Name: Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Leer de integriteit van de bloed-hersenbarrière te testen in Drosophila melanogaster embryo's en larven met behulp van injectietechnieken en confocale microscopie. Deze methode biedt inzicht in genetische regulatie en zenuwstelselbescherming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Dr. F. Bryan Pickett en Dr. Rodney Dale voor het gebruik van apparatuur voor injectie. Dit werk werd gefinancierd door onderzoeksfinanciering van Loyola University Chicago naar M.D., D.T. en J.J.

1. verzameling van monsters
<ol><li>Embryo collectie
	<ol><li>Gebruik in elke embryo-opvang kooi minimaal 50 maagdelijke vrouwtjes met 20 − 25 mannetjes voor verzamelingen. Inincuberen deze vliegen in een fles met maïsmeel-agar voedsel (tabel van de materialen) voor 1 − 2 dagen voor aanvang collecties23. Opmerking: Er kunnen meer vliegen worden gebruikt, maar de verhouding tussen vrouwen en mannen moet op 2:1 worden gehouden.</li>
		<li>Pre-warme appelsap agar-platen (tabel 1) bij 25 °c 's nachts. Opmerking: Dit is nodig voor een goede enscenering van embryo's. Als de platen snel uitdrogen, voeg dan een kom met water toe aan de incubator om de vochtigheid van de kamer te verhogen.</li>
		<li>Anesthetize vliegt vanaf stap 1.1.1 met CO2 en transfer vliegt naar een verzamel kooi. Plaats een voorverwarmde appelsap agar-plaat met een kleine uitstrijkje gist pasta aan de open kant en bevestig deze aan de kooi met de rode huls (tafel van materialen). Om oudere embryo's te wissen, laat vliegen om embryo's/eieren op een appelsap agar plaat te leggen voor 1 uur bij 25 °C.</li>
		<li>Haal de opvang kooi uit de incubator. Keer de kooi mesh-zijde naar beneden en tik op vliegen naar de onderkant van de kooi. Vervang de appelsap agar met een nieuwe voorverwarmde appelsap agar plaat met een kleine uitstrijkje gist pasta. Gooi de eerste plaat weg.</li>
		<li>Laat vliegen om embryo's/eieren op de nieuwe appelsap agar plaat te leggen voor 1 uur bij 25 °C. Gooi deze plaat weg na de 1 h-collectie en ga verder naar de volgende stap om embryo's voor injectie te verzamelen.</li>
		<li>Om laat stadium 17 embryo's (20 − 21 h AEL) te verzamelen, mogen vliegen met het gewenste genotype uit stap 1.1.1 − 1.1.5 op een nieuwe voorverwarmde appelsap agar-plaat liggen met een kleine uitstrijkje gist pasta bij 25 °C gedurende 1 uur. leeftijds plaat voor 19 uur in een incubator van 25 °C , dus embryo's zullen 20 − 21 uur oud zijn op het moment van beeldvorming. Opmerking: Deze stap kan worden herhaald zoals gewenst voor meerdere rondes van monsterverzameling, injectie en imaging.</li>
		<li>Verzamel embryo's van platen in een celzeef met een nylon mesh van 70 μm door toevoeging van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% nonionische oppervlakteactieve stof (PBTx; Tabel 1) om het oppervlak van de plaat te bedekken en embryo's van het oppervlak los te maken met een penseel.</li>
		<li>Dechorionaat embryo's verzameld in de celzeef in een 50% bleekmiddel oplossing (tabel 1) in een 100 mm Petri schaaltje gedurende 5 minuten met incidentele opwinding bij kamertemperatuur. Spoel embryo ' 3 ' uit door de celzeef in PBTx in een Petri schaaltje te zwengelen, waarbij elke keer een vers gerecht van PBTx wordt gebruikt.</li>
		<li>Als alle embryo's van het juiste genotype zijn, ga dan direct naar stap 1.1.10. Als het genereren van embryo's van het juiste genotype een kruis met heterozygoot vliegen vereist, selecteert u embryo's van het juiste genotype met behulp van de aanwezigheid of afwezigheid van fluorescently gemarkeerde Balancer-chromosomen. Gebruik een stereomicroscoop met fluorescerende mogelijkheden voor genotype-selectie. Opmerking: Balancer-chromosomen gemarkeerd met vervormdgeel fluorescerende eiwit; Kruppel-GAL4, UAS-groen fluorescerende proteïne (GFP); en twist-Gal4, UAS-GFP werkt goed voor genotype selectie in de late embryogenese (tabel 2)24,25,26.</li>
		<li>Gebruik een glazen pipet en breng embryo's over in PBTx naar een 2% agarose-gelplaat (tabel 1). Verwijder overtollige vloeistof met filtreerpapier. Lijn ~ 6 − 8 embryo's uit op de 2% agarose gelplaat met posterieure aan de rechterkant en de rugzijde naar boven gericht (Figuur 1B). Opmerking: De micropyle, het kleine gat waardoor spermatozoa het ei binnengaan, bevindt zich aan het voorste uiteinde van het embryo. Het achterste uiteinde is meer afgerond. De luchtpijp is wit en bevindt zich dorsaal in het embryo, waardoor het onderscheid van de rugzijde en de ventrale kanten van het embryo mogelijk wordt (Figuur 1B).</li>
		<li>Maak een Slide met één stuk dubbelzijdige tape. Druk stevig op de schuif op de bovenkant van de embryo's om ze over te brengen naar de dubbelzijdige tape.</li>
		<li>De adsorptie van embryo's door incubatie bij kamertemperatuur gedurende ~ 25 min (geen droogmiddel wordt gebruikt). Na het afdrogen, bedek embryo's met Halo koolstof olie. Opmerking: De droogtijden kunnen variëren afhankelijk van de temperatuur, luchtvochtigheid en ventilatie in de kamer. De incubatietijd moet worden gebruikt om het apparaat voor injectie en de confocale Microscoop voorbeeld vorming op te zetten, zoals beschreven in de punten 2 en 3 van dit protocol.</li>
	</ol></li>
	<li>Larval collectie
	<ol>
<li>Stel een kruis in met 5 − 10 maagdelijke vrouwelijke vliegen van het gewenste genotype en de helft van zoveel mannetjes van het gewenste genotype in een injectieflacon met maïsmeel-agar Food en inincuberen bij 25 °C23.</li>
		<li>Verzamel na 5 − 7 dagen, afhankelijk van het genotype, zwervende derde instar larven uit de injectieflacon zachtjes met een tang. Spoel larven in 1x PBS om voedsel te verwijderen dat aan de larven vastzit. Breng larven over naar een appelsap agar-plaat voor genotype ring, zoals beschreven in stap 1.1.9 indien nodig.</li>
		<li>Rol larven op een tissue met een penseel om ze af te drogen. Breng 6 − 8 larven over naar een glijbaan, voorbereid met dubbelzijdige tape met behulp van een tang.</li>
