Name: Analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor het meten van mitochondriale ademhaling en glycolyse in hematopoëtische stam voorlopercellen (HSPCs) uit murine beenmerg. Deze methode verbetert celviabiliteit en faciliteert nauwkeurige metabolische analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt deels gesteund door de steun van de National Institutes of Health (HL131645, CA016058), de Stichting van de St. Baldrick en de Pelotonia Foundation.

Dit protocol werd goedgekeurd door Nationwide Children's Hospital Animal Care and use Committee (IACUC).
Opmerking: Het protocol wordt beschreven in chronologische volgorde die over de periode van twee dagen overspant. Gebruik verse reagentia zoals beschreven in het onderstaande protocol.
1. bereiding van de reagentia op de dag voorafgaand aan de bepaling
<ol><li>
Hydrateer de sensor cartridge.
	<ol>
<li>Incuberen 5 mL van het ijkmiddel (tafel van de materialen) in een niet-CO2 37 °c-incubator 's nachts.</li>
		<li>Open de flux assay kit (tabel met materialen) en scheid de sensor cartridge (groen; boven) van de Utility Plate (transparant; onder). Plaats vervolgens de sensor cartridge ondersteboven en grenzend aan de Utility Plate.</li>
		<li>Vul met steriel water de putjes van het hulp bord (200 μL) en de kamers rond de putjes (400 μL).</li>
		<li>Dompel de sensor cartridge in de hulp plaat en zorg ervoor dat de sensoren volledig bedekt zijn met water. Tik 3x om de vorming van bubbels te voorkomen.</li>
		<li>Plaats de cartridge 's nachts in de bijkeuken in een niet-CO2 37 °c-incubator. Om verdamping van het water te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de incubator goed wordt bevoficeerd. Plaats een open bekerglas met H2O als extra voorzorgsmaatregel naast de cartridge-Utility Plate, met name bij gebruik van een gewone oven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maak de test plaat klaar.
	<ol>
<li>Steriliseer het oppervlak van bioveiligheid Cabinet klasse 2 met 70% ethanol. Open de test plaat onder de motorkap.</li>
		<li>Voeg 40 μL in de handel verkrijgbare 0,01% (w/v) poly-L-lysine (PLL) oplossing toe aan elk goed van de test plaat onder de motorkap.</li>
		<li>Dek de test plaat af met het deksel dat in de kit is meegeleverd. Incuberen de gesloten test plaat bij kamertemperatuur (RT) onder de motorkap gedurende 1 uur. Opmerking: Het doel van de incubatie is om PLL het oppervlak van de test plaat te laten verlijmen om de hechting van de suspensie cellen aan het oppervlak van de test plaat te vergemakkelijken.</li>
		<li>Verwijder na 1 uur incubatie van de test plaat de overtollige oplossing met een steriele, op vacuüm gebaseerde aspirator en lucht droog de put onder de motorkap. Opmerking: Het duurt ~ 30 − 60 min naar lucht-droog de putjes van de test plaat na de overmatige PLL verwijderen met behulp van de aspirator.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dag van de test
<ol><li>Maak de cartridge klaar.
	<ol>
<li>Til de sensor cartridge op. Plaats het ondersteboven in de weefselcultuur kap en gooi het water weg van het hulp bord.</li>
		<li>Vul de bijkeuken met 200 μL van het voorverwarmde ijkmiddel.</li>
		<li>Vul de kamers rond de putjes met 400 μL van het ijkmiddel.</li>
		<li>Dompel de sensor cartridge in de hulp plaat en zorg ervoor dat de sensoren volledig door het ijkmiddel worden afgedekt. Tik 3x om de vorming van bubbels te voorkomen.</li>
		<li>Het sensor patroon wordt in een incubator van niet-CO2 37 °c ondergedompeld in de gebruiks plaat gedurende 45 − 60 minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Oogst muriene beenmerg-afgeleide LSK Hspc's.
	<ol>
<li>Om voldoende biologische replicaten te kunnen gebruiken, is het van plan om Hspc's van de ene muis per put van de test plaat te maken. Opmerking: Deze beenmerg-oogst methode biedt ~ 50000 − 80000 LSK Hspc's van elke muis. Dit protocol voor het meten van extracellulaire flux is geoptimaliseerd voor ~ 70.000 LSK Hspc's per put van een 96 goed plaat.</li>
		<li>Euthanize muizen met CO2 overdosis en cervicale dislocatie, na lokale IACUC goedgekeurde methoden.</li>
		<li>Steriliseer het oppervlak van ontsnij gereedschappen en de Bank met 70% ethanol.</li>
		<li>Voor elke muis vult u een Petri schaaltje met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) bij RT. Opmerking: Gebruik geen voorgekoelde PBS omdat deze in de volgende stappen er klontjes zal maken.</li>
		<li>Spray 70% ethanol (v/v) op de hele geëeuthaniseerde muis. Isoleer alle botten, met inbegrip van de bovenste en onderste ledematen, heup beenderen, borstbeen, ribbenkast en wervelkolom, van de muis17,18. Trek wit materiaal uit het ruggenmerg van de muis omdat het LSK-cellen kan besmetten. Plaats alle botten in 1x PBS (+ 2% FBS), zoals ze worden verzameld, in een Petri schaaltje tot verder gebruik.</li>
		<li>Inverteer een conische buis van 50 mL (elke keer nieuw) en gebruik deze om de botten te tritureren ondergedompeld in 1x PBS (+ 2% FBS) in de Petri schaal.</li>
		<li>Pipetteer met een serologische Pipet van 10 mL op en neer (~ 10x) om cellen gelijkmatig uit de botten te spoelen, na het breken van de botten.</li>
		<li>Plaats een 40 μm celzeef op een conische buis van 50 mL. Pre-Bevochtig het oppervlak van de zeef door 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS) te passeren.</li>
		<li>Oogst beenmerg-afgeleide celsuspensie uit stap 2.2.7 en geef deze door het pre-natte oppervlak van de celzeef om botpuin te verwijderen.</li>
