat een concentratie van ten minste 100 μM is bereikt en cellen resistent worden tegen het medicijn10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>In een parallel experiment, bestraleren G34 cellen als volgt:<ol>
<li>Vanaf 48 h na het bekleden van 1 x 106 cellen in 5 ml in een 25 cm2 laag bevestigingkolf, bestraleren cellen met 2 gie energie (elke irradiator die foonemissie levert, is aanvaardbaar). Retourneer de cellen naar de incubator en niet storen. Na 48 h, bestraleren de cellen opnieuw met extra 2 gie van energie.</li>
			<li>Herhaal stap 1.3.3.1 4x totdat in totaal 10 GY energie wordt toegediend.</li>
			<li>Keer de cellen terug naar de incubator en laat ze gedurende ten minste 5 dagen vóór de downstream-analyse in vers medium herstellen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Na de inductie van resistentie, lyse cellen met lysisreagens en extract totaal RNA volgens het Protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Analyseer de expressie van de specifieke miRNAs die is geïdentificeerd in de paragrafen 1.1-1.2, zoals beschreven in stap 1.2.1 (Figuur 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Karakterisatie van de functionele convergentie van geclusterd miRNAs
	<ol>
<li>Verkrijg de voorspelde targetome van elke miRNAs gedefinieerd in de paragrafen 1.2-1.3 verkregen met behulp van miRNA targeting Voorspellings hulpmiddelen. Opmerking: We in het algemeen toevlucht tot TARGET scan, als het algoritme wordt periodiek bijgewerkt16. Extra Voorspellings hulpmiddelen zijn miRanda17, mirdb18en Diana-mirpath19. Al deze Programma's zijn gratis, web-based applicaties.<ol>
<li>Selecteer op de voor pagina van target scan de miRNA van belang uit het vooraf ingevulde vervolgkeuzemenu. Klik op de knop verzenden .</li>
			<li>Download de resulterende lijst met doelen als een spreadsheet met behulp van de link Download Table (aanvullend figuur 1).</li>
			<li>Als u de kans op vals-positieve voorspellingen wilt verkleinen, neemt u in downstream-analyses alleen doelen op in de kolom geconmageerde sites. Bovendien kan verdere striktheid worden verkregen door het gebruik van extra miRNA Voorspellings programma's (zie hierboven) en alleen met inbegrip van doelen die gemeenschappelijk zijn voor alle algoritmen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Classificeer de resulterende targetomes volgens Genontologie categorieën met behulp van ToppGene Suite20 om te evalueren voor de verrijking van trajecten die gemeenschappelijk zijn voor elke Mirna.<ol>
<li>Plak de lijst met doelen die zijn verkregen uit stap 1.4.1 in het venster "training Gene set", met behulp van HGNC-symbool als het boekingstype. Klik op verzenden > starten. Het programma geeft een uitvoertabel weer met de meest significante "Go"-categorieën voor de ingevoerde lijst met genen (aanvullend figuur 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Om eindelijk de bijdrage van elke miRNA aan de regulering van een gemeenschappelijk traject of cellulair proces vast te stellen (in dit geval chromatide regulatie), controleert u elk in stap 1.4.1 verkregen targetome tegen de volledige lijst van genen die betrokken zijn bij het specifieke cellulaire proces ( dat wil zeggen, chromatine-regeling), met behulp van de Venn-diagramfunctie van de website bioinformatica en evolutionaire Genomics http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn. Opmerking: Dit programma maakt het mogelijk om meerdere groepen tegelijk te doorsnede (Figuur 3). De specifieke unieke doelen die door elke miRNA worden verstrekt, worden vervolgens geannoteerde en geselecteerd voor downstream functionele experimenten.<ol>
<li>Op de voor pagina van het programma, uploaden of kopiëren/plakken van de lijst als doel Mrna's voor elke miRNA of belang in de respectieve vensters. Noem elke lijst een unieke id.</li>
			<li>Klik op verzenden. Het programma zorgt voor een visuele output van een Venn-diagram met aantallen genen in elke sector, evenals een volledige lijst van Mrna's voor elke subset en snij combinaties.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. assemblage van miRNA-modules in een Polycistronic transgene cluster
<ol><li>
Voorbereiding van transgene steiger op basis van miR-17-92 cluster Locus
	<ol>
<li>Verkrijg de nucleotide-sequentie van de miR-17-92-cluster uit de ENSEMBL genoome browser21. Selecteer de ~ 800 basis paar "core" sequentie die alle zes gecodeerde miRNA haarspelden van de Locus en ten minste 200-nucleotide flankerende sequenties zowel upstream (5 ') en downstream (3 ') van de kern sequentie omvat.</li>
		<li>Plak de bovenstaande reeks in een Word-bewerkingsprogramma.</li>
		<li>Definieer de volgorde van elk van de zes native haarspelden door ze op te halen in mirbase22. Markeer elk van deze sequenties binnen de reeks van de eerder geïdentificeerde "core" sequentie. Alle sequenties tussen elke haarspeld vertegenwoordigen spacer sequenties, die belangrijk zijn voor de juiste verwerking van het transgene.</li>
