Name: Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargos in astrocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Leer live-cell imaging voor intracellulair transport van organellen in murine astrocyten. Deze methode analyseert deeltjesdynamica en cargo-motiliteit in neuronale cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DNL werd gesteund door de University of North Carolina op Chapel Hill (UNC) school of Medicine als Simmons-geleerde. TWR werd ondersteund door UNC PREP Grant R25 GM089569. Werk met behulp van de UNC Neuroscience Center microscopie kern faciliteit werd ondersteund, gedeeltelijk, door financiering van de NIH-NINDS Neuroscience Center ondersteuning Grant P30 NS045892 en de NIH-NICHD intellectuele en ontwikkelingsstoornissen Research Center ondersteuning subsidie U54 HD079124.

Alle dier procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Universiteit van North Carolina bij Chapel Hill Animal Care and use Committee (IACUC).
1. hersen dissectie en cultuur van primaire muis astrocyten
Opmerking: het volgende protocol is aangepast aan de gepubliceerde methoden, die de oorspronkelijke procedure volgt die is ontwikkeld door McCarthy en devellis13,14,15. Gemengde celculturen van McCarthy/deVellis (MD) astrocyten worden bereid uit postnatale dag 2 − 4 (P2 − P4) muis cortices, behandeld met een anti-mitotische factor, en gezuiverd tot de uiteindelijke verrijkte astrocyten cultuur. Vier cortices van muis pups van beide seks zijn voldoende om één T75 weefselcultuur kolf cultuur te genereren.
<ol><li>Mantel de bodem van T75 kolven (100% schuine halsopening, 0,22 μm hydrofoob ventilerende filter dop) met poly-D-Lysine (1 mg/mL in 0,1 M Tris-buffer, pH 8,5) en incuberen bij 37 °C gedurende 24 uur vóór aanvang van de dissectie.</li>
	<li>Voor aanvang van de dissectie procedure, warm 30 mL van de astrocyten kweekmedia (Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium [DMEM] hoge glucose, 10% warmtegeïnactiveerd foetaal serum, 1% peniciloot/streptomycine) bij 37 °C en ontdooit een 5 mL aliquot van 2,5% trypsine op ijs. Bereid twee ontsneden gerechten (60 mm diameter) op ijs gevuld met 6 mL van de gebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS) zonder CA2 + of mg2 +.</li>
	<li>Desinfecteer alle chirurgische hulpmiddelen (fijne punt pincet, ontleed schaar, vannas schaar recht, Graefe pincet met gebogen uiteinden) in 70% ethanol vóór en tussen elke sectie.</li>
	<li>Spuit het hoofd en de nek van de P2 − P4 muis pups met 70% ethanol voordat u ze snel euthanateren door het onthoofding met een chirurgische schaar. Voer een posterieure van anterieure middellijn incisie langs de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen. Snijd de schedel voorzichtig van de nek naar de neus.</li>
	<li>Voer twee extra laterale incisies superieur aan de ogen. Gebruik fijne pincet om de schedel kleppen voorzichtig naar de zijkant te draaien. Verwijder de hersenen en plaats deze in de eerste ontleden Dish gevuld met ijskoude HBSS zonder CA2 + of mg2 +. Houd het gerecht op ijs en ga verder met het oogsten van de rest van de hersenen. Opmerking: Voer de rest van de dissectie procedure uit onder een ontleed bereik.</li>
	<li>Verwijder de olfactorische bollen met Vannas schaar of fijne pincet (Figuur 1AI). Met de gebogen punt Tang op het snijpunt van de dwars-en interhemiferische kloven, plaatst u zachtjes een tweede paar gebogen punt Tang tussen de cortex en diencephalon, waarbij u langzaam de Tang opent om de hersenhelften van de rest van de hersenen (Figuur 1AII, AIII). Verwijder het ongewenste weefsel (Figuur 1AIV).</li>
	<li>Voor elke corticale hemisfeer, verwijder voorzichtig de hersenvliezen met fijne tip pincet. Verwijder desgewenst de hippocampus van de cortices. Breng de ontleed muis cortices over in een tweede gerecht gevuld met ijskoude HBSS zonder CA2 + of mg2 + en houd het op ijs terwijl de overgebleven hersenen worden ontleed. Opmerking: Voer de volgende stappen onder aseptische omstandigheden uit in een laminaire stroom afzuigkap.</li>
	<li>Snijd de ontsneden cortices in kleine stukjes (ongeveer 2 − 4 mm) met behulp van steriele scherpe chirurgische schaar of een scalpel. Breng het ontleed weefsel over in een conische buis van 50 mL met enzym oplossing (22,5 mL HBSS zonder CA2 + of mg2 +, 2,5 ml 2,5% trypsine). Incuberen bij 37 °C gedurende 30 minuten met zachte inversie elke 10 min.</li>
	<li>Verzamel het verteerde weefsel door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten en verwijder de enzym oplossing door decantatie (gebruik geen vacuüm aspirator). Voeg 10 mL astrocyten kweekmedia toe en dissocieren het weefsel in afzonderlijke cellen door de oplossing 20 − 30x te pipetteren met behulp van een serologische Pipet van 10 mL.</li>
	<li>Filtreer de celsuspensie door een 70 μm celzeef om celklonten en onverteerd weefsel te minimaliseren. Vang het filtraat op in een schone 50 mL conische buis en stel het totale volume in op 20 mL met astrocyten kweekmedia. Evalueer op dit punt de efficiëntie van de corticale dissociatie door 10 μL celsuspensie te mengen met 10 μL trypaan blauw en cellen te tellen met een hemocytometer. Opmerking: een preparaat van vier P2 − P4 muis cortices levert 10 − 15 x 106 enkelvoudige cellen op.
</li>
	<li>Aspireren de poly-D-Lysine coating oplossing uit de T75 cultuur kolven en was tweemaal met steriel water. Plaat de 20 mL celsuspensie en incuberen bij 37 °C en 5% CO2.</li>
</ol>2. zuivering en instandhouding van de astrocyten culturen
Opmerking: Voer alle media wijzigingen uit onder aseptische omstandigheden in een laminaire stroom afzuigkap met behulp van steriel gefilterd (0,22 μm filtermembraan) astrociet-media opgewarmd tot 37 °c.
<ol><li>Vervang de celmedia 48 h na plating (dag in vitro 2, DIV2).</li>
	<li>Op DIV5, vervang de media met verse astrociet cultuur media aangevuld met 10 μM Cytosine uracilarabinoside (araC). Opmerking: deze stap vergemakkelijkt het verwijderen van verontreiniging cellen, waaronder fibroblasten en andere gliacellen. Het is belangrijk om de culturen met AraC niet langer dan 48 uur te behandelen, omdat een langere incubatietijd de levensvatbaarheid van astrocyten vermindert.</li>
	<li>Op DIV7, verander media naar astrociet cultuur media zonder araC en begin met het controleren van de cultuur confluentie dagelijks. Zodra de cellen 80% samenvloeiing hebben bereikt, worden twee-T75 kolven voor elke niet-gezuiverde astrociet cultuur kolf met poly-D-Lysine en geïninbroed bij 37 °c gedurende ten minste 8 uur tot 's nachts.</li>
	<li>De volgende dag, begin de astrocyten zuivering door het schudden van de kweek kolven bij 180 rpm gedurende 30 min in een 37 °C orbitaal schudden incubator. Verwijder de media en vervang deze door verse astrocyten kweekmedia. Schud cellen bij 240 rpm gedurende 6 uur in een 37 °C orbitale schud incubator. Prewarm 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), astrocyten kweekmedia en 0,25% trypsine-EDTA tot 37 °C 20 − 30 min voor het einde van de schud periode. Opmerking: er is geen co2-incubatie vereist tijdens de schud stappen. Indien gewenst, de media verzameld na de 30-min en 6-h schudden stappen kunnen worden gebruikt voor het kweken van Microglia en oligodendrocyten, respectievelijk. AraC behandeling van de gemengde cultuur zal echter de overvloed van de andere gliacellen verminderen.</li>
