Name: Licht spot-gebaseerde assay voor analyse van Drosophila larval phototaxis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Leer een lichtspot-assay voor gedragsanalyse van Drosophila-larven. Deze methode volgt fototactisch gedrag met infraroodbeeldvorming en identificeert neuronale mechanismen achter lichtontwijking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door Natural Science Foundation of China (31671074) en fundamentele onderzoeksfondsen voor de Zhejiang provinciale universiteiten (2019XZZX003-12).

1. bereiding van de larven van Drosophila
<ol><li>Bereid standaard medium bestaande uit gekookte maïsmeel (73 g), agar (5,6 g), sojameel (10 g), gist (17,3 g), siroop (76 mL) en water (1000 mL).</li>
	<li>Hef alle vliegen op 25 ° c op standaard medium in een kamer met een licht/donkere cyclus van 12 h/12 uur.</li>
</ol>2. bereiding van de agar-platen
<ol><li>Bereid 1,0% agar oplossing. Weeg 3 g agar in een bekerglas van 500 mL met een balans en voeg vervolgens 300 mL gedistilleerd water toe. Plaats een folie papier over de BREEKHAMER om te voorkomen dat het water verdampte. Verwarm het bekerglas in een magnetron om te koken.</li>
	<li>Haal het bekerglas eruit en roer goed door een glazen staaf en verwarm vervolgens de kook in een magnetron oven. Herhaal dit totdat de vloeistof volledig transparant en vloeibaar is. Opmerking: de uiteindelijke Hot agar-oplossing moet vrij zijn van luchtbellen; anders zal het gieten van de agar in de plaat resulteren in een ongelijk en gedeukt oppervlak van de agar-plaat, wat het daaropvolgende larvale gedragende testen beïnvloedt. De concentratie van de agar-oplossing mag niet te hoog of te laag zijn. Als de concentratie te hoog is, zal de licht diffuse reflectie op de agar plaat sterk zijn en de licht/donkere grens uitsmeren. Als de concentratie te laag is, zullen de larven sporen achterlaten op de plaat. Beide fouten zullen de videoverwerking later in de Protcol belemmeren.</li>
	<li>Giet de hete agar-oplossing langzaam in een Petri schaaltje (diameter 15 cm) tot de bodem gelijkmatig bedekt is met een laag agar (ca. 4 mm dik) en koel op kamertemperatuur (RT) totdat de agar-oplossing is gestijgd.</li>
	<li>Agar-plaat moet worden gebruikt wanneer het vers wordt bereid. Als dat niet zo is, giet dan een laagje water op het oppervlak en bewaar het in de koelkast bij 4 °C voor later gebruik.</li>
</ol>3. opstelling van het visuele stimulatie systeem
<ol><li>Selecteer de LED-lichtbron: gecollimeerd LED-blauw licht bij 470 nm of warmwit licht. Opmerking: de lichtbron kan worden vervangen door een LED-lampje van een andere golflengte. In dit experiment wordt blauw licht LED als voorbeeld gebruikt.</li>
	<li>Rol een dik stukje aluminiumfolie of zwart karton (zorg voor dekking) om een open cilinder van 12 cm lang te vormen met een diameter die lijkt op die van de blauw-licht-LED met een diameter van 3 cm. Laat de bovenkant van de cilinder de voorkant van de blauw-licht LED bedekken. Bedek het onderste uiteinde met een zwart karton met een klein rond gat (diameter van 0,5 cm) in het midden. Dit vormt de installatie van het lichtbron systeem.</li>
	<li>Bevestig de voorbereide lichtbron met een clip op het ijzeren frame en zorg ervoor dat het LED-lampje in de richting van het bureaublad projecteert. Kantel de cilinder iets. De hoek tussen het cilinder vlak en het verticale vlak is ongeveer 10 ° (Zie Figuur 1). Verbind de 470 nm blauwe LED-lamp met de "LED1"-stekker van de High-Power LED-driver. Zet de bestuurder aan, draai de knop in de rechterbovenhoek van het stuurprogramma om kanaal 470 nmte selecteren en klik vervolgens op LED. Wanneer op het scherm "√" wordt weergegeven, verschijnt er een blauwe lichtvlek op het bureaublad. Opmerking: als de cilinder licht naast het kleine ronde gat lekt, wordt het aanbevolen om zwarte tape op de lekkende delen te gebruiken om ervoor te zorgen dat alleen het gat licht doorheen kan passeren.</li>