	</ol></li>
</ol>2. bereiding van naalden en preparaat injectie
<ol><li>Trek naalden op een micro pipet trekker voorafgaand aan de inleiding van dit protocol. Veilige capillaire buizen in de naald trekker en trekken volgens de standaard naald vorm en parameters voor D. melanogaster injecties (tabel 3)27. Bewaar naalden in een Petri schaaltje door klei te verankeren tot het gebruik voor injectie.</li>
	<li>Plaats een naald met 5 μL 10 kDa dextran, geconjugeerd met sulforhodamine 101 acid chloride (tabel met materialen) met behulp van een gel-loading pipetpunt van 20 μl gedurende de 25 minuten droog periode voor embryo's (stap 1.1.12), of onmiddellijk na de overdracht van larven naar de glijbaan (stap 1.2.3).</li>
	<li>De naald in een naald houder en positie in een micro manipulator bevestigd aan een stalen basis (tabel van de materialen) te laden. Opmerking: De naald moet bijna evenwijdig zijn aan de Microscoop-fase voor de injectie van embryo's en schuin naar beneden worden gekanteld voor larvale injecties.</li>
	<li>Stel het injectie toestel (tabel met materialen) in op 50 psi, 5 − 10 MS met een bereik van 10. Opmerking: Het kan nodig zijn deze instellingen te wijzigen voor het gebruik van de betreffende injectie apparatuur.</li>
	<li>Plaats de schuif op het podium en de penseel rand van de naald tegen de rand van de dubbelzijdige tape in een hoek van 45 ° om een schuine, gebroken punt te maken. Opmerking: Voor embryo's is het alleen nodig om de tip genoeg te breken om de 10 kDa dextran te laten stromen. Een perfecte naald heeft een enigszins schuine punt en slechts een kleine druppel kleurstof komt met elke injectie uit. Voor larven is het noodzakelijk om de tip meer te breken, maar met een schuine punt om de larvale Body Wall te penetreren. Er komt een grotere druppel kleurstof uit.</li>
	<li>Pomp voetpedaal tot de kleurstof aan de punt van de naald.</li>
	<li>Lijn de naald zodanig uit dat deze evenwijdig is met het embryo of een beetje naar beneden schuin naar de larve wordt gekanteld.</li>
	<li>Beweeg de naald om het achterste uiteinde van het preparaat te prikken en Injecteer het preparaat door het voetpedaal te pompen. Injecteer ~ 2 nL van kleurstof in embryo's, en ~ 220 nL van kleurstof in larven. Opmerking: Het embryo of de larve moet met kleurstof overspoelen als de injectie succesvol is.</li>
	<li>Noteer het tijdstip van injectie voor incubatie doeleinden. Inincuberen embryo's gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Incuberen larven gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Ga door de glijbaan om extra specimens te injecteren en noteer het tijdstip van de injectie voor elk preparaat. Opmerking: Afhankelijk van de snelheid waarmee daaropvolgende dissectie-en beeldvormings stappen kunnen worden uitgevoerd, kunnen 4 − 8 monsters tegelijk worden geïnjecteerd.</li>
</ol>3. bereiding van de monsters voorbeeld vorming
<ol><li>
Beeldvorming van embryo's
	<ol>
<li>Maak na de injectie embryo's voorbeeld vorming. Breng Petroleum Jelly met een applicator met katoen punt aan de rechter-en linkerkant van de samples op de glijbaan aan als een afstandhouder om schade aan de embryo's bij het plaatsen van de afdek mantel te voorkomen.</li>
		<li>Beeld monsters met een confocale Microscoop gedurende de diepte van het embryo met een 20x-doelstelling. Bereken het percentage van de totale monsters met de kleurstof die is waargenomen in het ventrale zenuw snoer (VNC) met behulp van de volgende vergelijking:% van de monsters met gecompromitteerde BBB = aantal monsters met kleurstof accumulatie in het VNC/totale aantal monsters.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissectie en beeldvorming van larven
	<ol>
<li>Voorbereiden van dia's voor larvale monsters van tevoren. Monteer twee afdek stroken van ongeveer 0,5 cm naast de glijbaan met nagellak. Opmerking: De dekbonnen functioneren als afstandhouders voor de hersenen, zodat deze tijdens het montage proces niet beschadigd raken.</li>
		<li>Na de incubatie van 30 minuten, ontleden de larven in 1x PBS direct op de glijbaan die zal worden gebruikt bij beeldvorming. Gebruik eerst één paar tang om de larve halverwege het larvale lichaam te grijpen en gebruik een tweede paar tang om de voorste en achterste helft van de larve te scheiden.</li>
		<li>Gebruik vervolgens een paar tang om de voorste regio aan de mond haken te grijpen en gebruik een tweede paar tang om de lichaams wand te inverteren over de punt van de Tang die de mond haken aangrijpt. De hersenen en VNC zullen worden blootgesteld.</li>
		<li>Scheid de hersenen en VNC van de lichaams wand door de zenuwen te scheiden, en verwijder de lichaams wand van de glijbaan (Figuur 1C, D). Verwijder imaginale schijven indien gewenst.</li>
		<li>Bedek het monster met 10 μL van 80% glycerol en plaats een dekslip bovenop het monster voorbeeld vorming.</li>
		<li>Beeld door de diepte van het zenuwstelsel weefsel met behulp van een 20x doelstelling. Bereken het percentage van de totale monsters met kleurstof waargenomen in de VNC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Brightman, M. W., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctions+between+intimately+apposed+cell+membranes+in+the+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain.</a> Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).</li>
<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers%3A+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).</li>
<li>Hindle, S. J., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+mechanisms+in+the+Drosophila+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 414(2014).</li>
<li>Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+signaling+is+required+for+blood-brain+barrier+formation+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila.</a> Cell. 123 (1), 133-144 (2005).</li>