		<li>Verwijder de inheemse haarspeld sequenties uit de "kern" sequentie, met uitzondering van 3-5 nucleotiden op zowel de 5 ' als 3 ' uiteinden van elke haarspeld, die als acceptor voor de nieuwe haarspelden zal dienen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Het bouwen van een nieuwe transgen encoding meerdere miRNAs naar keuze
	<ol>
<li>Verkrijg haarspeld sequenties van miRNAs die bedoeld zijn om te worden overgedruct in het transgen van mirbase. Let goed op de specifieke nucleotiden die de sites van microprocessor decolleté.</li>
		<li>Vervang de verwijderde haarspelden (stap 2.1.4) door de haarspeld sequenties van de gewenste miRNAs, verkregen in stap 2.2.1.</li>
		<li>Voeg de gewenste beperkings sequenties toe aan beide flankerende gebieden van het transgen om het subklonen te faciliteren in de keuze vectoren. Controleer of de gekozen beperkings reeksen niet aanwezig zijn in de volgorde zelf.</li>
		<li>Gebruik voor negatieve controles 20-nucleotide-gecodeerde sequenties om de natuurlijke 20-nucleotide-sequentie van elke volwassen miRNA te vervangen. Genereer deze versleutelde sequenties met een online tool zoals https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Controle van de tweedimensionale structuur van het transgen
	<ol>
<li>Kopieer de volledige transgene sequentie naar het RNA structuur Voorspellings softwareprogramma RNAweb fold23.</li>
		<li>Klik op Doorgaanmet de standaardprogramma-instellingen.</li>
		<li>Analyseer de grafische uitvoer, met name voor de aanwezigheid van goed gedefinieerde haarspelden en de aanwezigheid van dubbel-gestrande stam structuren ten minste 11 nucleotiden proximale naar de microprocessor decolleté site. Kijk ook naar de afwezigheid van vertakkingspunten binnen de haarspeld sequenties (Figuur 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. verkrijgen van transgenen door DNA-synthese
<ol><li>Na het ontwerp en in silico validatie van de chimeer Mirna cluster, verkrijgen van de werkvolgorde met behulp van DNA-synthese van commerciële leveranciers24 en verder met downstream klonen in vectoren en transgen levering. We hebben lentivirale vectoren gebruikt voor in vitro levering10 en adeno-geassocieerde virussen (aavs) voor in vivo intracraniële levering25.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li>
<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li>
<li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer%27s+Disease%3A+A+Meta-Analysis+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767(2018).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciencesof+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li>
<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs%3A+tiny+regulators+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li>
<li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li>
<li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124%2C+%E2%88%92128%2C+and+%E2%88%92137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li>
<li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442(2019).</li>
<li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li>
<li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li>
<li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li>
<li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).</li>
<li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005(2015).</li>
<li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miRNA.org+resource%3A+targets+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li>
<li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRD%28B%29+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li>
<li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIANA-miRPath+v3.0%3A+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li>
<li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembl+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li>
<li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+from+miRNA+sequences+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li>
<li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vienna+RNA+Package+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).</li>
<li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly%3A+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).</li>
<li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li>
<li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li>
<li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li>
<li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li>
<li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).</li>
<li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li>
</ol>