	<li>Klik op OK en draai aan de knop om de intensiteit van het licht aan te passen. Draai de knop naar een hogere lichtintensiteit van 50 mA. Meet en noteer het spectrum van het licht met een spectrometer.</li>
	<li>Beweeg de positie van de lichtbron omhoog en omlaag om de diameter van de lichtvlek aan te passen tot 2 cm. Het bureaublad moet zwart zijn voor een beter contrast effect.</li>
	<li>Draai aan de knop om de lichtintensiteit te kiezen volgens de experimentele behoeften. Gebruik een compacte Vermogensmeter console met een standaard fotodiode Power sensor om het maximale en minimale licht vermogen ter plaatse te meten, op te nemen, drie keer te meten en de gemiddelde waarde te nemen. Opmerking: het wordt aanbevolen om een fotodiode vermogenssensor te gebruiken om de lichtintensiteit te meten voor het licht van een specifieke golflengte en een thermische vermogenssensor te gebruiken om de lichtintensiteit voor wit licht te meten.</li>
	<li>Bereken de lichtintensiteit op de lichtvlek door het gemeten licht vermogen te delen door het gebied van de sensor. Opmerking: bijvoorbeeld, als het gemeten licht vermogen in stap 2,6 20 pW is en het gebied van de sensor 0,81 mm2is, is de lichtintensiteit 24,69 PW/mm2 (20 PW delen met 0,81 mm2).</li>
</ol>4. opstelling van het beeldvormings systeem
<ol><li>Klem een high-resolution webcamera met een ijzeren clip, op ongeveer 10 cm boven de lichtvlek op het bureaublad (Figuur 1).</li>
	<li>Pas de oriëntatie van de camera lens naar het bureaublad aan. Verbind de camera met een computer via een USB-interface.</li>
	<li>Plaats een agar-plaat op het bureaublad direct onder de camera.</li>
	<li>Open de "AmCap 9.22"-software op de computer met Windows 7 en de lichtvlek wordt automatisch weergegeven in het venster van AMcap. Beweeg de camera iets naar links of rechts om ervoor te zorgen dat de lichtvlek zich in het midden van het venster bevindt. Zorg ervoor dat de camera het lichtpad niet blokkeert. De lichtvlek moet compleet en rond zijn. Opmerking: de software kan worden gevonden op http://amcap.en.softonic.com/.</li>
	<li>Bevestig een 850 nm ± 3 nm band-pass filter met een clip op 5-7 mm vlak onder de camera. Opmerking: de diameter van het filter is ongeveer 2,5 cm, en de camera lens is minder dan 1 cm in diameter, zodat het filter het gezichtsveld van de camera kan bedekken. Met het filter onder de camera, moet de lichtvlek niet worden gezien in het venster van AMcap.</li>
	<li>Plaats drie infrarood-lichtgenererende Led's (centrale golflengte = 850 nm) gelijkmatig rond de agar-plaat. Elke LED moet ongeveer 5 cm verwijderd zijn van de rand van de agar-plaat en het lens vlak van de LED moet zich op een 70 ° neerwaartse hoek naar de agar-plaat bevinden. Verbind de Led's met de stroom via de AC-naar-DC-omvormer. Opmerking: het is beter om de posities en hoeken van de infraroodlicht LEDs te bevestigen om consistentie van de helderheid van het veld in verschillende experimentele proeven te garanderen en latere videoverwerking te vergemakkelijken.</li>
	<li>Plaats een zwart bord tussen de computer en het apparaat. Stel de helderheid van het computerscherm in om te voorkomen dat het computerscherm licht het experiment beïnvloedt. Opmerking: Houd de omgeving donker bij het meten van de golflengte of intensiteit van het licht.</li>
</ol>5. parameters van Imaging instellen
<ol><li>Kies op het menu van de AMcap-software Opties | Video apparaat | Opname formaaten stel de pixelgrootte van de vastgelegde video in op 800 x 600 en frame rate tot 60 fps.</li>
	<li>Verwijder het filter van onder de camera, plaats een liniaal onder de camera en pas de camera focus aan om de schaal lijn helder en parallel te maken aan de breedte van het video veld van de weergave.</li>