	<li>Verwijder de kweek kolven uit de shaker en vervang de media onmiddellijk door 10 mL warme 1x PBS per kolf. Verwijder PBS en voeg 3 mL 0,25% trypsine-EDTA per kolf toe. Inincuberen bij 37 °C en 5% CO2, elke 5 min controleren op loslating.</li>
	<li>Zodra de cellen uit de kolf zijn losgemaakt, moet u trypsinoisatie stoppen door 10 mL astrocyten kweekmedia toe te voegen. Breng losgekoppelde astrocyten over in een conische buis en pellet cellen van 50 mL door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min. aspirate supernatant en re-Suspendeer de cellen in 40 ml van de astrocyten cultuur media.</li>
	<li>Was de poly-D-Lysine-gecoate T75 kolven tweemaal met steriel water en plaat 20 mL van de gezuiverde astrocyten suspensie. Keer terug naar de incubator 37 °C en 5% CO2 . Verander de Astrocyt cultuur media om de twee dagen voor nog eens 10 dagen totdat astrocyten volwassen zijn. Opmerking: elke T75 kolf van gezuiverde astrocyten moet voldoende zijn om 2 nieuwe T75 kolven met 3 x 105 cellen bij het beplating te produceren.</li>
	<li>Herhaal stap 2.5 − 2.7 voor latere stadia of voor het plaat astrocyten voor microscopie. NB: de zuiverheid van de astrocyten culturen na de toevoeging van AraC en na zuivering kan kwalitatief worden beoordeeld door middel van brightfield microscopie, of meer bepaald door het percentage van gliacellen fibrylzuur proteïne (GFAP)-positief te kwantificeren cellen per gezichtsveld in fluorescerende afbeeldingen (Figuur 1B, C).</li>
</ol>3. transfectie van fluorescendig gelabelde plasmiden
<ol><li>De dag voorafgaand aan de transfectie of labeling, zaad astrocyten op gewenste dichtheid voorbeeld vorming 24 − 48 h post-transfectie. Een aanbevolen dichtheid voor 24-Wells platen of 14 mm glazen bodem putjes is 2 x 104 cellen/goed. Opmerking: dit protocol is geoptimaliseerd voor de transfectie van astrocyten verguld op 12 mm glazen dekstroken op 24-Wells platen of 14 mm glazen bodemputten met behulp van een lipofection-gebaseerde methode. De reagentia moeten worden geschaald afhankelijk van de grootte van de kweek schaal waarin de astrocyten groeien.</li>
	<li>Verdun het lipofection-reagens (tabel met materialen) in gereduceerde serum media (tabel met materialen). Om de verhouding van lipofection reagens tot DNA te optimaliseren, test een aantal adequate verdunningen. Als u bijvoorbeeld het in dit Protocol gebruikte reagens gebruikt (tabel van de materialen), Verdun dan 2, 3, 4 en 5 μL van het lipofection-reagens in 50 μL van de media met verlaagd serum.</li>
	<li>Verdun 5 μg hoog zuiver DNA in 250 μL van de media met verlaagd serum. Voeg 5 μL lipofection Enhancer reagens (tabel van materialen). Combineer de buis met het lipofection-reagens met een gelijk volume van de DNA-lipofection Enhancer mix. Meng door pipetteren en incuberen bij kamertemperatuur (RT) gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Verwijder astrocyten kweekmedia en voeg transfectie mix (stap 3,3) toe aan cellen dropwise. Na een incubatie van 6 uur bij 37 °C en 5% CO2, vervangt u het transfectie complex door een geschikte hoeveelheid Astrocyt kweekmedia (2 ml voor glazen bodem gerechten van 14 mm). Incuberen voor een extra 24 − 72 h voordat u doorgaat naar de beeld verwerving. Bewaak nauwgezet de duur van de incubatie stap om de beste balans te bereiken tussen eiwit expressie en levensvatbaarheid van de cellen.</li>
</ol>4. etikettering van late endosomes/lysosomes met fluorescentie sondes
Opmerking: sommige cargo's kunnen worden gelabeld met behulp van fluorescerende kleurstoffen met een hoge affiniteit voor Cargo-specifieke eiwitten. In het volgende voorbeeld wordt de etikettering van late endosomes/lysosomes toegestaan met een fluorescerende acidotrope sonde.
<ol><li>Verdun de lysosomale-etiketterings sonde (tafel van de materialen) in 200 μL van de cultuur van de astrocyten tot een werkconcentratie van 1 μM en breng deze aan op astrocyten uit stap 3,1 met een dichtheid van 2 x 104 cellen/goed. Inincuberen gedurende 30 min bij 37 °C.</li>
	<li>Was de cellen één keer met warme astrocyten cultuur media en vervang deze door Imaging media (tabel met materialen). Ga onmiddellijk naar Live Imaging.</li>
</ol>5. Image Acquisition met behulp van een time-lapse Imaging systeem
Opmerking: timelapse-Live beelden moeten worden uitgevoerd met een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een high-speed camera, duidelijke scherpstelling, incubatie kamer en een 40x-olie doelstelling met een hoog numeriek diafragma (bijv. plan-Apochromat 1.4 NA). Er is een verscheidenheid aan acquisitie software beschikbaar voor time-lapse Imaging. Selectie van het microscopie systeem en acquisitie software moet gebaseerd zijn op hun beschikbaarheid en geschiktheid voor de doelstellingen van de specifieke studie. Hieronder vindt u enkele algemene richtlijnen.
<ol><li>Plaats de kweekkamer of het gerecht in de juiste adapter op de Microscoop. Selecteer met behulp van epifluorescentie licht de cellen die fluorescerende eiwitten of sonde uitdrukken om op te nemen. Pas de fluorescerende monster verlichting aan om de geselecteerde cellen te visualiseren met behulp van de digitale camera. Vermijd het gebruik van hoge verlichting die fotobleaching en fototoxiciteit kan veroorzaken. Pas scherpstelling en zoomen aan.</li>
	<li>Verkrijg één Z-stack time-lapse serie met een frequentie van 1 frame elke 2 s voor tijdsintervallen variërend tussen 300 s en 500 s met behulp van de zoom en duidelijke focus functies. Opmerking: de dynamiek van de handel (snelheid, bewegings frequentie, enz.) zal variëren afhankelijk van het eiwit van belang, dus het tijdsverloop van de overname kan aanpassing vereisen. Bijvoorbeeld, mitochondriën zijn minder beweegbaar dan lysosomen en vertonen frequente pauzes. In dit geval is het geschikter om de verwervings parameters aan te passen naar 1 frame elke 5 s voor 800 s.</li>
	<li>Sla timelapse-afbeeldingen op en exporteer ze als AVI-of TIFF-stack bestanden.</li>
</ol>6. beeldanalyse
Opmerking: beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van de KymoToolBox plugin voor ImageJ/Fiji16. Gedetailleerde stap-voor-stap schriftelijke instructies zijn online beschikbaar17. De volgende verkorte stappen moeten voldoende zijn om de kymografen te maken en de deeltjes transport parameters te extraheren.
<ol><li>Open time-lapse-beeld volgorde in ImageJ/Fiji-software. Importeer afbeeldingen uit het menu bestand als AVI-of TIFF-stack bestanden. Converteer de afbeeldingen naar 8-bits of 16-bits door een van deze afbeeldingstypen te selecteren met behulp van het gereedschap tekst in het menu afbeelding . Als u werkt met RGB-bestanden, splitst u kanalen met behulp van de tool splitsen kanaal beschikbaar onder de kleur functie in het menu afbeelding .</li>