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Dit protocol is gebaseerd op het idee dat, in plaats van te functioneren in afzondering, miRNAs biologisch relevant is door in groepen te werken, en deze groepen worden transcriptioneel bepaald door specifieke cellulaire contexten26. Om deze benadering vanuit een translationeel perspectief te rechtvaardigen, wordt een follow-up protocol geïntroduceerd dat het mogelijk maakt dit multi-miRNA-patroon in cellen/weefsels te recreëren. Dit is mogelijk door gebruik te maken van de relatief eenvoudige bio...

miRNAs biedt een ongeëvenaarde kans voor de ontwikkeling van een brede gentherapie benadering van vele ziekten1,2,3, waaronder kanker4,5. Dit is gebaseerd op een aantal unieke kenmerken van deze biologische moleculen, met inbegrip van hun kleine maat6, eenvoudige biogenese7, en natuurlijke neiging om te functioneren in vereniging8. Veel ziekten worden gekenmerkt door specifieke miRNA-expressie patronen, die vaak convergeren over de regulering van complexe biologische functies9. Het doel van deze methode is om eerst een strategie te definiëren om groepen van miRNAs te identificeren die synergetisch relevant zijn voor specifieke cellulaire functies. Bijgevolg biedt het een strategie voor het opnieuw opzetten van dergelijke miRNA-combinaties in downstreamstudies en toepassingen.
Deze methode maakt functionele analyse van meerdere Mirna's tegelijk mogelijk, gebruikmakend van hun gelijktijdige targeting van een groot aantal Mrna's, waardoor de complexe landschappen van ziekten worden samengevat. Deze aanpak is onlangs gebruikt om een groep van drie Mirna's te definiëren die 1) gelijktijdig worden gedowngereguleerd in hersenkanker en 2) vertonen een sterk co-expressie patroon tijdens Neurale differentiatie, evenals in reactie op genotoxische stress door straling of een DNA alkylerende agent. De combinatorische re-expressie van deze module van drie miRNAs door de hieronder beschreven clustering methode resulteert in diepgaande interferentie met de biologie van kankercellen en kan gemakkelijk worden gebruikt als een gentherapie strategie voor preklinische studies10. Dit protocol kan van bijzonder belang zijn voor degenen die betrokken zijn bij het onderzoek van miRNA en de translationele toepassingen ervan.

<table><tbody><tr><td>0.4% low melting temperature agarose&nbsp;</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70058</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;M sterile filter unit</td><td>Merck Millipore</td><td>SLH033RS</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>6-Well plates&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Athymic mice (FoxN1 nu/nu)</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper, 16cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Cesium 137 irradiator&nbsp;</td><td>JL Sheperd and Associates</td><td>Core Facility (Harvard Medical School)</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439142-4L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s phosphate-buffered saline&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1051750500</td><td></td></tr><tr><td>Human primary glioma stem-like cells (GBM62)</td><td></td><td></td><td>Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women&rsquo;s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Human primary glioma stem-like cells (MGG4)</td><td></td><td></td><td>Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td><td>System Biosciences</td><td>CD511B-1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge refrigerated</td><td>Eppendorf</td><td>model no. 5424 R, cat. no.5404000138</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4112APG</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>Neural Progenitor cells (NPC)</td><td></td><td></td><td>Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women&rsquo;s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system</td><td>Nikon, Japan</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6571-960EA</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Petri-Dishes 94/16&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human EGF&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-basic&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Gibco</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA Miniprep Kit</td><td>Direct-zol</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Thermal Cycler&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Small Animal Image-Guided Micro Irradiator&nbsp;</td><td>Xstrahal Life Sciences, UK</td><td>Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>75000100</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td>4376357</td><td></td></tr><tr><td>SterilGARD biosafety cabinet&nbsp;</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>T98-G</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Temozolomide</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek optimum cutting temperature&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9636948</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Lysis reagent</td></tr><tr><td>U251-MG</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>U87-MG&nbsp;</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>ViraPower Lentivector Expression system&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K4970-00</td><td></td></tr><tr><td>Water, HPLC grade</td><td>Fisher</td><td>W54</td><td></td></tr><tr><td>Xylene&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