	<li>Klik op vastleggen | Instellen | Video-opname Selecteer het pad opslaan, klik op opname starten, noteer de werkelijke afstand die overeenkomt met 600 pixels en bereken de verhouding van elke pixel tot de werkelijke afstand.</li>
</ol>6. video-opname van licht vermijding gedrag
<ol><li>Handhaaf een temperatuur van 25,5 °C door alle experimenten. Bedien de kamertemperatuur met een airconditioner indien nodig. Houd de luchtvochtigheid constant op 60% met een luchtbevochtiger.</li>
	<li>Neem een korte video van de lichtvlek positie met de naam "lightarea1". Beweeg vervolgens het filter 850 nm ± 3 nm terug om de camera lens te bedekken. Opmerking: bij het opnemen van larvale gedrag wordt de camera lens bedekt door het 850 nm ± 3 nm filter, zodat de lichtvlek niet in de video wordt weergegeven. De lichtvlek kan worden gereconstrueerd in Video's met larven later met MATLAB. Verander de positie van de camera niet, en Vermijd het veranderen van de verhouding van elke pixel naar de werkelijke afstand gemeten in stap 4,3.</li>
	<li>Zet een licht aan (d.w.z. een kamer licht) ver weg van het experimentele apparaat. Zet het licht zo laag mogelijk omlaag, zolang de larven duidelijk met de ogen kunnen worden gezien. Haal de larven uit het kweekmedium met een lepel, kies zachtjes een derde-INSTAR larve en was het schoon met gedistilleerd water. Wees voorzichtig om larve een voor een te wassen om interferentie van honger te voorkomen. Een enkel experiment vereist minstens 20 larven.</li>
	<li>Breng de larve over naar het midden van de agarplaat die onder de camera is geplaatst tijdens stap 3,3. Verwijder voorzichtig overtollig water uit de larve met een borstel of gebruik het blotting-papier om water uit de larve te verwijderen om reflectie van licht onder de lens te voorkomen. Schakel het kamer licht uit en laat de larve 2 minuten acclimeren in de donkere omgeving.</li>
	<li>Zet het LED-lampje aan om infraroodlicht te genereren en borstel de larve voorzichtig in het midden van de plaat. Wanneer de larve recht begint te kruipen, draait u de plaat om de larve naar de lichtvlek te laten gaan. Zorg ervoor dat het direct vanaf het begin crawlt, anders krijgt het mogelijk geen toegang tot de lichtvlek.</li>
	<li>Klik op vastleggen | Instellen | Video -opname om het opslaanspad te selecteren en klik vervolgens op opname starten om op te nemen. Laat de larve in de richting van de lichtvlek kruipen, voer de lichtvlek in en laat de lichtvlek staan totdat deze bijna buiten het gezichtsveld ligt. Klik op opname stoppen. Als de larve zich van de lichtvlek afkeert voordat u in de buurt komt, klikt u direct op opname stoppen.</li>
	<li>Verplaats het filter uit de buurt van de camera. Neem een korte video van de positie van de lichtvlek met de naam "lightarea2" en vergelijk deze met "lightarea1" om ervoor te zorgen dat de lichtvlek positie niet wordt gewijzigd. Als een duidelijke positie verandering wordt waargenomen, gooi de gegevens dan weg.</li>
</ol>7. gegevensanalyse
<ol><li>Gebruik SOS17 om de contour-en bewegingsparameters voor dieren uit Video's te extraheren met behulp van beeldverwerkings methoden zoals eerder beschreven17. Opmerking: parameters inclusief hoofd snelheid (snelheid van larvale hoofd), staart snelheid (snelheid van larvale staart), midSpeed (snelheid van het middelpunt van de skelet lijn larvale) en cmSpeed (snelheid van larvale centroïde) werden gebruikt om de snelheid van de larvale beweging te meten. Parameters met inbegrip van headTheta (de hoek tussen de lijnen van de hoofd-middelpunt en de middelpunt-staart) en headOmega (de veranderende snelheid van headTheta) werden gebruikt voor het meten van larvale lichaams buiging en de hoeksnelheid van buigen.</li>
</ol>