	<li>Om een kymograph (representatie in positie en tijd van deeltjes trajecten) te genereren, tekent u elk spoor waarin deeltjes bewegen door een lijn langs de trajecten van de deeltjes te traceren met behulp van het gesegmenteerde lijn gereedschap. Om de directionaliteit van de beweging correct toe te wijzen, tekent u de polylijn met dezelfde gewenste richtings Conventie voor alle films, zodat de polariteit consistent is binnen en tussen alle cellen die worden bestudeerd. Teken bijvoorbeeld de polylijn vanuit het midden van de cel naar de omtrek of omgekeerd. Pas de lijnbreedte aan de dikte van het spoor aan door te dubbelklikken op het gereedschap lijn .</li>
	<li>Voer de macro Draw Kymo van de plug-in KymoToolBox uit met een lijnbreedte van 10. Er verschijnt een vraag om de afbeelding in de tijd te kalibreren (aantal frames, framesnelheid) en spatie (x, y-resolutie). Eenmaal gekalibreerd, worden de kymografen gegenereerd en kunnen ze worden opgeslagen als TIFF-bestanden voor gegevens presentatie of verdere deeltjes analyse.</li>
	<li>Wijs deeltjes trajecten toe door elk deeltje in de kymograph handmatig te volgen met behulp van het gesegmenteerde lijn gereedschap voor de volledige duur van de overname. Noteer elk deeltjestraject als een regio van belang (ROI) met behulp van de ROI Manager -tool in het menu analyse/extra . Sla alle ROIs per timelapse-video op voor verdere analyse. Opmerking: het is van cruciaal belang om het juiste traject voor afzonderlijke deeltjes op de kymograph toe te wijzen om de meest nauwkeurige berekening van transport parameters te bereiken.<ol>
<li>Voer de macro analyze kymo van de plug-in KymoToolBox uit. Er wordt een venster geopend waarin wordt gevraagd de "uiterlijke" richting van de deeltjes beweging (van links naar rechts of omgekeerd) te definiëren in het vervolgkeuzemenu. Deze selectie is afhankelijk van de positie van de fluorescerende ladingen-afbeelding ten opzichte van de Nucleus of de rand van de cel, zoals vastgesteld in stap 6,2. Als de Nucleus bijvoorbeeld links van de cargo's is geplaatst en de polylijn in stap 6,2 van de Nucleus is verwijderd, definieert u de beweging van de uitwendige deeltjes als "van links naar rechts".</li>
		<li>Definieer de limiet snelheid (minimale snelheid waarmee een lading wordt beschouwd als motiel) in het venster Kymo analyseren . Voor cargo's die bij snelle intracellulaire transport snelheden bewegen, is 0,1 μm/seconde een geschikte keuze. Wijzig deze waarde om de gevoeligheid van de software voor elke lading van belang aan te passen. Pas de lijnbreedte aan de dikte van elk deeltjes traject aan.</li>
		<li>Selecteer in het venster kymo analyseren de optie alle gegevens en de Geëxtregeerde coördinaten van het logboek registreren. Dit berekent verschillende vrachttransport parameters, waaronder gemiddelde snelheid, actieve snelheid, uiterlijke snelheid, cumulatieve afgelegde afstand, afgelegde afstand in hetzij de binnen-of naar buiten richting, het aantal schakelopties voor elk deeltje, het percentage tijd bewegen in elke richting of onderbroken, enz. Gegevens die worden berekend voor afzonderlijke tracks worden vervolgens gegroepeerd per kymograph en opgeslagen in tekstbestanden die specifiek zijn voor elke afbeelding. Opmerking: de optie gekleurde Kymo tonen van de kymo -macro analyseren genereert een kleurgecodeerde overlay van het pad over de oorspronkelijke kymograph. Deeltjes die naar buiten reizen, zijn groen gekleurd, naar binnen rood en stationaire deeltjes in blauw. De rapport coördinaten op de oorspronkelijke stapel optie van de kymo analyseren macro genereert een kleurgecodeerde overlay van de geëxtrapoleerd object positie op de oorspronkelijke time-lapse video en kymograph.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+Glia%2C+the+unacknowledged+partner%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li>
<li>Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-neuron+metabolic+relationships%3A+for+better+and+for+worse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse.</a> Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).</li>
<li>Chung, W. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glial+cells+in+synapse+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of glial cells in synapse elimination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).</li>
<li>Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+Synapse+Formation%2C+Function%2C+and+Elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370(2015).</li>
<li>Shin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+glutamate+transporter+GLAST+in+membranes+of+cultured+astrocytes+in+the+presence+of+glutamate+transport+substrates+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP.</a> Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).</li>
<li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+and+vesicle+mobility+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes.</a> Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).</li>
<li>Potokar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AQP4+surface+expression+via+vesicle+mobility+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes.</a> Glia. 61 (6), 917-928 (2013).</li>
<li>Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab4+and+Rab5+GTPase+are+required+for+directional+mobility+of+endocytic+vesicles+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes.</a> Glia. 60 (4), 594-604 (2012).</li>
<li>Chiu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HYS-32-Induced+Microtubule+Catastrophes+in+Rat+Astrocytes+Involves+the+PI3K-GSK3beta+Signaling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0126217(2015).</li>
<li>Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-assisted+altered+trafficking+of+astrocytic+gap+junction+protein+connexin+43+is+associated+with+depletion+of+connexin+47+during+mouse+hepatitis+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (71), e50079(2013).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+produce+interferon+that+enhances+the+expression+of+H-2+antigens+on+a+subpopulation+of+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells.</a> The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).</li>
<li>Zala, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glycolysis+provides+on-board+energy+for+fast+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport.</a> Cell. 152 (3), 479-491 (2013).</li>
<li>Cordelières, F. P. IJ KymoToolBox. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox">https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</a> (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een experimentele aanpak om fluorescently gelabelde organellen en membraan eiwitten van belang te uiten, visualiseren en volgen met behulp van time-lapse video microscopie in hoge zuiverheid primaire muis corticale MD astrocyten. We schetsen ook een methodologie voor het meten van de deeltjes dynamiek. Directe visualisatie van eiwitten en organel dynamica in primaire astrocyten biedt een krachtig hulpmiddel om de regulering van intracellulair transport in deze cellen in vitro te bestuderen.
<p cla...