karakterisatie van functioneel geassocieerde mirna's in glioblastoma en hun engineering in kunstmatige clusters voor gentherapie

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

De biologische relevantie van microRNAs (miRNAs) in gezondheid en ziekte is sterk afhankelijk van specifieke combinaties van veel gelijktijdig gedereguleerde miRNAs in plaats van de werking van een enkele miRNA. De karakterisering van deze specifieke miRNAs-modules is een fundamentele stap om het gebruik ervan in de therapie te maximaliseren. Dit is uitermate relevant omdat hun combinatorische attributen praktisch uitgebuit kunnen worden. Hier beschreven is een methode om een specifieke Mirna-handtekening te definiëren die relevant is voor de controle van oncogene chromatine-van in glioblastoma. De aanpak definieert eerst een algemene groep van miRNAs die zijn gedereguleerd in tumoren in vergelijking met normaal weefsel. De analyse wordt verder verfijnd door differentiële cultuuromstandigheden, waarbij een subgroep van Mirna's wordt onderstreept die gelijktijdig worden uitgedrukt tijdens specifieke cellulaire toestanden. Ten slotte worden de miRNAs die aan deze filters voldoet, gecombineerd tot een kunstmatige polycistronic transgenes, die is gebaseerd op een steiger van natuurlijk bestaande miRNA clusters genen, vervolgens gebruikt voor overexpressie van deze miRNA modules in ontvangende cellen.

Deze methode toegestaan karakterisatie van een module van drie miRNAs die consequent worden gedowngereguleerd in hersentumoren, die zijn mede-uitgedrukt specifiek tijdens neuronale differentiatie (Figuur 1) en betrokken bij de tumor Survival reactie na therapie (Figuur 2). Dit wordt bereikt door het reguleren van een complexe oncogene chromatine repressieve traject. Dit co-expressie patroon suggereerde een sterke synergetische ac...

Hier beschreven is een protocol voor het karakteriseren van modules van biologisch synergetische miRNAs en hun assemblage in korte transgenen, waardoor gelijktijdige overexpressie voor gentherapie toepassingen mogelijk is.

Karakterisatie van functioneel geassocieerde Mirna's in glioblastoma en hun engineering in kunstmatige clusters voor gentherapie