<ol><li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669(1971).</li>
<li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li>
<li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+behavior%3A+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337(1999).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293(2005).</li>
<li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527(2011).</li>
<li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+photobehavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li>
<li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868(2013).</li>
<li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications.+9%22%5BJournal%5D)">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li>
<li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li>
<li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113(2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li>
<li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin.+Feb%22%5BJournal%5D)">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li>
<li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li>
<li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237(2013).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921(2010).</li>
<li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol presenteert de lichtvlek test om het vermogen van Drosophila larven te testen om te ontsnappen aan licht. Deze bepaling maakt het mogelijk om het gedrag van larven te volgen voordat u, tijdens het ontmoeten, en na het verlaten van een lichte vlek. Details van larvale beweging kunnen worden vastgelegd en geanalyseerd. De lichtvlek assay is zeer eenvoudig en heeft een sterke uitvoerbaarheid. De kosten van het hele apparaat zijn niet hoog. In het experiment wordt LED-licht gebruikt als lichtbron. Het k...

De larven van Drosophila melanogaster vertonen duidelijk licht-Vermijd gedrag tijdens de foerageren fase. Drosophila larvale phototaxis is onderzocht, vooral in de afgelopen 50 jaar1,2,3,4,5,6,7 ,8. In de afgelopen jaren, ondanks het feit dat 1) vele neuronen bemiddelend larvale licht vermijding zijn geïdentificeerd4,5,9,10,11,12 en 2) de volledige aansluiting van het larvale visuele systeem bij de resolutie van synapsen is vastgesteld13, de neurale mechanismen onderliggende larvale foto taxi's blijven grotendeels onduidelijk.
Een aantal gedragstesten zijn gebruikt in het bestuderen van larvale phototaxis. Ze kunnen grotendeels onderverdeeld worden in twee klassen: een met betrekking tot ruimtelijke licht gradiënten en de andere met tijdelijke licht gradiënten. Voor ruimtelijk licht gradiënt assays, is de Arena verdeeld in gelijk aantal secties in licht en donker. De Arena kan worden onderverdeeld in lichte en donkere helften2,4 of lichte en donkere kwadranten14,15, of kan zelfs worden gescheiden in alternatieve lichte en donkere pleinen zoals op een dambord7. Meestal worden agar-platen gebruikt voor ruimtelijke licht gradiënt Assay, maar buizen die zijn onderverdeeld in alternatieve lichte en donkere secties kunnen ook worden gebruikt10,14.
In de oudere versie van de assays komt licht verlichting meestal van onder de larven. De verlichting in nieuwere versies komt echter grotendeels van bovenaf, aangezien larvale ogen (bijv. de organen van de Bolwig die gevoelig zijn voor licht intensiteiten met lage of middelzware sterkte16) zijn opgenomen in het ondoorzichtige kopopharyngeale skelet met openingen naar het bovenste front. Dit maakt larven gevoeliger voor licht uit de bovenste voorkant richtingen dan van onderen achter aanwijzingen7. Bij tijdelijke licht gradiënt is de lichtintensiteit ruimtelijk uniform in de Arena, maar de intensiteit verandert in de loop van de tijd. Naast temporaal vierkant Golf licht (d.w.z. knipperen aan/uit of sterk/zwak licht3,7), wordt ook tijdelijk wisselend licht dat voldoet aan een lineaire helling in intensiteit8 gebruikt om de gevoeligheid van larven te meten met een tijdelijk veranderende licht stimulus.
Een derde type fototaxis test is de directionele lichtscape navigatie, waarbij de verlichting van bovenaf onder een hoek van 45 °7plaatsvindt. Voor het werk van Kane et al.7werden alleen Grove parameters zoals het aantal larven in lichte en donkere gebieden, de frequentie van draaien en de lengte van de Trail berekend in de assays van larvale phototaxis. Sinds het werk van deze zelfde groep, met de analyse van hoge temporele resolutie video record voor larvale foto taxi's, gedetailleerde dynamiek van larvale beweging tijdens foto taxi's (dat wil zeggen, directe snelheden van verschillende delen van larvale lichaam, richting, draaihoek en de corresponderende hoeksnelheid) zijn geanalyseerd7. Dus, meer details van larvale phototaxis gedrag hebben kunnen worden ontdekt. In deze assays worden larven getest in groepen, zodat groeps effecten niet worden uitgesloten.
Dit protocol introduceert een lichtvlek test voor het onderzoeken van larvale gedrags responsen op individuele licht stimulatie. De belangrijkste experimentele opstelling bestaat uit een visueel stimulatie systeem en een op infraroodlicht gebaseerd beeldvormings systeem. In het visuele stimulatie systeem genereert een LED-lichtbron een ronde lichtvlek van 2 cm diameter op een agar-plaat, waar de larve wordt getest. De lichtintensiteit kan worden aangepast met behulp van een LED-driver. Het imaging systeem bevat een infraroodcamera die het gedrag van de larve vastlegt naast de 3 850 nm infrarood Led's die verlichting bieden voor de camera. De lens van de camera wordt bedekt door een 850 nm band-pass filter om het licht van het visuele stimulatie systeem van het betreden van de camera te blokkeren, terwijl het infraroodlicht de camera mag betreden. Interferentie van visuele stimulatie op beeldvorming wordt dus voorkomen. In deze test worden de gedrags Details van de snelle reacties van individuele larven binnen een periode, inclusief voor, tijdens en na het invoeren van licht, geregistreerd en geanalyseerd.