<li>Stork, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).</li>
<li>Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidization+of+glia+in+neural+development+links+tissue+growth+to+blood-brain+barrier+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity.</a> Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).</li>
<li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li>
<li>Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+cell+cycles+regulated+by+Notch+signaling+control+cell+size+and+ensure+a+functional+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier.</a> Development. 145 (3), dev157115(2018).</li>
<li>von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity%2C+origin%2C+and+migration+of+peripheral+glial+cells+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo.</a> Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).</li>
<li>Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtypes+of+glial+cells+in+the+Drosophila+embryonic+ventral+nerve+cord+as+related+to+lineage+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression.</a> Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).</li>
<li>Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurexin+IV%2C+caspr+and+paranodin--novel+members+of+the+neurexin+family%3A+encounters+of+axons+and+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia.</a> Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).</li>
<li>Baumgartner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+neurexin+is+required+for+septate+junction+and+blood-nerve+barrier+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function.</a> Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).</li>
<li>Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+ensheathment+and+septate+junction+formation+in+the+peripheral+nervous+system+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).</li>
<li>Bhat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon-glia+interactions+and+the+domain+organization+of+myelinated+axons+requires+neurexin+IV%2FCaspr%2FParanodin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin.</a> Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).</li>
<li>Faivre-Sarrailh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+contactin%2C+a+homolog+of+vertebrate+contactin%2C+is+required+for+septate+junction+organization+and+paracellular+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function.</a> Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).</li>
<li>Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+domains+of+myelinated+axons+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system.</a> Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).</li>
<li>von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predetermined+embryonic+glial+cells+form+the+distinct+glial+sheaths+of+the+Drosophila+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system.</a> Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).</li>
<li>Matzat, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+wrapping+in+the+Drosophila+PNS+is+controlled+by+glia-derived+neuregulin+homolog+Vein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein.</a> Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).</li>
<li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+blood-brain+barrier%3A+development+and+function+of+a+glial+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365(2014).</li>
<li>Ho, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressional+Profiling+of+Carpet+Glia+in+the+Developing+Drosophila+Eye+Reveals+Its+Molecular+Signature+of+Morphology+Regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 244(2019).</li>
<li>DeSalvo, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+surface+glia+transcriptome%3A+evolutionary+conserved+blood-brain+barrier+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 346(2014).</li>
<li>BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html</a> (2017).</li>
<li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+Drosophila+balancer+chromosomes+with+a+w-+dfd-GMR+yellow+fluorescent+protein+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker.</a> Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).</li>
<li>Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).</li>
<li>Halfon, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).</li>
<li>Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).</li>
<li>Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+raw+as+a+regulator+of+glial+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of raw as a regulator of glial development.</a> PLoS One. 13 (5), e0198161(2018).</li>
<li>Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+models+for+studying+the+blood-brain+and+blood-eye+barriers+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).</li>
<li>Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLove%2C+CR+%22Blood-Brain+Barrier%22">Blood-Brain Barrier</a>. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).</li>
<li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+and+increased+expression+of+Fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).</li>
<li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS%2FPNS+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. 132, e57038(2018).</li>
<li>Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+somatic+permeability+barrier+around+the+germline+is+essential+for+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 142 (2), 268-281 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol bevat een uitgebreide beschrijving van de stappen die nodig zijn om de integriteit van BBB te testen tijdens de late embryonale en derde INSTAR larvale stadia van de ontwikkeling van D. melanogaster . Soortgelijke benaderingen zijn elders beschreven om te testen van de integriteit van de BBB tijdens de ontwikkeling, evenals in volwassen stadia5,7,29,30. Beschrijvingen van ...