		<li>Herhaal de stappen 2.2.6 tot en met 2.2.9 totdat alle botmaterialen wit worden als een marker die de meeste beenmergcellen in de conische buis van 50 mL worden verzameld. Opmerking: Het duurt vaak 2 50 mL conische buizen per muis te verzamelen alle cellen van het beenmerg-afgeleide.</li>
		<li>Centrifugeer 50 mL conische buisjes met beenmergcellen gedurende 5 min bij 500 x g en RT.</li>
		<li>Verwijder het supernatant. Respendeer cellen met beenmerg (Combineer de inhoud van beide buisjes van 50 mL) in 5 mL 1x PBS (+ 2% FBS) als een definitief volume en houd de cellen op RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Oogst mononucleated Murine beenmergcellen.
	<ol>
<li>Voeg 5 mL dichtheidsgradiënt medium (d.w.z. Ficoll) toe aan een conische buis van 15 mL. Voeg vervolgens langzaam 5 mL beenmerg celsuspensie toe. Zorg ervoor dat cellen als een laag boven de dichtheidsgradiënt blijven.</li>
		<li>Centrifugeer 30 min bij 500 x g en RT. Gebruik geen rem in de centrifuge. Zorg ervoor dat de centrifuge bij de laagst mogelijke acceleratie is (bijv. 1 versnelling en 0 vertraging).</li>
		<li>Oogst de middelste interface van mononucleated cellen (witte kleur) na centrifugeren in een nieuwe conische buis van 15 mL.</li>
		<li>Was cellen, geoogst uit dichtheidsgradiënt medium, met 5 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °c. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Herhaal stap 2.3.4.</li>
		<li>Rebreng de celinhoud van de buis in 300 μL van 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 μL celsuspensie voor ongekleurde of éénkleurige controle in een FACS buis.</li>
	</ol></li>
	<li>Oogst LSK Hspc's van mononucleated Murine beenmergcellen.
	<ol>
<li>Maak een cocktail van biotine-antilichamen door 3 μL per monster van de volgende antilichamen te mengen: GR1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Voeg 15 μL biotin-antilichaam cocktail toe aan 300 μL mononucleated beenmergcellen. Opmerking: Elk antilichaam wordt gebruikt bij 1:100 verdunning.</li>
		<li>Incuberen cellen met de cocktail van biotin-antilichamen gedurende 30 minuten bij 4 °C met roeren om te voorkomen dat cellen in de bodem van de buis klonteren.</li>
		<li>Voeg 10 mL voorgekoelde 1x PBS (+ 2% FBS) toe aan cellen vermengd met de cocktail van biotin-antilichamen.</li>
		<li>Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °c. Gooi de supernatant weg en regeer de celpellet in 400 μL 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 μL voor streptavidine-enkele kleur regeling.</li>
		<li>Kort Vortex anti-Biotine microbeads (tabel van de materialen) voor gebruik. Voeg 80 μL microbeads toe aan elk celmonster (van 400 μL). Meng goed en inbroed 20 minuten bij 4 °C, met agitatie.</li>
		<li>Voeg 10 mL voorgekoelde 1x PBS (+ 2% FBS) toe aan cellen. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °c.</li>
		<li>Gooi de supernatant weg en regeer de celpellet in 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Bewaren bij 4 °C bij het instellen van de magnetische scheidings eenheid.</li>
		<li>Plaats een kolom (tabel met materialen) in het magnetische veld van het magnetisch geassisteerde celsorteerscheidings teken (Macs) bij 4 °c. Bereid de kolom voor magnetische scheiding door deze met 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) onder de zwaartekracht bij 4 °C te spoelen.</li>
		<li>Voeg de celsuspensie van stap 2.4.7 toe aan de pre-natte kolom bij 4 °C. Laat de cellen door de kolom passeren bij 4 °C en verzamel effluent in een conische buis van 15 mL. Opmerking: De breuk met niet-gelabelde cellen in dergelijke effluent vertegenwoordigt de verrijkte Lineage negatieve cellen.</li>
		<li>Spoel de kolom met 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) bij 4 °C. Herhaal 3x. Vang de doorstroom en houd deze bij 4 °C. Tel de geeleerde levensvatbare cellen door trypeen blauwe uitsluiting met behulp van een hemocytometer.</li>
		<li>Centrifugeer de conische buis van 15 mL met de doorstroming gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °c. Gooi het supernatant weg. Respendeer cellen in 0,5 mL 1x PBS (+ 2% FBS) en breng de inhoud over naar een FACS Tube.</li>
		<li>Voeg 24 μL van de cocktail van het antilichaam van LSK toe aan elke 107 cellen. De antilichaam cocktail bevat een gelijke concentratie van 450-streptavidine antilichaam, PE-CY7-Sca1 antilichamen, en APC-c-Kit antilichamen.</li>
		<li>Inincuberen gedurende 1 uur bij 4 °C met agitatie onder donker (bedekt met blik folie).</li>
		<li>Voeg 3 mL 1x PBS (+ 2% FBS) toe aan de FACS Tube. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g en 4 °c. Gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Respendeer cellen met een antilichaam label in 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS). Voeg 1 μL van 1 mg/mL propidium jodide toe aan de celsuspensie vlak voor het sorteren.</li>
		<li>Filter inhoud van de FACS buis met behulp van een 40 μm zeef rechts voor het sorteren van LSK cellen.</li>
		<li>Verzamel LSK-cellen, via FACS sortering, in 1,5 mL tube met 0,5 mL complete media aangevuld met 2 mM glutamine, 3 mg/mL glucose, 1 mM pyruvate, 1x trombopoietin (TPO), 1x stamcel factor (SCF), 0,5 x penicillaire/streptomycine (P/S), pH 7,4 (tabel 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. mitochondriale ademhaling en glycolyse-assays van LSK-Hspc's
<ol><li>
LSK zaaien in de test plaat
	<ol>
<li>Centrifugeer LSK-cellen uit stap 2.4.17 gedurende 5 minuten bij 500 x g en RT. Gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Respendeer cellen in volledige media tot een uiteindelijke concentratie van ten minste 70.000 cellen/40 μL.</li>
