Evaluatie van de differentiatie capaciteit van muizen prostaat epitheelcellen met behulp van Organoid cultuur

Het 3D-organoïde systeem wordt beschouwd als meer fysiologisch relevant dan 2D-tests, en het kan waardevolle informatie over de biologie die anders zou een uitdaging om te verwerven. Dit is een aanpasbaar systeem waar we farmacologische en genetische manipulaties kunnen testen met minder tijd en aanzienlijk lagere kosten dan met behulp van een in vivo benadering. Matrix trial is erg lastig te hanteren, omdat het stolt wanneer het kamertemperatuur bereikt.

Het kan alleen worden getrokken door een pipet als het vloeibaar is en moet worden gehandhaafd op ijs. De integriteit van de ring is belangrijk om te onderhouden. Als de structuur wordt verstoord, kan dat de opbouw negatief beïnvloeden en u gemakkelijk materiaal verliezen bij het veranderen van media.

Begin deze procedure met de voorbereiding van basale en luminale prostaateppiratale cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Was de celpellet in 500 microliter van muis organoïde media en schort de pellet opnieuw op bij een celdichtheid van 1.000 cellen per microliter. Om master mixen voor te bereiden, meng epitheliale cellen opgehangen in muis organoïde media met matrix gel om een uiteindelijk mengsel dat 25% cellen in de media en 75% matrix gel bevat genereren.

Afhankelijk van de downstream-toepassing worden basale cellen meestal verguld met een concentratie van 100 tot 2.000 cellen per 80 microliter, terwijl luminale cellen worden verguld met een concentratie van 2.000 tot 10.000 cellen per 80 microliter. Voeg voor elk celmengsel 80 microliter van de matrixgel per put van een 24-putplaat toe. Pipette een druppel op de onderste helft van de wand van de put, terwijl het vermijden van direct contact met de poly-hema coating.

Na het toevoegen van de matrix gel, draai de plaat om de matrix gel cel mengsel om een ring rond de rand van de put te vormen. Plaats de 24-well plaat in een 37-graden Celsius, 5%C02 incubator rechterkant gedurende 10 minuten om de matrix gel gedeeltelijk te laten uitharden. Na 10 minuten uitbroeden, draai je de 24-put plaat ondersteboven en incubbate nog eens 50 minuten om de matrixgel volledig te laten uitharden.

Voeg vervolgens 350 microliters van voorverwarmde muisorganoïde media drop-wise toe aan het midden van elke put. Na het toevoegen van de media, terug de 24-well plaat naar de incubator. Om muis organoïde media aan te vullen, kantel de 24-well plaat in een hoek van 45 graden, en voorzichtig verwijderen bestaande media uit het midden van elke put met behulp van een P1000 pipet terwijl het vermijden van de matrix gel ring.

Voeg 350 microliter voorverwarmde muisorganoïde media toe als voorheen. Het wordt aanbevolen om een groter volume media toe te voegen aan organoïden die langer dan vijf dagen worden gekweekt om snelle uitputting van belangrijke voedingsstoffen en groeifactoren te voorkomen. Verwijder de media uit elke put als voorheen.

Om organoïden te verzamelen, herhaaldelijk blast de matrix gel door pipet een milliliter van voorverwarmde dispase-bevattende media direct op de matrix gel ring totdat de hele ring is losgemaakt. Breng de losgemaakte matrix gel organoïde mengsel naar een 1,5-milliliter microcentrifuge buis. Na volledige spijsvertering zoals beschreven in het tekstprotocol, voeg fosfaat gebufferde zoutoplossing toe aan de organoïde pellet en schort opnieuw op door zachtjes te bewegen.

Pellet de organoïden door centrifugatie op 800 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, en verwijder de supernatant met behulp van een micro-pipet. Schort de organoïde pellets opnieuw op in 100 microliter eiwitlysebuffer per 10 microliter verpakt celvolume. Veeg om opnieuw op te schorten.

Nu, sonicate de organoïden door het onderdompelen van buizen in nat ijs en voorzichtig het aanbrengen van het puntje van de sonische dismembrator aan de buitenkant van de microcentrifuge buis. Sonicaat gedurende 40 seconden op 20 kilohertz voordat u doorgaat naar western blotting met vastgestelde protocollen. Om prostaatorganoïden te verzamelen uit de 24-well platen, verwijder de media uit elke goed als voorheen.