<table><tbody><tr><td>850 nm &plusmn; 3 nm infraroodlicht-genererende LED</td><td>Thorlabs, USA</td><td>PM100A</td><td>Compatibele sensoren: Fotodiode en Thermisch Optisch vermogensbereik: 100 pW tot 200 W Beschikbaar sensorgolflengtebereik: 185 nm-25 &mu;m Weergaveverversingssnelheid: 20 Hz Bandbreedte: DC-100 kHz Fotodiode sensorbereik: 50 nA-5 mA Thermopile sensorbereik: 1 mV-1 V</td></tr><tr><td>AC naar DC-omzetter</td><td>Thorlabs, USA</td><td>S120VC</td><td>Openingsgrootte: &Oslash;9,5 mm Golflengtebereik: 200-1100 nm Vermogensbereik: 50 nW-50 mW Detectortype: Si fotodiode (UV Extended) Lineairheid: &plusmn;0,5% Meetonzekerheidc: &plusmn;3% (440-980 nm), &plusmn;5% (280-439 nm), &plusmn;7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td></tr><tr><td>Banddoorlaatfilter</td><td>Thorlabs, USA</td><td>DC2100</td><td>LED-stroombereik: 0-2 A LED-stroomresolutie: 1 mA LED-stroomnauwkeurigheid: &plusmn;20 mA LED-doorlaatspanning: 24 V Modulatiefrequentiebereik: 0-100 kHz sinusgolf Modulatie: Willekeurig</td></tr><tr><td>Gecollimeerde LED blauw licht&nbsp;</td><td>ELP, China</td><td>USBFHD01M</td><td>Max. Resolutie: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710</td></tr><tr><td>Compacte vermogensmeterconsole&nbsp;</td><td>Ocean Optics, USA</td><td>USB2000+(RAD)</td><td>Afmetingen: 89,1 mm x 63,3 mm x 34,4 mm Gewicht: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-elementen lineaire silicium CCD-array) Golflengtebereik: 200-850 nm Integratietijd: 1 ms &ndash; 65 seconden (20 seconden typisch) Dynamisch bereik: 8,5 x 10^7 (systeem); 1300:1 voor een enkele verwerving Signaal-ruisverhouding: 250:1 (volledig signaal) Donkere ruis: 50 RMS-tellingen Tralies: 2 (250 &ndash; 800 nm) Spleten: SLIT-50 Detector-collectielenzen: L2 Order-sortering: OFLV-200-850 Optische resolutie: ~2,0 nm FWHM Verspreid licht: &lt;0,05% bij 600 nm; &lt;0,10% bij 435 nm Glasvezelconnector: SMA 905 naar 0,22 numerieke opening enkelstrengige glasvezel</td></tr><tr><td>High-Power LED-driver</td><td>Minhongshi, China</td><td>MHS-48XY</td><td>Werkspanning: DC12V Centrale golflengte: 850nm</td></tr><tr><td>Hogeresolutie