Astrocyten zijn de meest voorkomende cellen in het centrale zenuwstelsel van de volwassene, waar ze unieke ontwikkelings-en homeostatische functies uitvoeren1. Astrocyten moduleren synaptische ontwikkeling door direct contact met pre-en postsynaptisch terminals als onderdeel van de Tri-partite Synapse, die bevat neurotransmitter receptoren, transporters, en celadhesie moleculen die Synapse vorming vergemakkelijken en neuron-astrocyten communicatie2. Bovendien, astrocyten actief controle synaptische transmissie en voorkomen neuronale excitotoxicity door het snel verwijderen van excitatory neurotransmitters uit de synaptische gespleten, recycling neurotransmitters, en deelnemen aan synaptische snoeien3 , 4 , 5 , 6. om deze zeer interactieve functies mogelijk te maken, communiceren astrocyten onderling, met andere gliacellen en met neuronen via gespecialiseerde membraan proteïnen, waaronder celadhesie moleculen, aquaporinen, ionenkanalen, neurotransmitter transporteurs, en gap junction moleculen. Astrocyten veranderen actief de oppervlakte niveaus van deze eiwitten in reactie op schommelingen in hun intra-en extracellulaire omgeving7. Bovendien, veranderingen in de niveaus en de verdeling van de mitochondriën, lipide druppeltjes, en degradatieve en recycling organellen moduleren energietoevoer, metaboliet beschikbaarheid, en cellulaire clearing processen die essentieel zijn voor de functie van de astrocyten en Overleving.
De dynamische veranderingen in membraan proteïne en organel-handel en positionering in astrocyten worden vergemakkelijkt door de gezamenlijke functie van motor eiwitten en adapters die de beweeglijkheid van de lading bevorderen8,9. Evenzo worden de oppervlakte niveaus van membraan proteïnen gemoduleerd door middel van internalisatie en recycling evenementen10. Deze cargo's worden getransporteerd via een ingewikkeld netwerk van actin, microtubuli, en eventueel tussenliggende filamenten tracks8. Studies op basis van immunofluorescentie kleuring van end-binding proteïne 1 (EB1), die zich ophogt bij de groeiende microtubulus plus uiteinden, suggereren dat in astrocyten bundels van microtubuli uit de perinucleons uitstralen en hun plus einde uitbreiden naar de periferie11. Echter, een uitgebreid onderzoek van de organisatie en de polariteit van microtubuli en andere cytoskelet elementen met behulp van Live-celbeeldvorming ontbreekt nog. Hoewel veel van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de dynamiek van organellen en membraan eiwitten uitvoerig zijn bestudeerd in neuronen en andere celtypen, is de beweeglijkheid van de lading in astrocyten minder goed begrepen. De meeste van onze huidige kennis over veranderingen in de eiwit-en organel verdeling in astrocyten is gebaseerd op traditionele etikettering van vaste stoffen op basis van antilichamen, die het precieze ruimtelijke en temporele onderzoek van Cargo Dynamics7uitsluit, 12.
Hier beschrijven we een methode om membraan eiwitten en organellen te labelen voor Live beeldvorming in primaire muis astrocyten culturen. Met behulp van dit protocol, bieden we voorbeelden waarin we de dynamische lokalisatie van groene fluorescerende eiwitten (GFP)-gelabelde membraan eiwitten in getransfunteerde astrocyten, waaronder de gap junction Protein connexin 43 (Cx43-GFP) en het excitatory aminozuur Transporter 1 (EAAT1-GFP). We beschrijven ook het gebruik van een fluorescerende acidotrope sonde om zure organellen te visualiseren en de dynamiek van hun handel in levende astrocyten te volgen. Ten slotte laten we zien hoe u de timelapse-gegevens analyseert om transport parameters voor individuele ladingen te extraheren en te evalueren.