Tijdens de ontwikkeling, cel-cel communicatie en interacties zijn van cruciaal belang voor de oprichting van weefsel en orgaan structuur en functie. In sommige gevallen sluiten deze celcelinteracties organen af van de omringende omgeving om een goede orgaanfunctie te waarborgen. Dit is het geval voor het zenuwstelsel, die is geïsoleerd door de bloed-hersen barrière (BBB). Dysfunctie van de BBB bij mensen is gekoppeld aan neurologische aandoeningen zoals epilepsie, en afbraak van de barrière is waargenomen bij neurodegeneratieve ziekten, waaronder multiple sclerose en Amyotrofische laterale sclerose1. Bij zoogdieren wordt de BBB gevormd door nauwe kruisingen tussen endotheliale cellen2,3. Andere dieren, waaronder de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, hebben een BBB samengesteld uit gliacellen. Deze gliacellen vormen een selectieve permeabele barrière om de beweging van nutriënten, afvalproducten, toxines en grote moleculen in en uit het zenuwstelsel te controleren4. Dit zorgt voor het onderhoud van de elektrochemische gradiënt die nodig is om brand actie potentialen, waardoor mobiliteit en coördinatie4. In D. melanogasterbeschermen de glia het zenuwstelsel tegen de kalium-rijke, bloed achtige Hemolymfe5.
In het centrale zenuwstelsel (CZS) en het perifere zenuwstelsel (PNS) van D. melanogaster, twee buitenste gliale lagen, de subperineurale glia en de perineuriële glia, evenals een buiten netwerk van extracellulaire matrix, de neurale lamella, vormen de Hemolymfe-hersenen en Hemolymfe-zenuw barrière6, aangeduid als de BBB in dit artikel. Tijdens de ontwikkeling subperineuriële glia worden polyploïde en vergroten om het zenuwstelsel te omringen5,6,7,8,9,10,11 . De subperineurale glia vormen septate-kruisingen, die de belangrijkste diffusie barrière tussen de Hemolymfe en het zenuwstelsel5,6,12bieden. Deze kruispunten zijn moleculair vergelijkbaar met de septate-achtige kruispunten gevonden bij de paranodes van myelinerende glia in gewervelde dieren, en ze voeren dezelfde functie als nauwe kruisingen in de BBB van zoogdier13,14, 15 , 16 , 17. de perineuriële glia verdelen, groeien en wikkelen rond de subperineurale glia om de diffusie van metabolieten en grote moleculen6,10,18,19te reguleren. De vorming van BBB is voltooid door 18,5 h na het leggen van eieren (AEL) bij 25 °c5,8. Eerdere studies hebben genen geïdentificeerd die kritische regulatoren zijn van BBB-formatie20,21,22. Om de precieze rollen van deze genen beter te begrijpen, is het belangrijk om het effect van mutatie van deze potentiële regulatoren op BBB-integriteit te onderzoeken. Terwijl eerdere studies hebben geschetst benaderingen voor het aszeggen van BBB integriteit in embryo's en larven, een uitgebreid protocol voor deze assay moet nog worden beschreven5,7. Dit stapsgewijze protocol beschrijft de methoden voor het aszeggen van BBB-integriteit tijdens D. melanogaster embryonale en derde INSTAR larvale stadia.