		<li>Zaad inhoud van 40 μL media (bevattende 70.000 cellen) in de PLL-gecoate 8-well plaat uit stap 1.2.4. Laat alle hoek putten leeg.</li>
		<li>Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 450 x g en RT. Breng de rem niet aan. Zorg ervoor dat de cellen zijn bevestigd aan de put bodem met behulp van de omgekeerde Microscoop.</li>
		<li>Voeg 135 μL complete media toe aan de cellen in elke put voor een eindvolume van 175 μL. Voeg 175 μL complete media toe aan de 2 hoeken van de plaat als blanco.</li>
		<li>Incueren de cellen in de niet-CO2 incubator voor 2 uur bij 37 °c.</li>
		<li>Stel een programma in om drugs toe te voegen aan elk goed van het goed plaatje in de Analyzer met behulp van een metriek zoals beschreven in tabel 2 (mitochondriale stresstest) en tabel 3 (glycolyse stresstest). Opmerking: terwijl cellen worden geïnbroed, zet u het apparaat aan en controleert u of het op 37 °C staat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitochondriale stresstest
	<ol>
<li>Bereid 45 μM stamoplossingen van oligomycine, 50 μM carbonyl cyanide 4-(trifluromethoxy) fenylhydrazone (FCCP) en 25 μM stamoplossingen van rotenone/antimycine A. Om 45 μM oligomycine voorraadoplossing te bereiden, lost u de inhoud van het in de handel verkrijgbare etui op in 280 μL van de volledige media. Om een FCCP-voorraadoplossing van 50 μM te bereiden, lost u de inhoud van het in de handel verkrijgbare etui op in 288 μL van de volledige media. Om 25 μM rotenone/antimycine een stamoplossing te bereiden, lost u de inhoud van het in de handel verkrijgbare etui op in 216 μL van de volledige media.</li>
		<li>Neem de sensor cartridge in de hulp plaat uit de incubator en laad de poorten (A, B en C) zodanig dat elk goed de uiteindelijke concentratie van 2 μM oligomycine, 1,5 μM FCCP en 0,5 μM rotenone/antimycine A heeft, indien nodig, volgens de verdunnings gegevens zoals beschreven in tabel 4 (voor het zuurstofverbruik).</li>
		<li>Verwijder het deksel van de sensor cartridge die in de hulp plaat is gemonteerd en plaats deze in het instrumenten bakje. Start de kalibratie die 20 minuten duurt.</li>
		<li>Na de kalibratie, verwijder de Utility plaat en vervang deze door een test plaat met LSK cellen, die nu worden gehecht aan de bodem van de put.</li>
		<li>Druk op Doorgaan om het programma te starten dat wordt beschreven in tabel 2. Na de voltooiing van het programma, de gegevens op te halen en te analyseren met behulp van de Wave Desktop software. Opmerking: De gegenereerde gegevens uit de extracellulaire flux testen kunnen worden uitgezet met behulp van de puntplot van de Wave Desktop software of geëxporteerd naar het webgebaseerde Statistiekprogramma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Glycolyse stresstest
	<ol>
<li>Reconstitueer glucose in 300 μL (100 mM), oligomycine in 288 μL (50 μM), 2-D glucose (2-DG) in 300 μL (500 mM) volledige media uit het in de handel verkrijgbare zakje.</li>
		<li>Pipetteer voorzichtig op en neer (~ 10x) om de verbindingen te solubiliseren. Vortex het 2-DG gedurende ongeveer 1 minuut om een juiste oplossing in de media te garanderen.</li>
		<li>Verwijder de sensor cartridge uit de incubator. Laadpoorten A tot en met C volgende verdunnings meetwaarden beschreven in tabel 5 om een eindconcentratie van 10 mm glucose, 2 μM oligomycine en 50 mm 2-DG te verkrijgen.</li>
		<li>Herhaal stap 3.2.3 en 3.2.4.</li>
		<li>Druk op Doorgaan om het programma te starten dat is beschreven in tabel 3. Na de voltooiing van het programma, de gegevens op te halen en te analyseren met behulp van de Wave Desktop software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+origin%2C+development%2C+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+diet%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li>
<li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+change%3A+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li>
<li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125(2016).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li>
<li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+Mitochondria%2C+Metabolism%2C+and+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li>
<li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901(2015).</li>
<li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li>
<li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li>
<li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li>
<li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li>
<li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis%3A+therapeutic+targets+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility%3A+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li>
<li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li>
<li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism%3A+Culprits+or+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li>
<li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li>
<li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li>
<li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier tonen we de isolatie van een maximale hoeveelheid zuivere en levensvatbare Murine LSK HSPCs populatie, evenals de meting van hun glycolyse en mitochondriale ademhaling met een extracellulaire flux Analyzer. Het protocol overkomt met name de volgende technische problemen voor het gebruik van LSK Hspc's: i) de lage frequentie van LSK-Hspc's in het lymfklier beenmerg14, II) lage basale metabole activiteit van LSK hspc's26, III) de FRAGILITEIT van LSK hspcs<sup class="xref...