<table><tbody><tr><td>2.5% Trypsin (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-203-637</td><td>Sorvall ST8 Centrifuge</td></tr><tr><td>Cell Culture Grade Water</td><td>Gen Clone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Microscope</td><td>Zeiss</td><td>WSN-AXIOVERT A1</td><td>Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities</td></tr><tr><td>Cytosine Arabinoside</td><td>Sigma</td><td>C1768-100MG</td><td>(AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td>Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining.</td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Stemi 305</td></tr><tr><td>Dissecting Scissors</td><td>F.S.T</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gen Clone</td><td>25-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td>Heat-Inactivated</td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td><td>NIH</td><td>Version 1.52i</td><td></td></tr><tr><td>Fine Tip Tweezers</td><td>F.S.T</td><td>11254-20</td><td>Style #5</td></tr><tr><td>Fluorescence light source</td><td>Excelitas</td><td>012-63000</td><td>X-Cite 120Q</td></tr><tr><td>GFAP antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>3670S</td><td>GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody</td></tr><tr><td>Glass Bottom Dishes</td><td>Mattek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11054-10</td><td>Graefe Iris Forceps with curved tips</td></tr><tr><td>Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes)</td><td>Life Technologies</td><td>L7526</td><td>LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice.</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (10x)</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td>Magnesium and calcium free</td></tr><tr><td>Imaging Media</td><td>Life Technologies</td><td>A14291DJ</td><td>Live Cell Imaging Solution</td></tr><tr><td>Inverted Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>KymoToolBox</td><td></td><td></td><td>https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox</td></tr><tr><td>Lipofection Enhancer Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>11514015</td><td>Plus Reagent</td></tr><tr><td>Lipofection Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15338100</td><td>Lipofectamine LTX reagent</td></tr><tr><td>Orbital shaking incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>8261-30-1008</td><td>Innova 4230, orbital shaking incubator with temperature and speed control</td></tr><tr><td>Penicillin/Strepomycin solution (100x)</td><td>Gen Clone</td><td>25-512</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td><td>Gen Clone</td><td>25-507x</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7405</td><td>Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing</td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>OPTI-MEM</td></tr><tr><td>Tissue Culture Flasks</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-209</td><td>75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap</td></tr><tr><td>Tissue culture incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030285</td><td>HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum-Driven Filter Systems</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-227</td><td>500 ml, PES membrane, 0.22 &micro;m</td></tr><tr><td>Vannas scissors straight</td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere cargo's in astrocyten