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Dit protocol maakt de gelijktijdige modulatie van vele micro RNAs in eukaryotische cellen mogelijk en is gebaseerd op een zeer eenvoudige en flexibele methode die moleculaire kloonstappen minimaliseert. Deze techniek heeft implicaties voor de studie van micro RNA functionele interacties in vitro, maar nog belangrijker het biedt een platform voor een effectiever gebruik van micro RNAs in therapie. We hebben het voornamelijk ontwikkeld en gebruikt in het kader van hersenkanker, maar het is van toepassing op ziekten waarbij meerdere veranderingen van genexpressie betrokken zijn.We hebben onze kunstmatige transgenen getest in andere modellen zoals borst- en schildklierkankerlijnen die de reproduceerbaarheid van deze techniek laten zien. Basiskennis van bio-informatica en micro RNA biologie is nuttig voor dit protocol, maar niet onmisbaar. Een bioinformatica benadering is belangrijk om relevante micro RNA combinaties en de TRK-11 te definiëren, terwijl vertrouwdheid met de micro RNA verwerking meetbaar is belangrijk om te begrijpen hoe deze verschillende micro RNAs kunnen worden geassembleerd in kunstmatige DNA-clusters die met succes kunnen worden verwerkt zodra stabiel om de specifieke cellen.Om schotel te coaten, los eerst poly-D-lysine op in water met een concentratie van 100 microgram per milliliter. Giet de oplossing in de schotel op de hoeveelheid van een milliliter oplossing per 25 vierkante centimeter oppervlak. Draai de schotel om ervoor te zorgen van de dekking van de hele schotel.Na zes uur de poly-D-lysine oplossing aanzuigen en twee keer spoelen met PBS. Plaat menselijke neurale stamcellen in de hoeveelheid van 100.000 cellen per vijf milliliter van het medium, hetzij in stamcelmedium, astrocytische differentiatie medium of neuronale differentiatie medium. Na celbeplating, plaats de schotel in een incubator op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide voor een week en ga verder met het uitvoeren van micro RNA expressie analyse volgens het manuscript.Om gbm-34 glioblastoom stamachtige cellen te kweken, begin met één keer tien tot de vijfde cellen en vijf milliliter neurobasaal medium in een 25 vierkante centimeter lage bevestigingskolf. Plaats de kolf in een couveuse op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide. Voeg 48 uur na het beplating elke zeven dagen een verdubbeling van de concentraties DNA-alkylatingmiddel temozolomide toe.Begin met toevoeging van vijf micromolar TMZ aangevuld in vijf milliliter medium gedurende vijf dagen. Na vijf dagen verwijdert u het medium en vervangt u het door vers medium zonder temozolomide om de overlevende cellen te laten herstellen. Voeg na 48 uur 10 micromolar temozolomide toe en incubeer nog eens vijf dagen.Herhaal de verdubbeling van de temozolomide behandeling totdat de concentratie van ten minste 100 micromolar is bereikt en cellen resistent worden tegen het medicijn. Na de inductie van resistentie, liggen cellen met behulp van 1 milliliter van Lysis reagens. Haal het totale RNA eruit en analyseer de expressie van de specifieke micro RNAs volgens het manuscript.Gebruik micro RNA-targetingvoorspellingstools om het voorspelde doelomeen van elk micro-RNA dat eerder is gedefinieerd te verkrijgen. Selecteer op de voorpagina van TargetScan het micro-RNA van belang in het vooraf ingevulde vervolgkeuzemenu. Klik op verzenden.Download de resulterende lijst met doelen als spreadsheet via de koppeling downloadtabel. Als u de kans op fout-positieve voorspellingen wilt verkleinen, omvat u alleen doelen binnen de kolom behouden sites en downstream-analyse. Aanvullende micro-RNA-voorspellingsprogramma's verkrijgen verdere stringentie en bevatten alleen doelen die voor alle algoritmen gebruikelijk zijn.Open vervolgens ToppGene suite 20. Om te evalueren voor de verrijking van trajecten die gemeenschappelijk zijn voor elk micro-RNA, plakt u de lijst met doelen die zijn verkregen in het venster van het trainingsgensets. Klik op HGNC-symbool als invoertype.Klik op verzenden en begin. Het programma biedt een uitvoertabel met de belangrijkste GO-categorieën voor de ingevoerde lijst met genen. Om eindelijk de bijdrage van elk micro-RNA aan de