Aangezien de levensduur van de meeste volwassen bloedcellen kort is, de homeostase van bloed berust op de zelf vernieuwing en differentiatie van een langlevende maar zeldzame populatie van hematopoietische stamcellen (HSPCs)1. Hspc's zijn stilaan, maar ze zijn snel te vermenigvuldigen en differentiëren op stimulatie om de eisen van het bloedsysteem te ondersteunen. Aangezien elke HSPC cellulaire staat een unieke bioenergetische vraag vereist, zijn de metabole veranderingen belangrijke drijf-en- Daarom, het verlies van metabole plasticiteit, door het veranderen van het evenwicht tussen quiescentie, zelf vernieuwing, en differentiatie van Hspc's, leidt vaak tot myelo-of LYMPHO-proliferatieve stoornissen. Samen is het begrip van metabole regulering van de ontwikkeling van hspc van cruciaal belang om mechanismen te ontdekken die onderliggende hematologische maligniteiten2,3,4,5vormen.
Mitochondriale ademhaling en glycolyse genereren ATP om intracellulaire reacties te stimuleren en produceren de bouwstenen die nodig zijn voor Macromolecuul synthese. Aangezien Hspc's lage mitochondriale massa in vergelijking met gedifferentieerde cellen6 en ze ondersteunen quiescentie in hypoxische beenmerg niches, hspc's voornamelijk vertrouwen op glycolyse. Activering van Hspc's verbetert hun mitochondriale metabolisme dat leidt tot het verlies van de quiescentie en hun daaropvolgende binnenkomst in de celcyclus. Dergelijke metabole plasticiteit van hspc's maakt het mogelijk om de hspc-pool te onderhouden gedurende het hele volwassen leven6,7,8,9,10,11,12. Daarom is het van cruciaal belang om hun metabole activiteiten te onderzoeken, zoals het zuurstofverbruik (OCR; index van oxidatieve fosforylering) en de extracellulaire verzuring rate (ECAR; index van glycolyse) om de HSPC-activatie en de gezondheidsstatus te analyseren. Zowel de OCR als de ECAR kunnen gelijktijdig worden gemeten, in real-time, met behulp van een extracellulaire flux Analyzer. De huidige methode vereist echter een groot aantal cellen en is geoptimaliseerd voor aanhandige cellen13. Aangezien Hspc's niet kunnen worden geïsoleerd in grote hoeveelheden van muizen14, vereisen sortering om een zuivere populatie te verkrijgen, zijn niet-aanhandende cellen15en kunnen niet 's nachts worden gekweekt zonder differentiatie te vermijden16, het is moeilijk om de OCR en de ECAR van hspc's te meten. Hier bieden we een set van duidelijke, stapsgewijze instructies om video-gebaseerde tutorials te begeleiden over het meten van metabole ademhaling en glycolyse van enkele duizenden muriene beenmerg-LineageNEGSca1+c-Kit+ (LSK) hspcs.