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocyten behoren tot de meest overvloedige celtypen in het volwassen brein, waar ze belangrijke rollen spelen in een veelheid van functies. Als een centrale speler in de hersenen homeostase, astrocyten leveren neuronen met vitale metabolieten en buffer extracellulaire water, ionen, en glutamaat. Een integraal onderdeel van de "Tri-partite" Synapse, astrocyten zijn ook kritisch in de vorming, snoeien, onderhoud, en modulatie van synapsen. Om deze zeer interactieve functies mogelijk te maken, communiceren astrocyten onderling en met andere gliacellen, neuronen, de hersen-vasculatuur en de extracellulaire omgeving door een veelheid aan gespecialiseerde membraan eiwitten die cel bevatten adhesiemoleculen, aquaporinen, ionenkanalen, neurotransmitter transporters, en gap-junction moleculen. Ter ondersteuning van deze dynamische flux, zijn astrocyten, net als neuronen, afhankelijk van strak gecoördineerd en efficiënt intracellulair transport. In tegenstelling tot neuronen, waar intracellulaire handel uitgebreid is afgebakend, is het op microtubulus gebaseerde transport in astrocyten minder bestudeerd. Niettemin, Exo-en endocytaire handel in celmembraan eiwitten en intracellulaire organel transport regelt de normale biologie van astrocyten, en deze processen worden vaak aangetast door ziekte of als reactie op letsel. Hier presenteren we een eenvoudig protocol om hoge kwaliteit Murine astrocyten te kweken, om astrocytische eiwitten en organellen van belang fluorescentisch te labelen en om hun intracellulaire transport dynamiek op te nemen met behulp van time-lapse confocale microscopie. We laten ook zien hoe relevante transport parameters uit de gekochte films kunnen worden uitgepakt en gekwantificeren met behulp van de beschikbare software voorbeeld analyse (d.w.z. ImageJ/FIJI) plugins.