regulering van een gemeenschappelijk traject of cellulair proces vast te stellen, opent u de venn-diagramfunctie die wordt geleverd in de website Bioinformatica en Evolutionair Genomics.Controleer elk verkregen targetoom aan de hand van de volledige lijst van genen die betrokken zijn bij het specifieke cellulaire proces. Als doel messenger RNAs voor elke micro RNAs van belang zijn in de respectieve vensters, uploaden van copy-paste de lijst. Noem elke lijst met een unieke id.Klik op verzenden. Het programma biedt een visuele uitvoer van een venn-diagram met aantallen genen in elke sector, evenals een volledige lijst van messenger RNAs voor elke subset en kruispunt combinaties. Om de geselecteerde micro RNAs te groeperen in een functioneel transgen, verkrijg je een transgeen steiger op basis van de miR-17-92 cluster locus.Verkrijg de nucleotidesequentie uit de ensembled genome browser. Selecteer de ongeveer 800 basispaar kern sequentie omvat alle zes gecodeerde micro RNA haarspelden van de locus en ten minste 200 nucleotide flankerende sequenties zowel stroomopwaarts als stroomafwaarts van de kern sequentie. Plak de reeks in een tekstbewerkingsprogramma.Definieer de volgorde van elk van de zes inheemse haarspelden door ze op te halen in miR-basis. Markeer elk van deze sequenties binnen de reeks van eerder geïdentificeerde kernreeks. Alle sequenties tussen elke haarspeld vertegenwoordigen spacer sequenties.Vervolgens verkrijgen van de haarspeldopeenvolgingen van micro RNAs bedoeld om over uitgedrukt in het trans-gen van miR basis. Let zorgvuldig op de specifieke nucleotiden die zich op de plaatsen van microprocessor decolleté bevinden. Verwijder de inheemse haarspeldopeenvolgingen uit de kernvolgorde met uitzondering van drie tot vijf nucleotiden aan zowel de vijf als de uiteinden van elke haarspeld die als acceptor voor de nieuwe haarspelden zullen dienen.Plak de haarspeldsequenties van de gewenste micro RNAs om de eerder verwijderde haarspelden te vervangen. Voeg gewenste beperkingssequenties toe aan beide flankerende gebieden van het transgen om sub klonen in naar keuze te maken van leveringsvectoren. Controleer of de gekozen beperkingssequenties niet aanwezig zijn in de reeks zelf.Als u de tweedimensionale structuur van het transgen wilt verifiëren, kopieert u de volledige transgene sequentie in het RNA-structuurvoorspellingssoftwareprogramma RNA Webfold. Selecteer standaardprogramma-instellingen en klik op Doorgaan. Analyseer de grafische output, met name voor de aanwezigheid van goed gedefinieerde haarspelden in aanwezigheid van dubbelstrengs stengelstructuren die ten minste 11 nucleotiden proximaal zijn voor de microprocessordecolletésite.Zoek ook naar de afwezigheid van vertakkingspunten binnen de haarspeldopeenvolgingen. Op dit punt is het trans-gen klaar om te worden geproduceerd door gensynthese en gekloond in de gewenste toedingsvectoren. Deze methode toegestaan karakterisering van een module van drie micro RNAs die consequent naar beneden geregeld in hersentumoren, die specifiek worden uitgedrukt tijdens neuronale differentiatie.Co-expressie patronen van micro RNA modules tijdens genotoxische stress werden bevestigd en suggereerde een sterke synergetische activiteit onder deze drie micro RNAs. Het ontworpen transgen kan tegelijkertijd de expressie van de drie micro RNAs in glioblastoomcellen samenvatten, zowel in vitro als in vivo, met significante interferentie in tumorbiologie en veelbelovende translationele toepasbaarheid. Daarnaast was het transgene cluster ook functioneel in een borstkankermodel.De cruciale vereisten van dit protocol zijn het behoud van de oorspronkelijke grootte van de processor decolleté in het trans-gen. En zorg ervoor dat de stam lus structuur van chimeric micro RNA haarspelden bewaard blijft. Met deze methode kunnen we meerdere biologisch actieve microRNA-genen concentreren in zeer korte DNA-sequenties die letterlijk in alle leveringsvectoren voor gebruik van gentherapie kunnen worden gemonteerd.Deze methode is ideaal om de functionele interactie tussen verschillende micro RNAs te bestuderen en te interfereren met complexe multifactoriële cellulaire trajecten die anders meerdere combinaties van geneesmiddelen vereisen.