webcamera</td><td>Thorlabs, USA</td><td>MWWHL4</td><td>Kleur: Warm wit Gecorreleerde kleurtemperatuur: 3000 K Teststroom voor typisch LED-vermogen: 1000 mA Maximumstroom (CW): 1000 mA Bandbreedte (FWHM): N/A Elektrisch vermogen: 3000 mW Kijkhoek (volledige hoek): 120? Zendergrootte: 1 mm x 1 mm Typische levensduur: >50 000 h Bedrijfstemperatuur (niet-condenserend): 0 tot 40 &deg;C Opslagtemperatuur: -40 tot 70 &deg;C Risicogroepa: RG1 &ndash; Lage risicogroep</td></tr><tr><td>LED Warm Wit</td><td>Mega-9, China</td><td>BP850/22K</td><td>&Oslash;25,4(+0~-0,1) mm Bandbreedte: 22&plusmn;3nm Piek doorlatendheid:80% Centrale golflengte: 850nm&plusmn;3nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Spectrometer&nbsp;</td><td>Noel Danjou</td><td>Amcap9.22</td><td>AMCap&nbsp;is een stille en video-opname-applicatie met geavanceerde voorbeeld- en opnamefuncties. Het is een desktop-applicatie ontworpen voor computers met Windows 7 SP1 of hoger. De meeste&nbsp;Video-for-Windowsen&nbsp;DirectShow-compatibele apparaten worden ondersteund, of het nu goedkope webcams of geavanceerde video-opnamekaarten zijn.</td></tr><tr><td>Standaard fotodiode-vermogensensor&nbsp;</td><td>Super Dragon, China</td><td>YGY-122000</td><td>Invoer: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Uitvoer: DC 12V 2A</td></tr><tr><td>Thermische vermogenssensor&nbsp;</td><td>Thorlabs, USA</td><td>M470L3-C1</td><td>Kleur: Blauw Nominale golflengte: 470 nm Bandbreedte (FWHM): 25 nm Maximumstroom (CW): 1000 mA Doorlaatspanning: 3,2 V Elektrisch vermogen (max.): 3200 mW Zendergrootte: 1 mm x 1 mm Typische levensduur: 100 000 h Bedrijfstemperatuur (niet-condenserend): 0 tot 40 &deg;C Opslagtemperatuur: -40 tot 70 &deg;C Risicogroep: RG2 &ndash; Matig risicogroep</td></tr><tr><td>Thermische vermogenssensor&nbsp;</td><td>Thorlabs, USA</td><td>S401C</td><td>Golflengtebereik: 190 nm-20 &mu;m Optisch vermogensbereik:10 &mu;W-1 W(3 Wb) Invoeropeningsgrootte: &Oslash;10 mm Actieve detectoroppervlakte: 10 mm x 10 mm Max. optische vermogendichtheid: 500 W/cm2 (gemiddeld) Lineairheid: &plusmn;0,5%</td></tr></tbody></table>