<table><tbody><tr><td>0.01% (w/v) poly-L-lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>Gebaat voor LSK-aanhechting</td></tr><tr><td>40 &micro;m celstrainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Gebaat voor celfiltratie na botbreuk</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td>Gebaat voor Lin-scheiding</td></tr><tr><td>Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td>Gebaat voor Lin-scheiding</td></tr><tr><td>Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3</td><td>BD Biosciences</td><td>553019</td><td>Gebaat voor Lin-scheiding</td></tr><tr><td>Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td>Gebaat voor Lin-scheiding</td></tr><tr><td>Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>Gebaat voor Lin-scheiding</td></tr><tr><td>Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>Gebaat voor Lin-scheiding</td></tr><tr><td>CD117 (c-Kit) Monoklonaal Antilichaam (2B8), APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Gebaat voor LSK-sortering</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Gebaat bij celisolatie</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Gebaat bij celisolatie</td></tr><tr><td>Falcon Ronde-bodem Polypropylene Tubes</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-11A</td><td>Gebaat voor LSK-sortering</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Neuromics</td><td>FBS001-HI</td><td>Gebaat in FACS buffer</td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td>Gebaat voor ficoll gradiënt scheiding</td></tr><tr><td>L-glutamine 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>Gebaat voor het assay medium</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Gebaat voor Lin-scheiding</td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoklonaal Antilichaam (D7), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>Gebaat voor LSK-sortering</td></tr><tr><td>Murine Stamcel Factor (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>250-03-100UG</td><td>Gebaat voor het assay medium</td></tr><tr><td>Murine Trombopoïetine (TPO)</td><td>PeproTech</td><td>315-14-100UG</td><td>Gebaat voor het assay medium</td></tr><tr><td>PBS 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>Gebaat voor FACS buffer</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Gebaat voor het assay medium</td></tr><tr><td>Propidium Jodide</td><td>Fisher Scientific</td><td>P1304MP</td><td>Gebaat voor LSK-sortering</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Cel Cultuur Miniplate</td><td>Agilent Technologies</td><td>103025-100</td><td>Gebaat voor LSK-zaaien</td></tr><tr><td>Natrium Pyruvaat (100 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td>Gebaat voor het assay medium</td></tr><tr><td>Streptavidine eFluor 450 Conjugaat</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>Gebaat voor LSK-sortering</td></tr><tr><td>XF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>100840-000</td><td>Gebaat voor cartridge gelijkmaking</td></tr><tr><td>XF medium</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>Gebaat voor het assay medium</td></tr><tr><td>XFp Glycolyse Stress Test Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>103017100</td><td>Geneesmiddelen voor glycolyse stress test</td></tr><tr><td>XFp Mitochondriale Stress Test Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>103010100</td><td>Geneesmiddelen voor mitochondriale stress test</td></tr><tr><td>XFp Sensor Cartridge</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td>Gebaat voor glycolyse en mitochondriale stress test</td></tr></tbody></table>

analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) hebben een duidelijke metabole plasticiteit, waardoor ze kunnen overgaan van hun rusttoestand naar een differentiatie toestand om de eisen van de bloedvorming te ondersteunen. Echter, het is moeilijk om de metabole status te analyseren (mitochondriale ademhaling en glycolyse) van Hspc's vanwege hun beperkte aantallen en het ontbreken van geoptimaliseerde protocollen voor niet-aanhandige, fragiele Hspc's. Hier bieden we een set van duidelijke, stapsgewijze instructies voor het meten van metabole ademhaling (zuurstofverbruik; OCR) en glycolyse (extracellulaire verzuring; ECAR) van muriene beenmerg-LineageNEGSca1+c-Kit+ (LSK) hspcs. Dit protocol biedt een hogere hoeveelheid LSK-Hspc's van muriene beenmerg, verbetert de levensvatbaarheid van Hspc's tijdens de incubatie, vergemakkelijkt extracellulaire flux analyses van niet-aanhangende Hspc's en biedt geoptimaliseerde injectie protocollen (concentratie en tijd) voor geneesmiddelen gericht op oxidatieve fosforylering en glycolytische trajecten. Deze methode maakt de voorspelling van de metabole status en de gezondheid van Hspc's tijdens de ontwikkeling van het bloed en ziekten.