<table><tbody><tr><td>10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1863</td><td>Dextran moet worden verdund in geautoclaveerde ddH2O tot een concentratie van 25 mg/mL.</td></tr><tr><td>20 &mu;L Gel-Loading Pipette Tips</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol (200 proof)</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>11000200</td><td></td></tr><tr><td>Active Dry Yeast</td><td>Red Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Air Compressor</td><td>DeWalt</td><td>D55140</td><td></td></tr><tr><td>Apple Juice</td><td>Mott's Natural Apple Juice</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Household Bleach</td><td></td><td>1-5% Hypochlorite</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Bottle Plugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-277</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>Steekproeven afgebeeld met 20x objectief (UPlanSApo 20x/ 0.75)</td></tr><tr><td>Cotton-Tipped Applicator</td><td>Puritan</td><td>19-062614</td><td></td></tr><tr><td>Double-Sided Tape 1/2"</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers; Pattern #5;.05 x .01 mm Tip</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Fly Food Bottles</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fly Food Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Foot Pedal</td><td>Treadlite II</td><td>T-91-S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Caster</td><td>Bio-Rad</td><td>1704422</td><td></td></tr><tr><td>Gel Tray</td><td>Bio-Rad</td><td>1704436</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pipette</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Granulated sugar</td><td></td><td></td><td>Aangeschaft bij supermarkt.</td></tr><tr><td>Halocarbon Oil</td><td>Lab Scientific, Inc.</td><td>FLY-7000</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>Schott</td><td>Ace I</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator Stand</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>KITE-R</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH310</td><td></td></tr><tr><td>Nightsea Filter Sets</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>SFA-LFS-CY</td><td>Voor visualisatie van YFP</td></tr><tr><td>Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>SFA-RB</td><td>Voor visualisatie van GFP</td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td>Simply Simmons</td><td>Chisel Blender #6</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683C</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic Pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>Dit wordt ook wel een microinjector of drukregelaar genoemd. Aangezien het model dat in ons onderzoek werd gebruikt niet langer beschikbaar is, is dit een alternatief.</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Small Embryo Collection Cages</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Steel Base Plate</td><td>World Precision Instruments</td><td>5052</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Gebruikt voor weefseldissecatie.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope with transmitted light source</td><td>Baytronix</td><td></td><td>Gebruikt voor injectie.</td></tr><tr><td>Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>Nonionogene oppervlakteactieve stof</td></tr><tr><td>Vial Plugs</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-273</td><td></td></tr></tbody></table>

