Prospectie van microbiële stammen voor bioremediatie en probiotica ontwikkeling voor Metaorganisme onderzoek en conservering

We kunnen isoleren en assembleren probiotica die zowel kunnen bevorderen koraal gezondheid en tegelijkertijd de impact van vervuiling te verzachten en dat kan bijdragen aan persistentie van een rif in de veranderende wereld. De beschreven isolatie- en screeningsbenadering kan worden gebruikt om micro-organismen te selecteren die belangrijke metabolische activiteiten presenteren, zoals de afbraak van verontreinigende stoffen of andere gunstige eigenschappen voor mariene organismen zoals koralen. Deze methode kan worden toegepast om micro-organismen te isoleren die verontreinigingen kunnen degraderen.

En bovendien kunnen andere bronnen van materiaal worden gebruikt in de andere milieumonsters, zoals planten, bodem, water, alles. Bestudeer de literatuur en probeer zich te concentreren op spanningen die goede kandidaten kunnen zijn voor uw doel. Indien mogelijk, direct de isolatie methoden voor deze stammen en voorkomen dat bekende ziekteverwekkers.

En als u een consortium van bacteriën wilt gebruiken, is het ook erg belangrijk om eerst te onderzoeken of de leden van het consortium antagonistische activiteiten tegen elkaar hebben. Omdat koralen steeds meer risico lopen op uitsterven, begint deze methode wereldwijd te worden gestart en is er een noodzaak om de methode te verspreiden en te standaardiseren. Aangezien sommige koraalonderzoekers geen ervaring hebben met conventionele microbiologie, vragen ze daarom vaak om advies over hoe verder te gaan met een dergelijke aanpak.

Om te beginnen, vanaf elke gerichte bemonstering site, gebruik steriele flessen met schroefdoppen om 500 milliliter water te verzamelen in drievoud. Als monster verwerking gebeurt later, houd de flessen op vier graden Celsius. Gebruik een steriel tang en tang om koraalfragmenten van dezelfde bemonsteringsplaats van de watermonsters te snijden.

Spoel het monster koraal fragment met behulp van 20 milliliter steriele 3%zoutoplossing of kunstmatig zeewater om zich te ontdoen van de losgemaakte vrijlevende bacteriën van het zeewater. Plaats met behulp van tangen elk koraalfragment in een steriele container met een schroefdop met steriele zoutoplossing. Met behulp van steriele tangen en tangen weegt u vijf gram koraalfragmenten in steriele petrischaaltjes op weegschaal.

Breng de vijf gram koraal monster naar een steriele mortel en macereren met behulp van een steriele stamper. Breng met behulp van een steriele spatel het gemacereerde monster over in een steriele kweekkolf met 25 milliliter natriumchloridesteriele oplossing en 10 tot 15 glazen kralen van 2,5 millimeter. Gebruik 20 milliliter steriele zoutoplossing om de mortel in de buis te wassen om de maximale hoeveelheid maceraat terug te krijgen.

Om micro-organismen los te maken van verschillende koraalcompartimenten, houdt u de kolven gedurende 16 uur op 150 keer g bij de watertemperatuur van de bemonsteringsplaats. Om bacteriën te selecteren, voert u eerst seriële verdunningen uit tot 10 tot de negatieve negen in steriele zoutoplossing voor koraalmonsters en tot 10 tot de negatieve zes voor watermonsters. Pipetteverdunningen vijf keer op en neer voordat u de punt weggooit.

Dan vortex elk een. Vortex de monsters gedurende vijf seconden elke keer voor het uitvoeren van de volgende seriële verdunning. Pipette 100 microliter van elke verdunning op petrischaaltjes die 3% natriumchloride lysogeny bouillon agar medium bevatten en ze op plaat.

Broed de platen één tot drie dagen bij de doeltemperatuur, bijvoorbeeld 26 graden Celsius. Controleer de kentekens één keer per dag. Selecteer en isoleer de kolonies die verschillende groeimorfologieën op nieuwe platen presenteren met behulp van de streakplaattechniek.

Herhaal deze stap zo vaak als nodig is om zuivere kolonies groeien op de platen. Bewaar de isolaten op vier graden Celsius of in glycerol zoals beschreven in het manuscript. Om EE2 degradatie vermogen test uit te voeren, kies een enkele kolonie uit de verse platen en inenting in twee milliliter steriele LB medium in een buis.