Met onze extractiemethode konden we tot ~ 80.000 LSK Hspc's per muis oogsten. De levensvatbaarheid en aantallen LSK cellen werden verbeterd met onze methode, omdat wij: (1) gecombineerde beenmerg van bovenste en onderste ledematen, heup botten, borstbeen, ribbenkast, en wervelkolom, (2) vermeden met behulp van rode cel lysis buffer die zou hebben verhoogd cel-dood en klonteren, (3) gebruikt de dichtheidsgradiënt middelmatige scheiding van mono-nucleated cellen, en (4) vermeden met behulp van voorgekoelde buffer die zou h...

Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) overgang van een rusttoestand naar een differentiatie toestand als gevolg van hun metabole plasticiteit tijdens de bloedvorming. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van Hspc's.

Analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Metabolische veranderingen in hematopoietische stam- en voorlopercellen stellen hen in staat om over te stappen van hun rustige toestand naar een differentiatietoestand om eisen van bloedvorming te ondersteunen. Verandering in metabole plasticiteit van hematopoietische stam- en voorlopercellen leidt tot hematologische aandoeningen. Ons protocol zal helpen meten van de metabole regulatie en de gezondheid van hematopoietische stam- en voorlopercellen tijdens de bloedontwikkeling en ziekten.Analyse van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van hematopoietische stam- en voorlopercellen is moeilijk omdat ze kwetsbaar en zeldzaam zijn. Ons geoptimaliseerde protocol maakt het mogelijk om een hogere hoeveelheid hematopoietische stam- en voorlopercellen uit murinebeenmerg te isoleren, verbetert hun levensvatbaarheid tijdens incubatie, vergemakkelijkt extracellulaire fluxanalyse van niet-aanhangende HSPCs en biedt geoptimaliseerde injectieparameters voor medicijntargeting oxidatieve fosforylatie en glycolytische paden. Om deze procedure te beginnen, vul de putten van de hulpplaat en de kamers rond de putten met steriel water.Dompel de sensorcartridge onder in de hulpplaat om ervoor te zo

analysis-of-hematopoietic-stem-progenitor-cell-metabolism

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De kolonievormende cel (CFC) assay is een in vitro assay waarin hematopoietische voorlopercellen vormen kolonies in een semi-vast medium. Een combinatie van kolonie morfologie, celmorfologie en flowcytometrie worden gebruikt om het vermogen van de voorouders te laten groeien en differentiëren langs de verschillende hematopoietische lijnen te beoordelen.

Colony Forming Cell (CFC) test voor humane hematopoietische cellen

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Dit protocol biedt stapsgewijze richtlijnen voor het opzetten van competitieve muisbeenmergtransplantatie-experimenten om hematopoëtische stam-/voorlopercellenfunctie te bestuderen zonder voorafgaande zuivering van stamcellen door celsortering.

Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer

We beschrijven een methode voor het gebruik van Multi parameter flow cytometrie te detecteren mitochondriale reactieve zuurstof soorten (ROS) in Murine gezonde hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPCs) en leukemie cellen van een muismodel van acute myeloïde leukemie (AML) gedreven door MLL-AF9.

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

Xenobiotic Efflux pompen zijn zeer actief in hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) en veroorzaken extrusie van TMRM, een mitochondriale membraan potentiële fluorescerende kleurstof. Hier presenteren we een protocol om het mitochondriale membraan potentieel in Hspc's met TMRM nauwkeurig te meten in aanwezigheid van verapamil, een effluxpomp remmer.

Verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen

Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het meten van de mitochondriale massa en membraan potentieel in ex vivo gekweekte hematopoietische stamcellen en T-cellen.

Meting van het mitochondriale massa-en membraanpotentiaal in hematopoietische stamcellen en T-cellen doorstroming Cytometrie

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de isolatie en kleuring van muriene beenmergcellen tot fenotype hemopoietische stam- en voorlopercellen, samen met de ondersteunende niche endotheel- en mesenchymale stamcellen. Een methode om cellen in endosteale en centrale beenmerggebieden te verrijken, is ook inbegrepen.

Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

Hier wordt een op flowcytometrie gebaseerde techniek gepresenteerd die het mogelijk maakt om tegelijkertijd het aantal celdelingen, het fenotype van de oppervlaktecel en de cellulaire verwantschap te meten. Die eigenschappen kunnen statistisch worden getest met behulp van een op permutatie gebaseerd raamwerk.

Gelijktijdige beoordeling van verwantschap, delingsgetal en fenotype via flowcytometrie voor hematopoëtische stam- en voorlopercellen

Hier presenteren we een protocol om metabolieten in zeldzame celtypen nauwkeurig en betrouwbaar te meten. Technische verbeteringen, waaronder een gemodificeerde mantelvloeistof voor het sorteren van cellen en het genereren van relevante blanco monsters, maken een uitgebreide kwantificering van metabolieten mogelijk met een input van slechts 5000 cellen per monster.

Gerichte metabolomics op zeldzame primaire cellen

Leer een geoptimaliseerd protocol voor het meten van mitochondriale ademhaling en glycolyse in hematopoëtische stam voorlopercellen (HSPCs) uit murine beenmerg. Deze methode verbetert celviabiliteit en faciliteert nauwkeurige metabolische analyses.

Analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme

Meer video's verkennen