Het protocol voor het instellen van de hierboven beschreven primaire muis-MD-astrocyten moet reproduceerbare, kwalitatief hoogstaande culturen opleveren. Hoewel culturen in eerste instantie een mengsel van astrocyten, fibroblasten en andere gliacellen bevatten, waaronder Microglia en oligodendrocyten (Figuur 1bi, BIV; rode pijlpunten), wordt de toevoeging van araC aan de gemengde cultuur tussen DIV5-DIV7 geminimaliseerd de proliferatie van deze contaminerende cellen. De geco...

Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Ons protocol kan worden gebruikt om de beweeglijkheid en lokalisatie van astrocytische organellen of eiwitten te onderzoeken onder gecontroleerde extracellulaire omgevingen en milde ziektetoestanden. In tegenstelling tot de vaste mha-preparaten, die enkele momentopnamen van eiwit- en organellelokalisatie bieden, kan onze live beeldvormingstechniek worden gebruikt om de deeltjesdynamica in individuele levende astrocyten te analyseren. De dag voor de transfectie zaad astrocyten op de juiste dichtheid voor beeldvorming op 24 tot 48 uur na de transfectie.Verdun het lipofectionreagens in een verlaagd serummedium tot de juiste experimentele concentratie. Verdun vijf microgram hoge zuiverheid DNA in 250 microliters van verminderd serummedium en voeg vijf microliters lipofection enhancer reagens toe aan de buis. Meng het lipofection reagens met een gelijk volume van de DNA lipofection enhancer mix en ontcubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder aan het einde van de incubatie het supernatant uit de astrocytencultuur en voeg 100 microliter van de transfectiemix dropwise toe aan de cellen. Na zes uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, vervang het transfectiecomplex door een passend volume astrocytencultuurmedium en breng de cellen nog 24 tot 72 uur terug naar de celkweek incubator. 30 minuten voor de beeldvorming verdun een geschikte lysosomale labelingsonde in 200 microliters van astrocytencultuurmedium tot een werkconcentratie van één micromolar en label de astrocyten 30 minuten met een sonde bij 37 graden Celsius.Was vervolgens de cellen een keer met warme astrocyten cultuur medium en vervang de was met imaging medium. Onmiddellijk na de sonde etikettering, plaats de astrocyten cultuur container in de juiste adapter op de microscoop stadium en met behulp van EBI fluorescentie licht, lokaliseren van de cellen die fluorescerende eiwitten of sonde uit te drukken. Gebruik de digitale camera om de fluorescerende voorbeeldverlichting aan te passen om de geselecteerde cellen te visualiseren en de focus aan te passen en in te zoomen op één cel.Gebruik vervolgens de zoom- en definitefocusfuncties om één Z-stack time-lapse-serie te verkrijgen met een frequentie van één frame om de twee seconden voor tijdintervallen variërend van 300 tot 500 seconden. Sla de timelapse-afbeeldingen op en exporteer deze als AVI- of TIFF-stackbestanden. Als u de time-lapse-afbeeldingen wilt analyseren, opent u de time-lapse-afbeeldingsreeks in ImageJ of Fiji en gebruikt u het gereedschap Gesplitst kanaal om de kanalen te splitsen.Gebruik in het acht-bits groene kanaalbeeld het gereedschap Gesegmenteerde lijn om een lijn te traceren langs de trajecten van de deeltjes met dezelfde gewenste richtingsconventie voor alle films, zodat de polariteit consistent is binnen en over alle cellen die worden bestudeerd. Dubbelklik op het gereedschap Lijn om de lijnbreedte aan te passen aan de dikte van het spoor en voer de Kymo-macro tekenen van de Kymo ToolBox-plug-in uit met een lijnbreedte van 10. Er verschijnt een prompt waarin wordt gevraagd om de afbeelding in tijd en ruimte te kalibreren.Eenmaal gekalibreerd, kymographs zal worden gegenereerd en kan worden opgeslagen als TIFF-bestanden. Als u deeltjestrajecten wilt toewijzen, gebruikt u het gereedschap Gesegmenteerde lijn om elk deeltje in de kymograaf handmatig te volgen voor de volledige duur van de acquisitie en de ROI-manager te gebruiken om elke deeltjestraject op te nemen als een gebied van belang. Sla alle regio's van belang per elke time-lapse video voor verdere analyse en voer de Analyse Kymo macro van de Kymo ToolBox plugin.Er wordt een venster geopend waarin wordt gevraagd om de uitgaande richting van deeltjesbeweging te definiëren vanuit de kern van de cel van belang in het vervolgkeuzemenu. De maximumsnelheid moet worden bepaald aan de hand van de gevoeligheid van de software voor elke lading van belang en de lijnbreedte moet worden aangepast aan de dikte van elk deeltjestraject. De Log All Data en Log Extrapolated Coördinaten moeten worden berekend voor de berekening van de verschillende parameters voor vrachtvervoer.Klik op Oke. De gegevens die voor de afzonderlijke tracks worden berekend, worden vervolgens per kymograaf samengevoegd en opgeslagen in tekstbestanden die specifiek zijn voor elke afbeelding. Het combineren van cytosine arabinoside behandeling met het schudden gebaseerde zuiveringsstrategie verrijkt de zuiverheid van de astrocyten culturen over traditionele protocollen die de zuiveringsstap slechts omvatten.Lipofection gebaseerde transfectie maakt de voorbijgaande expressie van eiwitten op niveaus die optimaal zijn voor levende cel beeldvorming zonder dat toxiciteit of invloed astrocyten levensvatbaarheid. Op dezelfde manier maakt het gebruik van een fluorescerende sonde het mogelijk om zure endolysosomale organellen snel en efficiënt te etiketteren voor het volgen van organelledynamica en astrocyten. De time-lapse gegevens van de beeldvorming kunnen worden gebruikt om kymografen te genereren die vrachtbeweging in tijd en ruimte volgen.In deze kymografen wordt anterogradebeweging van de aangegeven lading vertegenwoordigd door trajecten met negatieve hellingen, terwijl retrograde beweging wordt vertegenwoordigd door trajecten met positieve hellingen. Stationaire vikjes verschijnen als verticale trajecten. In deze analyse, kwantificering van de flux van een specifieke lading door middel van een gebied van de astrocyt bleek verschillen in het percentage van de modale deeltjes tussen ladingen die waarschijnlijk representatief zijn voor hun normale basislijn beweeglijkheid in het gebied van de astrocyt waarbinnen de films werden verworven.De nauwkeurige mapping van de verandering in de X, Y positie langs de full timescale voor elk deeltje verkregen uit de kymograaf kan ook worden gebruikt om andere bewegingsparameters te evalueren, zoals ladingsnelheid en looplengte. Aangezien dit protocol astrocytenculturen van hoge kwaliteit en efficiënte ladinglabeling vereist, moet de transfection reagent incubatietijd en verwervingstijdlijn worden aangepast voor elke plasmide of lading van belang. Dit protocol kan worden gewijzigd om transportgebeurtenissen in astrocyten te karakteriseren in reactie op celschade, toxiciteit, pathogene mutaties, synaptische activiteit of veranderingen in de intra- of extracellulaire omgeving.