characterization-functionally-associated-mirnas-glioblastoma-their

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier beschrijven we een efficiënt en veelzijdig protocol om nieuwe glioblastoma (GBM) te induceren, monitoren en analyseren met behulp van transposon DNA dat in de ventrikels van neonatale muizen wordt geïnjecteerd. Cellen van de subventriculaire zone, die het plasmide opnemen, transformeren, prolifereren en genereren tumoren met histo-pathologische kenmerken van menselijk GBM.

Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer

MicroRNA's spelen een cruciale rol in de hersenen en zijn potentiële doelen voor het modelleren van neurodegeneratie. Het verstoren van miRNA-niveaus is echter een uitdaging vanwege de korte lengte van miRNA en de ontoegankelijkheid van hersenweefsel. Deze video presenteert een methode voor het ontwerpen van antagomir en specifieke levering aan de hersenen met behulp van een neuropeptide bij muizen.

Een eenvoudig alternatief voor stereotactische Injectie voor Brain Specifieke Knockdown van miRNA

Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

miRNA therapeutics hebben aanzienlijke potentieel bij het reguleren van de progressie van kanker. Hier gedemonstreerd worden analytische benaderingen gebruikt voor de identificatie van de activiteit van een combinatorische miRNA behandeling in het stoppen van de celcyclus en angiogenese.

Analyse van combinatoriële miRNA behandelingen te reguleren celcyclus en angiogenese

Dit protocol maakt gebruik van een sonde-gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), een sulforhodamine B (SRB) Assay, 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) klonen, en een plaats assay om de doel genen van een Mirna van belang te controleren en om de functies van miRNAs te begrijpen.

Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

Laser microdissectie (LMD) is een gevoelige en zeer reproduceerbare techniek die kan worden gebruikt om paden die glioom heterogeniteit en invasie te bemiddelen blootleggen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om discrete gebieden te isoleren van glioomweefsel met behulp van laser LMD, gevolgd door transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Proteomische ontregeling speelt een belangrijke rol bij de verspreiding van diffuus infiltrerende gliomen, maar verschillende relevante eiwitten blijven ongeïdentificeerd. Digitale ruimtelijke verwerking (DSP) biedt een efficiënte, high-throughput benadering voor het karakteriseren van de differentiële expressie van kandidaat-eiwitten die kunnen bijdragen aan de invasie en migratie van infiltratieve gliomen.

Digitale ruimtelijke profilering voor karakterisering van de micro-omgeving in diffuus infiltrerend glioom van het volwassen type

Dit protocol beschrijft een high-throughput clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR) genbewerkingsworkflow voor microRNA-clusternetwerkanalyse die de snelle generatie van een panel van genetisch gemodificeerde cellijnen met unieke miRNA-clusterliddeletiecombinaties zo groot als 35 kb binnen een enkel experiment mogelijk maakt.

CRISPR Gene Editing Tool voor MicroRNA Cluster Network Analyse

De bloed-hersenbarrière is een belangrijke hindernis bij het toedienen van therapieën voor glioblastoom, een ziekte waarvoor geen genezing bestaat. Hier rapporteren we een in vivo beeldgeleid therapeutisch nanoplatform voor ijzeroxide dat deze fysiologische barrière kan omzeilen op grond van de grootte en zich kan ophopen in de tumor.

Levering van nanodeeltjes van een oligonucleotidelading in een glioblastoom multiforme diermodel

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer kunstmatige microRNA-clusters te ontwerpen voor gentherapie in glioblastoma. Deze methode minimaliseert kloneringsstappen en maakt simultane modulatie van meerdere microRNAs mogelijk voor therapeutische toepassingen.

Karakterisatie van functioneel geassocieerde Mirna's in glioblastoma en hun engineering in kunstmatige clusters voor gentherapie

Meer video's verkennen