In het geval dat het een glycerol voorraad, neem 10 microliter van glycerol bacteriële voorraad en streep op LB agar platen. Incubeer op 24 tot 28 graden Celsius 's nachts te hebben enkele kolonies groeien. Plaats de buis met LB medium geneigd onder constante agitatie op 150 keer g op 24 tot 28 graden Celsius 's nachts.

Na bacteriële groei, pellet de cellen door centrifugeren ze op 8,000 keer g gedurende acht minuten bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg. Om de resterende LB bouillon te wassen, voeg twee milliliter zout water toe om de cellen opnieuw op te hangen.

Herhaal de was twee keer om te garanderen dat er geen sporen van koolstofbron zijn. Inenting van de gewassen en geresuspendeerde cellen in minimale Bushnell Haas cultuur medium met EE2 als de enige koolstofbron. Beoordeel de groei van de bacterie door optische dichtheid op 600 nanometer en onze kolonievormende eenheden op LB agar medium na 16 tot 72 uur incubatie.

Ter voorbereiding van minimale media met een olie-water oplosbare fractie en een olie-water onoplosbare fractie als de enige koolstofbron, voeg 1-2% ruwe olie tot 500 milliliter steriel gedestilleerd water in een filterkolf met een klep op de bodem. Houd de kolf onder constante agitatie op 24 tot 28 graden Celsius op 150 keer g gedurende 48 uur. Plaats daarna de kolf op een stabiel oppervlak en wacht 10 tot 20 minuten om de oplosbare en onoplosbare fractie te scheiden.

Open vervolgens de onderste filterkolf om de oliewateroplosbare fractie over te brengen naar een nieuwe steriele kolf die de oliewateroplossbare fractie bespaart. Bereid dan twee flessen Bushnell Haas agar minimum medium. Autoclave het.

Combineer met de olie-water oplosbare fractie als de enige koolstofbron te maken 500 milliliter van agar medium. Doe hetzelfde met de olie-water onoplosbare fractie en breng ongeveer 25 milliliter van elk medium over op individuele petrischaaltjes. Om olieontschierende bacteriën te isoleren, eerder verdunde monsters en pipette 100 microliter van elke verdunning te isoleren op de petrischaaltjes die agar medium bevatten en ze op te nemen.

Vergeet niet om negatieve controles voor uw platen te houden. Broed de gerechten één tot drie dagen op de doeltemperatuur en herhaal de isolatieprocedures zoals voorheen. In dit protocol werden micro-organismen geïsoleerd uit verschillende waterbronnen en koraal nubbins presenteren putatieve BMC kenmerken en in staat om verschillende klassen van verontreinigingen te degraderen.

Met behulp van water monsters verzameld op een rioolwaterzuiveringsinstallatie verkregen uit Experimental Center of Environmental Sanitation van de Federale Universiteit van Rio de Janeiro, 33 bacteriële stammen in staat om EE2 te degraderen werden geïsoleerd. Bovendien, met behulp van de techniek voor het selecteren van olie-vernederende bacteriën, 20 stammen in staat om zowel olie-water oplosbare fractie en olie-water onoplosbare fractie te degraderen werden geïsoleerd. Putatieve BMC-kenmerken werden gescreend in micro-organismen, waaronder een stam die sterke antagonistische activiteit tegen de koraalpathogenie Vibrio cholerae lyticus, stammen in staat om ureum te degraderen, een goede catalase producent, en micro-organismen presenteren potentieel gunstige genen werden gevonden.

Met behulp van zowel bioremediatie en BMC inenting, was het mogelijk om koralen te voorspellen van de blootstelling aan olie effecten. Een olie bioremediator PBMC consortium geïsoleerd van het koraal werd ingeënt op koraal nubbins blootgesteld aan 1%-olie. Het toonde een beter bewaard gebleven fotochemische vermogen in vergelijking met het koraal gezondheid zonder inenting.

Laat monsters niet te lang op kamertemperatuur. Anders kan de microbiële gemeenschap veranderen en kunnen aan ziektegerelateerde microben anderen overwoekeren. Ruwe olie is giftig.

Zorg ervoor dat u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen gebruikt wanneer u met deze of andere verontreiniging werkt die u besluit te gebruiken. De techniek die op een innovatieve manier wordt geplaveid op het gebied van koraalherstel en bioremediatie in de oceaan kan mogelijk worden gebruikt om economische, ecologische en sociale effecten als gevolg van wereldwijde veranderingen tot een minimum te beperken.