visualizing-analyzing-intracellular-transport-organelles-other-cargos

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven hoe te meten in de buurt van membraan en de wereldwijde intracellulair calcium dynamiek in gekweekte astrocyten met behulp van totale interne reflectie en epifluorescentie microscopie.

Het meten van de buurt plasmamembraan en Global intracellulair calcium Dynamics in Astrocyten

Source: Moye, S. L., et.al. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (2019). This video demonstrates the use of fluorescent dye iontophoresis to study astrocyte morphology in fixed brain slices. It details the piercing of the astrocyte soma with an electrode to deliver an anionic, hydrophilic dye into the cytoplasm under a low-voltage current, enabling the dye to diffuse and label the soma and branches. Confocal microscopy is then used to visualize the...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Fluorescent Dye Iontophoresis in a Fixed Mouse Brain Slice

Source: Creighton, B. A., et al. Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the visualization of intracellular cargo transport in cultured astrocytes using a fluorescent acidotropic probe that selectively labels acidic endolysosomal vesicles. Time-lapse imaging and Z-stack acquisition with a confocal microscope allow tracking of fluorescently labeled cargo throughout the three-dimensional cell volume.

Visualizing Intracellular Transport of Cargo in Cultured Astrocytes

Hier beschrijven we een aanpassing van de protocollen voor homeostatische plasticiteit induceren in neuronen voor de studie van plasticiteit van astrocytaire G-proteïne gekoppelde receptoren. Onlangs gebruikt om wijzigingen in astrocytaire I mGluRs bij jonge muizen te onderzoeken, kan de werkwijze worden toegepast voor de schaal van verschillende astrocytaire GPCRs meten in weefsel van volwassen muizen in situ en in vivo, en een betere waardering van de gevoeligheid van astrocytaire receptoren...

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

De eigenschappen en functies van astrocytenintracellulaire Ca2+ signalen in het striatum blijven onvolledig onderzocht. We beschrijven methoden om genetisch gecodeerde calciumindicatoren in striatale astrocyten tot expressie te brengen met behulp van adeno-geassocieerde virussen van serotype 2/5 (AAV2/5), evenals procedures om Ca2+ signalen binnen striatale astrocyten in situ betrouwbaar te beeldhouwen.

Imaging intracellulaire Ca 2+ Signalen in Striatale Astrocyten van volwassen muizen met behulp van genetisch gecodeerd Calcium Indicatoren

Astrocyten in het CZS veranderen hun functionele en structurele eigenschappen als reactie op schadelijke stimuli. Dit rapport presenteert een protocol voor de beoordeling van de driedimensionale morfologie van astrocyten in zieke toestanden of na therapeutische interventies.

Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de organisatie van de astrocytic netwerken. De beschreven methode minimaliseert bias om beschrijvende maatregelen van deze netwerken zoals cellen, grootte, ruimte en positie binnen een kern. Anisotropie is beoordeeld met een vectoriële analyse.

Analyseren van de grootte, de vorm en de directionaliteit van netwerken van gekoppelde astrocyten

De beschreven pijplijn is ontworpen voor de segmentatie van elektronenmicroscopie datasets groter dan gigabytes, om hele celmorfologieën te extraheren. Zodra de cellen zijn gereconstrueerd in 3D, kan aangepaste software die is ontworpen rond individuele behoeften worden gebruikt om een kwalitatieve en kwantitatieve analyse rechtstreeks in 3D uit te voeren, ook met behulp van Virtual Reality om de zicht occlusie te overwinnen.

Een methode voor 3D reconstructie en Virtual Reality analyse van gliale en neuronale cellen

Astrocyten zijn morfologisch complexe cellen, geïllustreerd door hun meerdere processen en bossige gebieden. Om hun uitgebreide morfologie te analyseren, presenteren wij een betrouwbaar protocol voor het uitvoeren van intracellulaire Lucifer gele Iontoforese in licht vast weefsel.

Visualisering van de morfologie van de astrocyten met behulp van Lucifer geel Iontforesis

Het combineren van virale vectortransductie en hersenzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd een groot aantal neuronen en astrocyten te onderzoeken.

Onderzoek naar ruimtelijke interactie tussen astrocyten en neuronen in vrijgemaakte hersenen

Dit protocol beschrijft methoden voor het doorsnijden, kleuren en afbeelden van vrij zwevende weefselsecties van de muizenhersenen, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van de analyse van het astrocytengebiedvolume en astrocytengebied overlap of tegels.

Analyse van astrocytengebiedvolume en tegels in dikke vrij zwevende weefselsecties

Leer live-cell imaging voor intracellulair transport van organellen in murine astrocyten. Deze methode analyseert deeltjesdynamica en cargo-motiliteit in neuronale cellen.

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Meer video's verkennen