test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Goede ontwikkeling van het zenuwstelsel omvat de vorming van de bloed-hersen barrière, de diffusie barrière die strak regelt de toegang tot het zenuwstelsel en beschermt zenuwweefsel tegen toxines en pathogenen. Defecten in de vorming van deze barrière zijn gecorreleerd met neuropathieën, en de afbraak van deze barrière is waargenomen bij veel neurodegeneratieve ziekten. Daarom is het van cruciaal belang om de genen te identificeren die de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière reguleren om mogelijke therapeutische doelen te identificeren. Om de exacte rollen die deze genen spelen in neurale ontwikkeling te begrijpen, is het noodzakelijk om de effecten van veranderde genexpressie op de integriteit van de bloed-hersen barrière te testen. Veel van de moleculen die functioneren in de oprichting van de bloed-hersen barrière zijn gevonden om te worden bewaard over eukaryotische soorten, met inbegrip van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster. Fruit vliegjes hebben bewezen een uitstekend modelsysteem te zijn voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die de ontwikkeling en functie van het zenuwstelsel reguleren. Dit protocol beschrijft een stapsgewijze procedure voor de bepaling van de integriteit van de bloed-hersen barrière tijdens de embryonale en larvale stadia van de ontwikkeling van D. melanogaster .