licht spot-gebaseerde assay voor analyse van drosophila larval phototaxis

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

De larven van Drosophila melanogaster vertonen duidelijk licht-Vermijd gedrag tijdens de foerageren fase. Drosophila larvale foto taxi's kunnen worden gebruikt als een model om dier vermijding gedrag te bestuderen. Dit protocol introduceert een lichtvlek test om het larvale phototactische gedrag te onderzoeken. De experimentele opstelling bestaat uit twee hoofdonderdelen: een visueel stimulatie systeem dat de lichtvlek genereert, en een op infraroodlicht gebaseerd beeldvormings systeem dat het proces van larvale licht vermijding registreert. Deze test maakt het volgen van het gedrag van larve mogelijk voordat u, tijdens het ontmoeten, en na het verlaten van de lichtvlek. Details van de larvale beweging, inclusief vertraging, pauze, hoofd Casting en draaien kunnen worden vastgelegd en geanalyseerd met behulp van deze methode.

Volgens het protocol werd de lichtvlek test gebruikt om het licht vermijdings gedrag van de derde INSTAR larve te onderzoeken die op standaard medium op 25 °c werden verhoogd in een ruimte met een licht/donker cyclus van 12 uur/12 uur. Eén enkele w1118 larve werd getest met behulp van de lichtvlek test bij 25,5 °c. De gemiddelde lichtintensiteit van de lichtvlek gegenereerd door een 460 nm LED was 0,59 μW/cm2. Het hele proces van larvale in-en uitstappen van de lichtvlek werd opgenomen en ...

Dit protocol introduceert een lichtvlek test om Drosophila larvale phototactische gedrag te onderzoeken. Bij deze test wordt een lichtvlek opgewekt als licht stimulatie en wordt het proces van het vermijden van larvale licht door een op infraroodlicht gebaseerd beeldvormings systeem vastgelegd.

Licht spot-gebaseerde assay voor analyse van Drosophila larval phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Met behulp van de lichte spottest kan het gedrag voor larven worden gevolgd vóór, tijdens en na het betreden van het lichtgebied, waardoor de details van de larvebeweging kunnen worden geanalyseerd. Deze test is eenvoudig en eenvoudig uit te voeren. De lichtrespons wordt slechts één keer getest, zodat elk mogelijk effect van lichtaanpassing kan worden uitgesloten.Om de agarplaten te bereiden, bedek je langzaam en gelijkmatig de bodem van een petrischaal van 15 centimeter met een ongeveer vier millimeter dikke laag van hete 1%agar. Laat de plaat afkoelen op kamertemperatuur totdat de agar gestold is. Als u het visuele stimulatiesysteem wilt instellen, klemt u een voorbereide LED-lichtbron op een ijzeren frame, waarbij u ervoor wilt zorgen dat het licht naar beneden naar het bureaublad leidt.Kantel de cilinder iets tot de hoek tussen het cilindervlak en het verticale vlak ongeveer 10 graden is. Sluit het 470 nanometer blauwe LED-lampje aan op de LED-één stekker van de high power LED-driver en zet de bestuurder aan. Draai de knop in de rechterbovenhoek van de bestuurder om kanaal 470 nanometer te selecteren en op LED te klikken.Wanneer het scherm een controle weergeeft, verschijnt er

light-spot-based-assay-for-analysis-of-drosophila-larval-phototaxis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video artikel beschrijven we een nieuwe methode waardoor de bouw van odorant hellingen met een stabiele en controleerbaar geometrieën. We in het kort laten zien hoe deze gradiënten gebruikt kunnen worden om te screenen op olfactorische defecten (volledige en gedeeltelijke anosmie) en meer subtiele kenmerken van chemotaxis gedrag te bestuderen.

Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Drosophila melanogaster is een genetisch en gedragsmatig soepel model systeem dat is gebruikt om de moleculaire en cellulaire basis van een groot aantal belangrijke biologische processen meer dan een eeuw een begrip. Drosophila goed is benut om inzicht te krijgen in de genetische basis van vlieg gedrag.

Methoden om Assay Drosophila Gedrag

Drosophila-larven zijn lichtgevoelig en reageren op veranderingen in het omringende licht. Deze video beschrijft een test die hun vermogen om licht te vermijden test, de zogenaamde light spot assay. Het aanbevolen protocol laat zien hoe u de test instelt met een led met blauw licht en laat zien hoe u het gedrag van het dier kunt registreren als reactie op de ontmoeting met het licht.

Light Spot Assay: een methode om drosophila-fototactisch gedrag te onderzoeken

Hier beschrijven we een licht-donker voorkeur test voor Drosophila larven. Deze test geeft informatie over aangeboren en circadiane regulatie van licht sensing en verwerken photobehavior.

Lichte voorkeur Assay om Aangeboren en Circadiaanse Gereglementeerde Photobehavior studeren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In deze video artikel beschrijven we een geautomatiseerde test om het effect van honger of verzadiging op olfactorische afhankelijke voedsel zoekgedrag meten de volwassen fruitvlieg Drosophila melanogaster.

A Single-fly test voor foerageergedrag in Drosophila

Dit rapport beschrijft een methode voor het meten van Drosophila larvenactiviteit met behulp van de TriKinetics Drosophila Activiteitsmonitor. Het apparaat gebruikt infraroodstralen om bewegingen van maximaal 16 individuele dieren te detecteren. Gegevens kunnen worden geanalyseerd om bewegingsparameters weer te geven, inclusief snelheden en de posities van de dieren binnen de testkamers.

Meting van larvale activiteit in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Dit protocol beschrijft een hoogdoorlaattest voor het testen van ei-legvoorkeuren van Drosophila melanogaster met een nauwkeurigheid per enkel dier. Deze test biedt een eenvoudige, efficiënte en schaalbare platform om genen en circuitonderdelen te identificeren die een eenvoudig besluitvormingsproces controleren.

High Throughput Assay to-eierleggende Voorkeuren van de individuele onderzoeken<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit protocol analyseert navigatie gedrag van Drosophila larve in reactie op de stimulatie van de gelijktijdige optogenetic van haar olfactorische neuronen. Licht van 630 nm golflengte wordt gebruikt voor het activeren van individuele olfactorische neuronen uitdrukken van een rood-verschoven kanaal rodopsine. Larvale verkeer gelijktijdig wordt bijgehouden, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van aangepaste-geschreven software.

Bijhouden van Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de Optogenetic van olfactorische neuronen

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

Dit artikel presenteert methoden voor optogenetische manipulatie in Drosophila melanogaster, waarbij CsChrimson en GtACR2 worden gebruikt om specifieke neuronen te activeren en tot zwijgen te brengen. Er worden vier experimenten beschreven om optogenetica te gebruiken om thermotactisch en smaakgedrag te onderzoeken, en inzicht te geven in de onderliggende neurale mechanismen die deze processen beheersen.

Gedragstesten voor optogenetische manipulatie van neurale circuits in Drosophila melanogaster

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

Leer een lichtspot-assay voor gedragsanalyse van Drosophila-larven. Deze methode volgt fototactisch gedrag met infraroodbeeldvorming en identificeert neuronale mechanismen achter lichtontwijking.

Licht spot-gebaseerde assay voor analyse van Drosophila larval phototaxis

Meer video's verkennen