Verter de matrixgel door 500 microliter dispase-bevattende media gedurende 30 minuten te uitbroeden in een 37-graden Celsius, 5%CO2 incubator. Verzamel verteerde organoïde suspensie in een microcentrifugebuis. Dan, pellet de organoïden door centrifugatie op 800 keer G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur, en verwijder de supernatant.

Om holofluorescente kleuring van prostaatorganoïden in het geheel te monteren, voeg u eerst 500 microliter van 4% paraformaldehyde toe in PBS. Broed de organoïden twee uur lang bij kamertemperatuur met zacht schudden. Na het wassen van de pellet zoals beschreven in het tekstprotocol, voeg een microgram per milliliter DAPI-vlek in blokkeren oplossing, en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur.

Bescherm het monster tegen licht tijdens incubatie tegen deze stap voorwaarts. Na centrifugatie van de organoïden als voorheen, voeg primaire antilichaam in blokkeren oplossing en incubeer 's nachts op vier graden Celsius met zachte schudden. Pellet de organoïden weer, en was de pellet met een milliter PBS gedurende 15 minuten met zachte schudden.

Herhaal deze wasprocedure twee keer. Voeg vervolgens secundair antilichaam in het blokkeren van oplossing, en incubeer 's nachts op vier graden Celsius met zachte schudden. Na incubatie, pellet de organoïden, en was de pellet voor een extra twee keer.

Voeg een milliliter van 30% sacharose in PBS met 1%Triton X-100 toe aan de pelleted organoïden. Dan incubeer voor twee uur bij kamertemperatuur met zachte schudden. Na het pelleteren van de organoïden weer, voeg een millimeter van 45%sucrose in PBS met 1%Triton X-100, en zachtjes schudden gedurende twee uur bij kamertemperatuur.

Herhaal vervolgens de procedure, behalve voeg een milliliter van 60% sacharose toe in PBS met 1%Triton X-100. Pellet de organoïden door centrifugatie op 800 keer G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur, en verwijder 95% van de supernatant. Observeer de pellet onder UV-licht om te bevestigen dat het niet verloren is gegaan tijdens het verwijderen van de supernatant.

De pellet wordt losser naarmate de concentratie sacharose hoger wordt. Breng 10 tot 20 microliter van de resterende suspensie over naar een chambered coverslip en ga naar confocale microscopie. Basale en luminale cellen vormen organoïden met verschillende morfologieën.

Terwijl de meeste basale organoïden zijn vergelijkbaar in grootte na zeven dagen in de cultuur, luminal-afgeleide organoïden vertonen significante heterogeniteit. Bovendien bevatten de meeste basale organoïden lumen omgeven door meerlaags epitheel, terwijl luminal-afgeleide organoïden variëren in morfologie van hol met single-layered epitheel tot vast met meerlaagse koorden van cellen die niet kanaliseren. Westerse vlek analyse bleek dat basale en luminal-afgeleide organoïden behouden functies in verband met basale en luminale primaire cellen.

Basale organoïden drukken hogere niveaus van de basale marker cytokeratine 5 uit, terwijl luminale organoïden hogere niveaus van de luminale marker cytokeratine 8 uitdrukken. Zowel basale als luminale markers werden gedetecteerd in basale en luminale afgeleide organoïden in de bulkpopulatie, misschien suggestief voor differentiatie. Basale organoïden bevatten gelaagd epitheel, waarbij buitenste lagen hoge niveaus van de basale marker p63 uitdrukken en binnenlagen met niet-detecteerbare niveaus.

Buitenste lagen drukken ook matige niveaus van de luminale marker cytokeratine 8, en binnenlagen hebben hoge niveaus. Terwijl alle cellen in single-layer luminal-afgeleide organoïden positief vlekken op cytokeratine 8, alleen selecteren cellen opgenomen nucleaire p63. Zorg moet worden genomen bij het hanteren van matrixgel om ervoor te zorgen dat het niet verhardt voorafgaand aan het plating cellen in de organoïde cultuur.

DAPI gebruikt voor microscopie kan leiden tot huidirritatie. UV-licht kan ook schadelijk zijn. Adequate persoonlijke beschermingsmiddelen zijn essentieel.

We kunnen RNA verzamelen van organoïden om RNA-sequencing uit te voeren, wat ons zal vertellen over hoe genexpressieprofielen veranderen tijdens organoïde vorming of in reactie op manipulatie. Dit model heeft het prostaatveld in staat gesteld om een reproduceerbare ex vivo test te hebben om fundamentele aspecten van epitheliale biologie te bestuderen en regelgevers in ontwikkeling en differentiatie te identificeren.