De hier beschreven methoden zorgen voor de visualisatie van de integriteit van de BBB in het CZS in D. melanogaster embryo's en larven (Figuur 1). Na voltooiing van BBB formatie in de late embryogenese, de BBB functies om grote moleculen uit de hersenen en VNC5uitsluiten. Dit protocol maakt gebruik van deze functie om BBB-vorming te testen. Wanneer wild-type (Oregon R) laat stadium 17 (20 − 21 h oude) embryo's werden geïnjecteerd met 10 kDa dextran geconjugee...

Integriteit van de bloed-hersen barrière is essentieel voor de functie van het zenuwstelsel. In Drosophila melanogasterwordt de bloed-hersen barrière gevormd door gliacellen tijdens de late embryogenese. Dit protocol beschrijft methoden voor het testen van de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière in D. melanogaster -embryo's en derde instar larven.

Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de genetische regulatie van de vorming en het onderhoud van de bloed-hersenbarrière tijdens meerdere stadia van drosophila ontwikkeling. Deze methode kan ook worden aangepast om de doorlaatbaarheid van andere barrières te onderzoeken, zoals het darmeptheel in een verscheidenheid van organismen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt evaluatie van de bloed-hersenbarrière functie in levende weefsels.Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat de steekproefmanipulaties moeilijk kunnen zijn en veel stappen veel aandacht voor detail vereisen. Voor embryo inzameling plaats een minimum van 50 maagdelijke wijfjes met 20 tot 25 mannetjes per fles met het voedsel van de Maaltijd Agar van het Graan en incubbate deze vliegen één tot twee dagen alvorens de inzamelingen te beginnen. De dag voor de collectie, warme appelsap agar borden op 25 graden Celsius 's nachts.De volgende ochtend breng de kooldioxide verdoofde vliegen naar een collectie kooi en plaats een voorverwarmde appelsap agar plaat met een klein uitstrijkje van gistpasta op het open uiteinde v

assay-for-blood-brain-barrier-integrity-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Gedrag assays voor het meten van motorische functies, leren en geheugen capaciteiten...

Het testen van Beweegwijzer, leren en geheugen Tekortkomingen in Drosophila Modellen van Neurodegeneratie

Drosophila melanogaster is een genetisch en gedragsmatig soepel model systeem dat is gebruikt om de moleculaire en cellulaire basis van een groot aantal belangrijke biologische processen meer dan een eeuw een begrip. Drosophila goed is benut om inzicht te krijgen in de genetische basis van vlieg gedrag.

Methoden om Assay Drosophila Gedrag

This video demonstrates a procedure for assessing blood-brain barrier disruption in an EAE mouse model. Fluorescent dyes of different sizes are injected retro-orbitally and circulate through the brain's blood vessels. The smaller dye leaks through gaps into the brain tissue, while the larger dye enters only if the disruption is severe, correlating with the extent of barrier damage.

Determining Blood-Brain Barrier Disruption Using Fluorescent Dyes in an EAE Mouse Model

Hier beschrijven we twee testen die zijn opgericht om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie van de dopaminerge (DA) neuronen studeren...

Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Het protocol beschrijft een eenvoudige test om te identificeren van Drosophila melanogaster larven die hypoxie onder normale atmosferische zuurstofniveaus ondervindt. Dit protocol staat hypoxische larven te onderscheiden van andere mutanten die aantonen dat overlappende fenotypen zoals traagheid of trage groei.

Een gravende/Tunneling Assay voor het opsporen van hypoxie in Drosophila melanogaster larven

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

Dit protocol beschrijft een methode om vast te leggen van de aflopende elektrische activiteit van het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster zodat de kosten-efficiënte en handige testen van farmacologische agenten, genetische mutaties van neurale eiwitten, en/of de rol van onontgonnen fysiologische trajecten.

Elektrofysiologische opname van de activiteit van het centrale zenuwstelsel van derde-Instar Drosophila Melanogaster

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

Dit protocol presenteert een betrouwbare methode om de integriteit van de bloed-hersenbarrière (BBB) in volwassen zebravissen (Danio rerio) model te beoordelen met behulp van Evan's op blauwe kleurstof gebaseerde beoordeling, waardoor zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse van neurovasculaire verstoring mogelijk is.

Visualisatie van de poortwachter: Evan's op blauwe kleurstof gebaseerde beoordeling van de doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière bij volwassen zebravissen

Leer de integriteit van de bloed-hersenbarrière te testen in Drosophila melanogaster embryo's en larven met behulp van injectietechnieken en confocale microscopie. Deze methode biedt inzicht in genetische regulatie en zenuwstelselbescherming.

Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster

Meer video's verkennen